MTODOS CLSICOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS.

GUIN DE PRCTICAS
AGUSTN LEN ALONSO-CORTS TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS

Normas Generales Preparacin y manejo del material de laboratorio Recuento de aerobios mesfilos Recuento de enterobacterias totales Recuento de coliformes Recuento de estreptococos fecales Identificacin de enterobacterias. Tira API 20 E Tinciones

BIBLIOGRAFA

NORMAS GENERALES PARA EL ALUMNO

1.- Cada alumno asistir dentro del grupo y puesto de trabajo asignado, sin posibilidad de cambio, pues cada puesto dispone de material en relacin con el nmero de alumnos en l comprendidos. 2.- Las prcticas comenzarn a las horas indicadas en la convocatoria previa. Sea puntual en beneficio de todos. 3.- El alumno vendr provisto de la bata correspondiente, as como de un rotulador marcador en vidrio y mechero. 4.- El material de que dispone debe ser tratado con sumo cuidado. Es costoso y va a ser utilizado tambin por sus compaeros. 5.-Va a manejar, en muchas ocasiones, productos contaminados por microorganismos patgenos, peligrosos para Vd. y para los dems. Evite el peligro de contaminacin, realizando el trabajo atentamente y de la forma que se indica en el manual. 6.- No se puede fumar en la zona de prcticas. 7.- Deje todo el material en el mismo orden que Vd. lo encontr. 8.- Al terminar su tarea, debe lavarse las manos antes de salir del laboratorio. PREPARACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

Es de gran importancia en Microbiologa la limpieza de todo el material que se va a utilizar, debido a los problemas de contaminacin que la suciedad pueda ocasionar. Todo el material sucio especialmente las placas de Petri desechables ya utilizadas, deben recogerse en recipientes o bolsas adecuadas para evitar la contaminacin del laboratorio, para lo cual deben ser esterilizadas en el autoclave durante 20 minutos a 121C de temperatura. El material de vidrio, plstico o metal utilizado debe lavarse con detergente, enjuagado con agua destilada y secado a temperatura ambiente. Los cubre y portaobjetos una vez que han sido lavados adecuadamente, se sumergen en mezcla crmica durante 24-28 horas. Transcurrido este tiempo, se lavan con agua destilada y se secan para su posterior uso. Las pipetas de vidrio reutilizables deben limpiarse y desinfectarse utilizando un lavador de pipetas donde previamente hayamos aadido una solucin detergente, una vez enjuagadas se disponen en paquetes de varias unidades envueltos de papel aluminio y se esterilizan en un autoclave u horno. Para la limpieza de los tubos de ensayo, primero se desprende el medio que contienen ayudndose de un escobilln y a continuacin se lavan con agua y detergente, se enjuagan con agua destilada y se dejan secar en posicin invertida. Cuando se decide su utilizacin, se llenan con el medio de cultivo y se esterilizan en el autoclave. Antes de introducirlos, se tapan y se colocan en cestillos apropiados.

Los frascos Erlenmeyer, matraces, etc., se taponan de igual forma que los tubos de ensayo, con algodn graso y se esterilizan, tomando la precaucin de colocarles previamente en una bolsa de plstico autoclavable para evitar que el posible derramamiento de su contenido durante el tratamiento trmico ensucie o tapone los conductos de nuestro autoclave. Las operaciones como toma de muestra, siembras, resiembras, diluciones, aislamientos, etc., se deben hacer de manera que se evite toda contaminacin, trabajando en la proximidad del mechero o en cabina de flujo laminar. Las asas y agujas que se utilizan para siembras e inoculaciones deben esterilizarse antes y despus de su uso, calentndolos a la llama del mechero hasta el rojo. Para evitar salpicaduras del material, el instrumento se va introduciendo gradualmente en la llama. Operaciones de manipulacin de tubos y placas: En general Las placas Petri, en el momento de su uso se debern entreabrir el tiempo mnimo requerido para la manipulacin a realizar, realizndose sta siempre bajo la llama del mechero.

Las operaciones que se repetirn con frecuencia en el laboratorio son: Pipeteado tubo-placa. Pipeteado tubo-tubo.

Preparacin de un Medio de Cultivo Los medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio para el crecimiento de microorganismos pueden elaborarse utilizando los productos qumicos descritos en cualquier catlogo o libro especializado con la ayuda de una balanza analtica, o bien ser encargados en su forma deshidratada a cualquiera de las casas proveedoras (DIFCO, API, OXOID, etc.). Es obvio que esta ltima alternativa resulta ms cara, pero tambin es ms cmoda. Una vez que tenemos el medio, para su preparacin, debemos seguir los pasos indicados en la etiqueta, los cuales consisten bsicamente en hidratar una cierta cantidad en condiciones de calentamiento y agitacin, operacin que precisa de balanza y placa calefactora con agitacin. Una vez elaborado, se dosifica en tubos o matraces (segn precise el anlisis), los cuales taparemos con un algodn, colocaremos en una o varias bolsas autoclavables y esterilizaremos. Una vez esterilizados procederemos de dos formas distintas segn la finalidad del mismo: Dosificacin en Placas de Petri y posterior almacenamiento en frigorfico, si no van a ser utilizadas inmediatamente. O bien, enfriamiento en bao de agua a unos 40C para una posterior siembra en masa.

