Introduccin a la Biotecnologa Enrique Iez Pareja Instituto de Biotecnologa Universidad de Granada

1. Concepto y breve historia de la biotecnologa La biotecnologa, se puede definir como la aplicacin de organismos, componentes o sistemas biolgicos para la obtencin de bienes y servicios. Desde hace miles de aos, la humanidad ha venido realizando biotecnologa, si bien hasta la poca moderna, de un modo emprico, sin base cientfica: La domesticacin de plantas y animales ya comenz en el perodo Neoltico. Las civilizaciones Sumeria y Babilnica (6000 aos a.C.) ya conocan cmo elaborar cerveza. Los egipcios ya saban fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C. Antes de la escritura del libro del Gnesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recurdese que, segn la Biblia, No "sufri" (o disfrut) accidentalmente los efectos de la fermentacin espontnea del mosto de la uva (primera borrachera con vino). Otros procesos biotecnolgicos conocidos de modo emprico desde la antigedad: fabricacin de queso; cultivo de championes; alimentos y bebidas fermentadas: salsa de soja, yogur, etc; tratamiento de aguas residuales. Por supuesto, hasta la llegada de la moderna biologa, y en muchos casos hasta el siglo XIX, la base de muchos de estos procesos era desconocida. De hecho, solamente en el siglo XVIII cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es decir, usando el mtodo experimental, con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias errneas de que "la vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que an daran sus ltimos estertores casi al final del siglo XIX. Algunos hitos cientficos que sentaran la base de la biotecnologa contempornea: Los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII) describen los "animlculos" que estn fuera del alcance del ojo, si bien se tarda an un par de siglos en captar la importancia de estas minsculas criaturas. El descubrimiento de que las fermentaciones se deban a microorganismos se debe a la gigantesca figura de Louis Pasteur, en sus estudios realizados entre 1857 y 1876.

 En la ltima parte del siglo XIX existan ya instalaciones industriales para obtener etanol, cido actico, butanol y acetona, aprovechando fermentaciones al aire libre en condiciones no estriles A finales del siglo XIX, la "edad de oro de la bacteriologa" permite: mejoras importantes en las tcnicas microscpicas; el desarrollo de tcnicas aspticas, la esterilizacin y la pasteurizacin; la posibilidad de cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en medios de cultivo de laboratorio. A comienzos del siglo XX la bioqumica y la microbiologa convergen, estableciendo las bases enzimticas y metablicas de muchos procesos de fermentacin. Se desarrollan procedimientos industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.). Desde la dcada de 1940, las tcnicas de ingeniera qumica, aliadas a la microbiologa y a la bioqumica, permiten la produccin de antibiticos, cidos orgnicos, esteroides, polisacridos y vacunas. - La penicilina comenz a fabricarse en plena II Guerra Mundial, como resultado de avances importantes en tcnicas de esterilizacin a gran escala, mejora de las instalaciones de fermentacin (incluyendo la cuestin de la aireacin), cultivo del hongo, etc. A partir de entonces se disearon estrategias para mejorar genticamente las cepas microbianas industriales. - Las dcadas siguientes fueron de eclosin de produccin de antibiticos as como de transformaciones de esteroides y de cultivo de clulas animales para la produccin de vacunas antivirales. - Las dcadas de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos de obtencin de pequeos metabolitos como nuclesidos, aminocidos y vitaminas. - Los procesos de fermentacin experimentaron mejoras con las tcnicas de inmovilizacin de clulas y enzimas en soportes, y con la fermentacin continua para obtener protena de clulas sencillas (biomasa microbiana). - Polmeros microbianos como xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente, con apliaciones en el campo de la alimentacin (como aditivos). Pero incluso bien avanzado el siglo XX, cuando la Gentica haba resuelto el misterio de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que haba para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), seleccin de los individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes fsicos (rayos UV, rayos X) o qumicos, con ulterior bsqueda (seleccin o rastreo -screening) de alguna variante de inters (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc. Debemos esperar a la dcada de los 70 para que surja un conjunto de tcnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son tcnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseos previos y objetivos concretos (de ah el nombre popular de Ingeniera Gentica).