Obtencin de un banco de diluciones Mtodo que consiste en preparar diluciones de una muestra de alimento para que el recuento o aislamiento de colonias posterior a la siembra, resulte eficaz. Material Alimento Bolsa de stomacher Stomacher Tubos de ensayo Agitador de tubos Mechero Pipetas estriles y pipeteador Caldo de triptona o agua destilada estril

Tcnica 1.- Tomar 10 g del alimento. Pasarlo junto a 90 ml de caldo de triptona (solucin isotnica) o agua destilada en una bolsa de stomacher. Homogeneizar el conjunto en el Stomacher. El resultado es una dilucin 1:10. 2.- Tomar 1 ml. de la dilucin 1:10 y pasarlo a un tubo al que previamente se le ha aadido 9 ml. de caldo o agua destilada. Homogeneizar la solucin en un agitador de tubos. La dilucin que hay ahora en este tubo es 1:100 3.- De manera anloga podramos conseguir las diluciones 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000 etc Nota: Todos los tubos se marcarn con rotulador segn la dilucin que posean.

Siembra en masa Tcnica de siembra fundamental para la obtencin de los recuentos microbianos caractersticos de las principales tcnicas clsicas de anlisis microbiolgicos. Material

Banco de diluciones de un alimento Pipetas y pipeteador Placas de Petri Matraces con agar fundido en bao mara Tcnica

Tomar 1 ml de una solucin y vertirlo en una placa Petri vaca. Vertir en la misma placa unos 15 ml del agar fundido. Mezclar el conjunto con suave agitacin y dejar solidificar. Las placas as sembradas ya estn listas para su incubacin en estufa. Para evitar condensaciones de agua sobre la superficie del agar que puedan dispersar las colonias superficiales y falsear el recuento, se suele ubicar las placas en la estufa, de forma invertida.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS El anlisis microbiolgico objeto de la prctica permitir estimar la flora total que porta el alimento, la cual reflejar su calidad higinico-sanitaria. Material Pipetas estriles de 1 ml y pipeteador Placas Petri Banco de diluciones del alimento. Bao Mara Mechero Medio de cultivo agar Plate Count (PCA) Tcnica - Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recin esterilizado (PCA), en un bao Mara y esperar que la temperatura descienda hasta unos 35C. - Preparar un banco de diluciones del alimento problema y realizar una siembra en masa por duplicado de cada una de las diluciones. - Homogeneizar, dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 30C durante 48 -72 horas. - Transcurrido este tiempo, elegir una dilucin (asociada a un crecimiento de un nmero de colonias comprendido entre 30 y 300 aproximadamente) y realizar el recuento. Multiplicando este valor por el factor de dilucin obtendremos el resultado.

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS TOTALES El anlisis microbiolgico de las Enterobacterias permitir predecir el grado de contaminacin fecal que tiene un alimento. Para su anlisis se utilizar la tcnica de recuento en medio slido. Material Pipetas estriles de 1 ml y pipeteador Placas Petri estriles Estufa de cultivo Medio de cultivo Agar-Cristal Violeta-Rojo Neutro-Bilis-Glucosa (VRBG - Oxoid) Tcnica - Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recin esterilizado (VRBG) en un bao Mara y esperar que la temperatura descienda hasta unos 40C. - Preparar un banco de diluciones del alimento problema. - Realizar una siembra en masa por duplicado de las diluciones preparadas, mezclando en placas Petri, 1 ml de cada una de las diluciones decimales con, aproximadamente, 15 ml del medio VRBG fundido. - Una vez que ha solidificado el medio, se recubre con una nueva capa de agar. - Dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 37C durante 18-24 horas. - Una vez transcurrido este tiempo se cuentan las colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo-violeta.

RECUENTO DE COLIFORMES El grupo formado por las denominadas coliformes comprende aquellas Enterobacterias capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas. Niveles de coliformes altos en un alimento indican manipulacin y elaboracin deficientes. Para alimentos no procesados o con tratamiento insuficiente, es preferible el anlisis del grado de contaminacin fecal mediante la evaluacin de los niveles de coliformes fecales que mediante el anlisis de Enterobacteriaceas totales. Su anlisis se realizar utilizando medio lquido.

Material Banco de diluciones del alimento problema (1:10, 1:100 y 1:1000). Tubos de ensayo con 10 ml de Caldo lactosa bilis verde brillante. Tabla NMP Campana Durham Estufa incubadora Placas de Petri Pipetas estriles de 1 ml y pipeteador Medio de cultivo lquido Caldo lactosa bilis verde brillante Tcnica - Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilucin respectivamente. Cada tubo ir provisto de una campana Durham para la recogida de gases. - Incubar todos los tubos a 37 C durante 24 - 48 horas. Observar los tubos y tomar nota de los que tengan desprendimiento de gases. - Con ayuda de la tabla NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el nmero de coliformes por gramo o ml de alimento.