La Ingeniera Gentica (I.G.), mejor llamada tecnologa del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho. 1.1. La biotecnologa es intrnsecamente interdisciplinar La actual biotecnologa es una empresa intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunin de conceptos y metodologas procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto a la investigacin bsica como a la resolucin de problemas prcticos y la obtencin de bienes y servicios. Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnologa: Microbiologa; Bioqumica; Gentica; Biologa celular; Qumica; Ingeniera (bio)qumica; Ingeniera mecnica; Ciencia y Tecnologa de alimentos; Electrnica; Informtica El avance de la biotecnologa depender cada vez ms de esta colaboracin entre disciplinas, y en el uso de lenguajes y paradigmas comunes, as como en que cada tipo de especialista comprenda los logros y limitaciones de las otras ramas biotecnolgicas. 1.2. La biotecnologa presenta muchos campos de aplicacin Dejando aparte el hecho ya reseado de que las tcnicas biotecnolgicas (principalmente las genticas) encuentran su primera utilidad en el avance de las propias Ciencias de la Vida, desde el punto de vista de su aplicacin comercial e industrial, podemos decir que el campo de utilidad es inmenso: Aplicaciones teraputicas productos farmacuticos; antibiticos; vacunas; hormonas; terapias gnicas Diagnsticos diagnsticos para salud humana; diagnsticos para agricultura y ganadera; ensayos para calidad de alimentos; ensayos para calidad ambiental Alimentacin mejora de procesos tradicionales de obtencin de alimentos y bebidas; nuevos alimentos y bebidas; nutracuticos: alimentos con perfiles determinados de nutrientes, y para la mejora de la salud; aditivos alimentarios Medio ambiente tratamiento de residuos urbanos, agrcolas e industriales; biorremedio y biorreparacin; produccin de energa a partir de biomasa No podemos olvidar que muchas de las biotecnologas de las que nos beneficiamos son muy antiguas, y que en ellas se est logrando una fase de madurez auspiciada por los nuevos adelantos tcnicos (p. ej., la tecnologa de las fermentaciones). De hecho, muchas de las innovaciones que se estn produciendo no son tanto de nuevos productos cuanto de mejoras en los procesos. De cualquier

manera, ya estamos viendo la entrada de nuevos productos, en forma de nuevos frmacos y de plantas transgnicas con caractersticas novedosas. Dejando aparte las tecnologas de fabricacin de vacunas, la mayor parte de las otras reas biotecnolgicas requieren producir grandes cantidades de sustancias, del orden de kilogramos a toneladas, por lo que uno de los principales aspectos es el del "escalado" a esas grandes cantidades. Esto supone un gran reto a los ingenieros, ya que deben disear fermentadores de gran tamao, donde hay que controlar diversos parmetros, como pH, temperatura, oxgeno y otros gases, etc. La tecnologa de fermentacin cobr mpetu a partir de los aos 40 del siglo XX, cuando se comenzaron a fabricar antibiticos y otras molculas (cidos orgnicos, hormonas, enzimas, polisacridos, etc) por medio de microorganismos. Por lo tanto, aunque la atencin pblica se ha centrado en la moderna biotecnologa que usa tcnicas de ADN recombinante, no podemos olvidar que ya antes exista otra biotecnologa, que hoy sigue pujante, y que se puede beneficiar de los nuevos enfoques. Las biotecnologas, al usar catalizadores biolgicos que funcionan a bajas temperaturas y materias primas renovables, pueden contribuir a una economa ms "verde" (ecolgicamente sustentable). Se espera que puedan sustituir a procesos qumicos contaminantes. En los paises con condiciones climticas apropiadas (p.ej., en los trpicos), la produccin y uso de biomasa puede presentar muchas ventajas. La obtencin de energa de biomasa (p ej. residuos celulsicos) es una gran promesa para evitar la dependencia de combustibles fsiles en ciertas partes del mundo. Los altos costes (econmicos y ecolgicos) de las energas tradicionales pueden suponer un incentivo para buscar en la biotecnologa procesos de produccin ms rentables. Si adems, se incluyen en los procesos industriales los costes ecolgicos (hasta ahora tenidos como "externalidades" por la teora econmica tradicional), las alternativas de base biolgica pueden ser ms favorables que muchas contaminantes que se estn empleando. Los incentivos son an mayores en el caso de la produccin de sustancias de alto valor aadido, como diagnsticos y productos teraputicos, para las que las biotecnologas permiten abrir nuevos mercados muy atractivos, con productos destinados a mejorar la salud y calidad de vida de la poblacin. 1.3 Los tres ncleos de la biotecnologa Segn John Smith (1996), muchos procesos biotecnolgicos, especialmente los que se realizan en entornos cerrados industriales, tienen un triple ncleo: obtener el mejor catalizador biolgico para una funcin o proceso especfico obtener el mejor ambiente para la funcin de ese catalizador biolgico, mediante una serie de diseos tcnicos en los que es fundamental la ingeniera qumica

 procesamiento del material, consistente en separar y eventualmente purificar el material biolgico producido Veamos cada uno de estos tres componentes: 1 En la mayora de los casos, el catalizador biolgico son clulas vivas, sobre todo microorganismos. Por ello, uno de los pilares de la biotecnologa es precisamente la microbiologa (entendiendo esta en sentido amplio de biologa microbiana). Parte de lo que hemos aprendido sobre el manejo de microorganismos se puede aplicar, con modificaciones, al manejo de clulas de animales y plantas, que cada vez son ms importantes en la biotecnologa. Varias son las caractersticas que hacen atractivos a los microorganismos: - la biodiversidad microbiana es gigantesca; de hecho, solo hemos investigado una pequea parte de ella. Conforme los bilogos bsicos aprendan a recuperar ms biodiversidad y a conocerla, habr ms cepas disponibles con propiedades potencialmente tiles para los humanos - las capacidades metablicas de los microorganismos, como conjunto, son las ms amplias de todos los seres vivos. Los genomas microbianos esconden tesoros an ocultos, pero que se van revelando poco a poco, y ahora de modo ms rpido, una vez que se van complentando sus mapas y secuencias (actualmente existen varias decenas de genomas secuenciados). Las actividades biosintticas y degradativas de estos microorganismos presentan oportunidades extraordinarias para numerosas aplicaciones. - los microorganismos crecen rpidamente, y en muchos casos son fciles de manipular desde el punto de vista gentico. Esto hace que sea relativamente fcil usarlos como factoras microscpicas para obtener productos tiles en tiempos relativamente cortos. - Una parte esencial del aprovechamiento de los microorganismos reposa en nuestra capacidad para conservarlos viables durantes largos periodos de tiempo, y para que sus caractersticas tiles sean estables - en muchos casos, en lugar del microorganismo, se puede recurrir a aislar alguna o algunas de sus enzimas, y se las pueden poner a trabajar en condiciones ventajosas y rentables. 2 El segundo componente o ncleo de las biotecnologas estriba en el entorno industrial en que ponemos a funcionar las clulas o las enzimas. Esto nos lleva al concepto de biorreactor, un entorno cerrado y controlado para que nuestros catalizadores biolgicos hagan lo que queremos con la mxima eficiencia. En esta parte de la biotecnologa se requiere la colaboracin estrecha entre los bilogos y los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros qumicos. Se trata de disear biorreactores o fermentadores, especies de cubas cerradas diseadas para controlar diversos parmetros que condicionan la buena produccin: temperatura, aireacin, pH, etc. Finalmente, queda el rea quiz ms desconocida y compleja, el procesamiento de la biomasa o de la sustancia producidas: separacin de las clulas respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperacin eficiente del producto buscado, purificacin, etc.

A todo esto tenemos que aadir que un factor importantsimo en el desarrollo de la biotecnologa es la evaluacin de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos segn normativas nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnolgicos. Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan ms de lo que la evidencia cientfica sugiere, manteniendo en todo momento la preservacin de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepcin pblica de los riesgos y promesas de la biotecnologa. Por ejemplo, hoy en Europa la percepcin pblica ha logrado prcticamente una parada en las plantas transgnicas, a pesar de los informes cientficos que dicen que en la mayor parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. Habr que llegar a un dilogo racional entre los diversos actores (cientficos, empresas, consumidores, ecologistas, etc), para asegurar el correcto empleo de estas tecnologas, que por un lado no impida aplicaciones benficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente aquellos mbitos donde las dudas razonables hagan recomendables ms restricciones. El ideal sera permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presin que pueden esconder agendas polticas ocultas. 2. Algunos aspectos clave en las biotecnologas 2.1 Materias primas Las materias primas para alimentar los procesos biotecnolgicos industriales pueden ser muy variadas, pero el hecho de que en su mayora se trate de materias naturales biodegradables las hace muy atractivas. Lo ideal sera emplear subproductos de otras empresas, con lo que el proceso se abarata y se eliminan problemas ambientales: Se usan mucho desechos ricos en carbohidratos de ciertas industrias: - melazas procedentes del procesamiento de caa de azcar y remolacha azucarera. En Brasil usan la caa de azucar para fabricar bioalcohol (Gasohol) como biocombustible - desechos ricos en almidn: de granos como el maz, de tubrculos como la tapioca o la patata. El problema aqu es que el almidn debe primero ser degradado a monosacridos u oligosacridos antes de la fermentacin industrial, pero ciertos procesos biotecnolgicos son ya competitivos, como la produccin de jarabes ricos en glucosa o fructosa, usados como endulzantes en alimentos y bebidas. En Suecia eliminan los desechos contaminantes del procesamiento de la patata con un mtodo a base de levaduras, que produce biomasa potencialmente valiosa. Existe un gran inters en usar como materia prima desechos agrcolas e industriales ricos en celulosa. Desgraciadamente, la celulosa es compleja, y su asociacin con la lignina hace que an no existan procesos industriales operativos. Pero si en un futuro logramos superar las barreras tcnicas, tendremos una materia prima abundante, y podremos aprovecharla al tiempo que evitamos problemas ambientales. De hecho, la lignocelulosa es la materia renovable ms abundante de la biosfera, y la esperanza es poder aprovecharla en un prximo futuro.

 De la misma manera, sera estupendo poder aprovechar otros desechos de las actividades humanas como materias primas para los microorganismos industriales, elimando as problemas de polucin ambiental. La idea sera acoplar una industria que crea efluentes contaminantes con una bioindustria que pueda aprovechar los residuos de la primera, creando productos tiles y riqueza adicional, y sin que los costes totales sean elevados (aunque ya el hecho de eliminar una fuente de contaminacin de puede considerar como algo positivo) - ya se usan desechos procedentes de las industrias papeleras - igualmente se aprovechan los lactosueros (residuos ricos en lactosa) procedentes de las queseras El empleo de metanol puede ser til en ciertos procesos, ya que el metanol es "limpio" y se puede obtener fcilmente a partir del abundante metano. En un futuro podra ser rentable para fabricar alimentos para animales. 2.2 Mejora gentica: Ingeniera gentica Tradicionalmente, la manera de mejorar genticamente los organismos industriales reposaba en la induccin de mutaciones (con mutgenos), seguida de seleccin o rastreo de los mejores mutantes. La bsqueda de mejoras en la produccin de protenas (incluyendo enzimas) es ms fcil que la de la produccin de otras molculas (polisacridos, antibiticos, aminocidos, etc), porque cada protena depende normalmente de un solo gen, mientras que los metabolitos se sintetizan por rutas complejas donde intervienen varias enzimas, cada una sintetizada por un gen diferente, y con regulaciones a menudo complicadas. - en los protocolos de seleccin, se suele aplicar una presin selectiva que favorece el crecimiento del tipo de mutantes buscados, en detrimento del resto de microorganismos - en los protocolos de rastreo (screening, en ingls) crecen todos los microorganismos, pero se pueden identificar las variantes deseadas sobre la base de que presentan ciertas caractersticas que las diferencian de las dems la mezcla de genomas mediante fenmenos de sexualidad, o parasexualidad (las bacterias no tienen sexo, pero algunas tienen fenmenos parasexuales como la conjugacin, que se pueden aprovechar para transferir material gentico de unas cepas a otras). Algunos inconvenientes de estas tcnicas tradicionales de mejora: los programas de mejora suelen ser muy largos y tediosos, y a menudo no dan los resultados deseados el efecto principal de la mutagnesis es originar mutaciones aleatorias en el organismo, la mayor parte de las cuales son negativas para su supervivencia, o empeoran algunas de sus caractersticas originales. Raramente se dan mutaciones que conducen a la aparicin de propiedades nuevas positivas, y en todo caso, el proceso de su bsqueda es a menudo muy complicado. Adems,

incluso cuando se selecciona un tipo estimado adecuado, a menudo presenta otras mutaciones que son negativas (p. ej., haciendo que crezca ms lentamente, o que sea ms sensible a factores ambientales) lo anterior obliga a trasladar la mutacin "positiva" a un fondo gentico distinto (normalmente una cepa silvestre o que ya haba sido seleccionada como buena en un programa anterior). Esto complica y alarga la mejora gentica, e incluso en algunos organismos no se logra la adecuada introgresin de ese rasgo en la cepa deseada. frecuentemente los organismos seleccionados para la produccin acumulan mutaciones desconocidas que no se caracterizan muchos microorganismos industriales carecen de ciclos sexuales, lo que dificulta e incluso impide transferir rasgos tiles de modo sencillo, dejando como nica alternativa la mutagnesis y seleccin en las especies dotadas de sexualidad, la mejora por recombinacin gentica est limitada al cruce entre razas de la misma especie, o de especies compatibles Pero la llegada de la Ingeniera gentica ha supuesto la superacin de muchos problemas que tena la mejora clsica, sobre todo en aquellos microorganismos que carecen de sexualidad. Adems, permite mejoras menos aleatorias y ms precisas, transfiriendo genes de cualquier origen al organismo donde queremos expresarlos. 2.2.1 Antecedentes y surgimiento de la Ingeniera Gentica Aunque la Gentica es la base de toda la Biologa, su desarrollo como ciencia es de los ms tardos. Veamos esquemticamente algunos eventos esenciales para entender el surgimiento de la tecnologa del ADN recombinante: A partir de 1865, Mendel establece las bases de la gentica. En sus famosos experimentos con el guisante, descubri el modo de transmisin de ciertos caracteres desde una generacin a las siguientes, y su "mezcla" en el aporte materno y paterno. Los hallazgos de Mendel permanecieron en el olvido hasta 1900, cuando sus leyes son redescubiertas por Correns, De Vries y Tschermarck. En 1909 se acua el trmino "gen" (o gene) para referirse a la entidad hipottica responsable de los rasgos observables. En 1913 se obtiene el primer mapa gentico, con 6 genes. En 1920 Morgan y Muller establecen su Teora cromosmica de la herencia: los genes, localizados en los cromosomas, son las autnticas unidades de la herencia, tanto unidades de variacin como unidades de transmisin. Es decir, la herencia presenta un doble aspecto: el de la transmisin de los caracteres (estudiado por las leyes de Mendel) y el de la expresin, es decir, el genotipo (conjunto de genes) determina el fenotipo (rasgos observables).

 Pero la naturaleza del material gentico fue objeto de polmicas durante mucho tiempo, hasta que entre los aos 40 y primeros 50 una serie de autores (Avery y colaboradores, Hershey y Chase, etc.) establecen firmemente que el material de la herencia reside en el cido desoxirribonucleico (ADN; DNA). Por esos mismos aos, Beadle y Tatum proponen la teora conocida como "un gen-una enzima", que correlaciona cada unidad gentica con el producto de su expresin, es decir cada gen se expresa como una determinada protena. Desde entonces, se produce la definitiva unin de la gentica con la bioqumica. En 1945, Schrdinger escribe su influyente libro Qu es la vida?, una visionaria fusin de la Teora de la Informacin con la Biologa, que iba a contribuir poderosamente a la naciente biologa molecular, inspirando a profesionales procedentes del campo de las ciencias qumico-fsicas. En los 40 y 50 se produce, en efecto, un "desembarco" de fsicos y cristalgrafos en el abordaje de cuestiones biolgicas. Es la poca del florecimiento de tcnicas como la difraccin de rayos X, la ultracentrifugacin y la cromatografa. En 1951 un joven bilogo estadounidense, James Watson, llega al laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge, para pasar una estada postdoctoral. All se une al ingls Francis Crick, y 18 meses ms tarde (primavera de 1953) publican en Nature su modelo tridimensional de la doble hlice del ADN. - El modelo explicaba simultneamente la herencia y la expresin del material gentico. ste consiste en un lenguaje basado en cuatro "letras", las cuatro bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). - Se abra en principio una nueva manera de estudiar la base gentica de los seres vivos: de dentro (genotipo) a fuera (fenotipo), al revs de lo que se vena haciendo desde Mendel (la observacin de la transmisin del genotipo permita inferencias sobre el genotipo). A continuacin se abre un decenio llamado a menudo la "Edad de Oro de la Biologa Molecular", que pone las bases de la comprensin de los procesos bsicos de la herencia y de la expresin gentica: - Replicacin del ADN: papeles de la ADN-polimerasa, los cebadores (primers), el molde. - Transcripcin: una de las cadenas de ADN es copiada por la ARN-polimerasa hasta un ARN mensajero - El ARN mensajero es ledo (traducido) por los ribosomas para dar una protena. De este modo, el mensaje lineal del ADN se convierte en el mensaje tridimensional de la configuracin de la protena - El "Dogma Central" de la Biologa Molecular: la informacin fluye unidireccionalmente en sentido ADN ARN protena.

- El desciframiento del cdigo gentico: el lenguaje del ADN consta de "palabras" de tres letras (nucletidos), llamadas codones. Cada codn tiene un equivalente en el lenguaje de la protena, significando uno de los 20 aminocidos. El cdigo gentico est "degenerado", es decir, tiene cierto grado de redundancia: algunos de los aminocidos pueden venir determinados por ms de un codn. Existen 64 codones, de los cuales tres carecen de sentido: no tienen equivalente aminocido, y en vez, sirven como seales de parada de la traduccin del mensajero. - Jacob y Monod estudian en profundidad un sistema de expresin y regulacin gentica en la bacteria Escherichia coli: desarrollan su concepto del opern, como unidad de expresin y regulacin a nivel de transcripcin. Tras la "Edad de Oro", empiezan a surgir algunas sorpresas que desafiaban ideas fuertemente establecidas: Los genes eucariticos son "discontinuos": estn compuestos por una alternancia de segmentos que entrarn a formar parte del ARNm maduro (exones) y segmentos que se eliminan (intrones). Este proceso de maduracin del ARN se denomina corte-y-empalme (splicing). Algunos virus (retrovirus) poseen material gentico de ARN, que es convertido a ADN por una enzima llamada reversotranscriptasa. Se confirman los tempranos (y semiolvidados) estudios de Barbara McClinctock: hay segmentos del material gentico capaces de moverse de un lado a otro de los genomas (elementos genticos transponibles). El material gentico es ms dinmico y cambiante de lo que se haba sospechado. Pero aparte de estos avances bsicos, a finales de los aos 60, segua pendiente de plasmacin una de las expectativas abiertas por el descubrimiento de la estructura del ADN: cmo llegar a "tocar" el ADN?, cmo estudiar cada gen por separado, aislndolo fsicamente de los dems?, cmo determinar su secuencia de bases? Durante mucho tiempo, lo nico que se poda secuenciar era ARN. Desde 1964 se secuencian algunos ARN transferentes, que constan de 75 a 85 bases. Los mtodos se fueron perfeccionando, de modo que en 1975 se pudo conocer la secuencia de un minsculo genoma: el ARN del virus bacteriano FiX-174 (unos 4000 nucletidos). Sin embargo, para estudiar genes haba que ser capaces de aislarlos uno a uno a partir del cromosoma, que es demasiado grande para su manipulacin inmediata. Pero no se haban descubierto nucleasas especficas capaces de cortar en puntos determinados del ADN para generar fragmentos discretos y homogneos. Ante este estado de cosas, algunos lderes de la Edad de Oro, consideraron que los problemas bsicos de la biologa molecular estaban resueltos, y decidieron migrar a otras reas de conocimiento (biologa del desarrollo, neurobiologa, etc). Como tantas veces ocurre en la ciencia, fue una humilde lnea de investigacin bsica la que abri definitivamente el camino a la manipulacin del ADN:

 En 1953 se descubri el fenmeno llamado de restriccin: ciertos fagos (virus bacterianos) que parasitan a E. coli podan desarrollarse en ciertas cepas de esta bacteria, pero no podan hacerlo en otras (se dice que estn "restringidos" en determinadas cepas). A finales de los 60, Werner Arber, en Basilea, descubre las enzimas de restriccin responsables de ese fenmeno: la cepa de bacteria restrictiva produce unas endonucleasas ("enzimas de restriccin, o restrictasas") que escinden el ADN del fago crecido en otra cepa diferente. Esas primeras enzimas de restriccin eran inespecficas en cuanto al sitio del ADN donde cortaban, pero en 1970 Hamilton Smith, en Baltimore, descubre un nuevo tipo de enzima de restriccin totalmente especfica: capaz de reconocer una determinada secuencia de ADN, de unos pocos pares de bases, y de cortar en ambas cadenas en lugares concretos. - Algunas restrictasas reconocen como secuencia diana un trecho de 4 pares de bases. - Otras restrictasas reconocen secuencias de 6 pares de bases. - Se han descubierto restrictasas que cortan tras reconocer secuencias ms largas. - Las dianas de la mayora de las restrictasas de este tipo son secuencias palindrmicas, es decir, "capicas" Ejemplo:

5'- G / GAACC -3' 3'- CCTTG / G -5'

Muchas de estas restrictasas cortan en cada cadena en lugares separados del centro geomtrico de la diana (como en el ejemplo anterior), de modo que generan extremos protuberantes. Los extremos protuberantes de distintos fragmentos de ADN generados con la misma restrictasa (incluso de fragmentos de especies distintas), tienen tendencia, al mezclarlos, a emparejarse entre s por puentes de hidrgeno (siguiendo las reglas de emparejamiento A-T y G-C). Si ahora aadimos la enzima ADN-ligasa a la mezcla de fragmentos de ADN de orgenes diferentes, se repararn los enlaces fosfodisteres. Esto es lo que realizaron por primera vez Mertz y Davis en 1972, y enseguida se dan cuenta de que ello poda constituir la base para la produccin de molculas recombinantes in vitro, con material gentico de diferentes especies. Pero este ADN recombinante, generado en el tubo de ensayo, es inerte, no es ms que una macromolcula hbrida que por s sola no hace nada. Si queremos que el ADN recombinante haga algo, hay que introducirlo en clulas vivas que sean capaces de expresar su informacin gentica. Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniera Gentica: la formacin in vitro de nuevas combinaciones de material gentico, por medio de la insercin de un ADN de inters en un vehculo

gentico (vector), de modo que tras su introduccin en un organismo hospedero el ADN hbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse. 2.2.2 La receta bsica de un experimento de Ingeniera Gentica Vamos a ilustrar el concepto de la ingeniera gentica con el caso bastante fcil de lograr bacterias que hospeden nuevas combinaciones de ADN: Partimos de ADN que queremos aislar y estudiar: vamos a llamarlo ADN pasajero Por otro lado, necesitamos un vehculo gentico para transportar y replicar ese ADN: lo llamamos vector. Los vectores son igualmente molculas de ADN con capacidad de replicarse por s mismos o de insertarse una vez que se introducen en el organismo adecuado. He aqu una lista de lo que debe poseer idealmente un vector gentico: - Capacidad de replicacin autnoma (es decir, se trata de un replicn), o de integracin en el genoma del hospedero. - Marcadores seleccionables: se trata de genes que confieren algn rasgo que se puede rastrear o seleccionar fcilmente en laboratorio. Unos de los ms usados son los genes que confieren resistencia a algn antibitico. - Dianas nicas para al menos una enzima de restriccin. En los modernos vectores se ha introducido un trecho de ADN, denominado polilinker, provisto de varias dianas nicas para diferentes enzimas de restriccin, de modo que en cada experimento se pueda elegir la que ms convenga. Finalmente, contamos con el organismo anfitrin o husped. En los primeros tiempos de la I.G. se manipulaban casi exclusivamente bacterias, pero hoy es posible modificar animales y plantas. As, pues, el "retrato robot" de un experimento de I.G. podra ser como sigue: 1 Se corta por separado el ADN del organismo a estudiar y el ADN del vector con la misma restrictasa, de modo que se generan extremos compatibles entre s (mutuamente cohesivos). Se juntan ambos ADNs y se les aade ADN-ligasa: de esta forma, las uniones entre ADN pasajero y ADN del vector se sellan covalentemente, generndose molculas hbridas (recombinantes). Ahora hay que introducir las molculas generadas en el organismos husped. En el caso de bacterias se recurre a una tcnica sencilla denominada transformacin, que permite la entrada del ADN a travs de las envueltas del microorganismo. Finalmente, hay que localizar las bacterias que han captado y han establecido establemente las molculas hbridas. A menudo este es el paso ms laborioso, pero el hecho de que el vector posea uno o varios genes de resistencia favorece al menos la eliminacin de las bacterias que no han recibido ADN del vector: basta aadir al medio de cultivo el antibitico para el que el vector

confiere resistencia. Para localizar los transformantes recombinantes, muchos vectores incorporar un gen marcador que produce alguna sustancia coloreada. Si insertamos el gen a aislar dentro de ese marcador, lo rompemos, por lo que las colonias bacterianas no producirn la sustancia coloreada, sino que permanecen incoloras o blancas. 5 El resultado del experimento es la obtencin de al menos una colonia (clon) de bacterias que portan la combinacin buscada de vector con el inserto de ADN pasajero. Se dice entonces que hemos clonado (=aislado) dicho ADN. El primer experimento de este tipo lo realizaron en 1973 Stanley Cohen y Herbert Boyer en la Universidad de California. Se vio que era factible hacer toda clase de experimentos en los que se recombina ADN de organismos totalmente diferentes (bacterias, plantas, animales). 2.2.3 Caracterizacin del ADN clonado Una vez que se ha clonado un gen o trozo de ADN, hay que caracterizarlo lo ms detalladamente posible, lo que significa establecer la secuencia de bases del ADN. Lo primero es realizar un "mapa fsico" tomando muestras independientes del ADN clonado que son sometidas a distintas enzimas o combinaciones de enzimas de restriccin. Los fragmentos resultantes se separan por tamaos y se va determinando un mapa donde se van colocando las localizaciones relativas de las distintas dianas de las restrictasas. A partir de los fragmentos del trozo original es posible ir adjudicando funciones a cada uno, lo cual va generando en paralelo un "mapa gentico". El ltimo nivel (el ms detallado) de caracterizacin fsica es la misma secuenciacin del ADN. 2.2.4 Otros mtodos bsicos 2.2.4.1 Sntesis qumica de ADN Actualmente existen mquinas programables para sintetizar rpidamente secuencias determinadas de ms de 100 nucletidos. Se usan a menudo para generar sondas moleculares en la bsqueda y caracterizacin de determinados segmentos de ADN, y sobre todo para producir los cebadores usados en la reaccin en cadena de la polimerasa. 2.2.4.2 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) No cabe ninguna duda de que la tcnica ms revolucionaria de los ltimos 15 aos ha sido la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniera gentica y a toda la biologa molecular. Fue inventada por Kary Mullis a mediados de los aos 80. Como ya sabemos, muchas de las tcnicas clsicas de la Ingeniera gentica estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cmo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN concreto "perdido" en la inmensidad del genoma. Sin embargo, esas tcnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en

principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonacin en un organismo husped. Esencialmente la tcnica permite la amplificacin selectiva de cualquier trecho de ADN, supuesto que se conocen las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una tcnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificacin selectiva". El principio que sustenta la PCR El ADN de cadena doble que se quiere amplificar se calienta casi hasta ebullicin, de modo que se separan las dos cadenas, las cuales van a servir de moldes ms adelante. Se aaden dos cebadores (normalmente fabricados por sntesis qumica; ver apartado 2.2.4.1). Cada cebador es un corto oligonucletido, correspondiente a una de las secuencias que flanquean el trozo a amplificar. Al bajar la temperatura, cada cebador se empareja por puentes de hidrgeno con la secuencia complementaria de una de las cadenas del molde, y obligar a la ADN-polimerasa a comenzar la copia de esa cadena molde complementaria (por supuesto, en sentido 5'->3') Al aadir la ADN-polimerasa y los 4 tipos de desoxinuclesido-trifosfato (dNTPs), se produce la sntesis de las respectivas cadenas complementarias de cada molde, a partir de los respectivos cebadores. Al final de esta fase, tenemos el doble de cadenas de ADN de doble cadena respecto a las de partida. Luego la mezcla se vuelve a calentar hasta casi ebullicin, con lo que se vuelven a separar la cadenas, que en su forma de cadenas sencillas sirven para iniciar otro ciclo idntico al anterior, al final del cual tendremos el cudruple de ADN. Si repetimos el protocolo n ciclos, el resultado ser 2n copias a partir de las originales. El ADN a usar no precisa ser purificado. La cantidad de partida puede ser minscula (<1 microgramo de ADN genmico). De hecho se puede amplificar a partir de una sola molcula de molde. El empleo de ADN-polimerasas termorresistentes, como la Taq (procedente de la bacteria Thermus aquaticus descubierta junto a los giseres de Yellowstone), evita tener que aadir polimerasa nueva en cada ciclo de amplificacin. La tcnica bsica de la PCR. El experimento suele realizarse segn este orden: 1 En un tubito se mezcla el ADN molde, los dos cebadores (oligonucletidos), los cuatro dNTPs y la ADN-polimerasa termorresistente. Se calienta a 94C durante 5 min, con lo que se separan las cadenas del ADN molde a amplificar, generndose las correspondientes cadenas sencillas.

Se baja la temperatura en torno a los 60C, de modo que cada cebador se empareja con el extremo correspondiente de una de las cadenas del molde. Se dice que ahora tenemos los moldes cebados. Se sube la temperatura hasta 72C (la ptima de funcionamiento de la Taq), y se deja durante 5 min, tiempo durante el que se est produciendo la sntesis in vitro de las cadenas complementarias de cada hebra molde.

Se sube la temperatura a 94C durante 20 segundos, suficientes para separar la cadena recin sintetizada respecto del molde original.

Las cadenas sencillas generadas entran ahora en un nuevo ciclo (pasos 1 al 5), y as sucesivamente, de modo que tras 30-60 ciclos obtenemos una amplificacin del ADN original de millones o miles de millones de veces.

Todo este proceso se realiza en unos aparatos automticos llamados termocicladores, en los que se pueden fijar los parmetros de tiempos y temperaturas de cada paso del ciclo. El mtodo de PCR fue patentado en 1987, y en principio fue comercializado por la empresa Cetus, si bien desde 1991 los derechos fueron adquiridos por Hoffman-La Roche y Perkin Elmer. Las ganancias de este mtodo tan universalmente empleado son astronmicas. Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prcticamente ilimitadas: simplifica sobremanera muchos experimentos de I.G; permite muchos estudios de expresin gentica; secuenciacin directa de secuencias amplificadas; deteccin de mutaciones; seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades; diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas; en ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin de paternidad, pruebas periciales en criminalstica; en arqueologa y paleontologa

http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/biotecgeneral.htm Enrique Iez.