RECUENTO DE ESTREPTOCOCOS FECALES Los estreptococos son considerados indicadores de la contaminacin fecal de agua y alimentos. Por ser muy resistentes a condiciones de congelacin o desecacin se consideran buenos indicadores para valorar, las condiciones higinicas y de conservacin de alimentos congelados o desecados. Para su determinacin se utilizarn caldos de cultivo lquidos. Material. Serie de diluciones seriadas del alimento problema (1:10, 1:100 y 1:1000). Tubos de ensayo con caldo K.A.A Tablas NMP.

Tcnica Prueba presuntiva. - Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilucin respectivamente. - Incubar a 37C durante 24 horas. - Con ayuda de las tablas NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el nmero de estreptococos por gramo o ml de alimento (los tubos que presenten ennegrecimiento se considerarn como positivos)

METODOS RAPIDOS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS. TIRAS API-20E.

El sistema API-20E para enterobacterias es una tira con 20 cpsulas que permite buscar 22 caracteres bioqumicos para identificar enterobacterias al cabo de 18-24 horas.

Material

Kit API-20E Enterobacterias Pipetas Pasteur Aceite de parafina esteril Tubos con 5 ml. de agua estril Solucin co el microorganismo problema

Tcnica

- Hacer una suspensin en 5 ml de agua estril a partir de una sola colonia, previamente separada en medio de aislamiento.

- Repartir aproximadamente 5 ml de agua en los alvolos de la cmara de incubacin para dar el grado de humedad necesario.

- Sacar una tira API-20E y colocarla sobre la mencionada cmara.

- Aadir la suspensin bacteriana con pipeta Pasteur, con la punta apoyada sobre lado de cada cpula y evitando que se formen burbujas de aire.

- Para los caracteres CIT, VP y GEL, llenar tubo y cpula. Para los caracteres restantes llenar solo el tubo.

- En los caracteres ADH, LDC, ODC URE y H2S, llenar las cpulas con aceite de parafina estril, con el fin de obtener condiciones de anaerobiosis.

- Cerrar la cmara con la tapa, e incubar a 35-37C durante18-24 h.

- Tras la incubacin, realizar la lectura de las galeras, apuntando los resultados en la hoja de resultados.

- Si la Glucosa es positiva y/o 3 o ms test son positivos, efectuar el revelado de los test que requieren reactivos (TDA, IND, VP, NITRATOS y NITRITOS).

- El cdigo obtenido en la hoja de resultados, nos servir para identificar el microorganismo correspondiente a la cepa analizada.

TINCIONES

1.- Material Portaobjetos Asa Pinzas portaobjetos Suspensin de microorganismos Mechero Microscopio 2.- Productos Violeta de Genciana Fuchsina bsica o Safranina Azul de metileno Reactivo de Lugol Verde de malaquita Alcohol de 96 Aceite de inmersin

a).- Tincin Simple 1. EXTENSIN: Depositar con un asa de siembra una gota del material a examinar en el centro de un portaobjetos limpio. Extender suavemente hasta ocupar una superficie de 1 cm2 aproximadamente. Si se trata de observar un microorganismo que est en un medio de cultivo slido, se pone previamente una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos y a continuacin se toca ligeramente la colonia y se hace la extensin. 2. SECADO: Dejar secar la preparacin al aire o con calor suave. 3. FIJACIN: Para ello, se toma el portaobjetos con las pinzas y se pasa 3-4 veces por la llama del mechero hasta que todo el agua quede evaporada. 4. APLICACIN DE COLORANTES: Una vez fra la preparacin, se cubre con la solucin del colorante y se deja actuar durante un cierto tiempo, segn su naturaleza. As, para Violeta de Genciana basta un minuto, para la Fuchsina bsica diluida, 2-3 minutos; para el azul de metileno 3-5 minutos. 5. LAVADO: Lavar con agua destilada para arrastrar el exceso de colorante. 6. SECADO FINAL: Secar la preparacin al aire o con calor suave. 7. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

b).- Tincin de Gram

1. Extensin. 2. Desecacin. 3. Fijacin. 4. Teir con Violeta de Genciana durante un minuto. 5. Aadir el reactivo de Lugol, y dejarlo actuar durante un minuto. 6. Lavar con agua. 7. Decolorar con alcohol hasta que salga exento de colorantes. Generalmente bastan unos 30 segundos. 8. Lavar con agua. 9. Aadir Fuchsina bsica, y dejarla actuar 1-2 minutos. 10. Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin. * Los microorganismos Gram Positivos aparecen de color violeta, mientras que los Gram Negativos se observan de color rojo o rosa.

BIBLIOGRAFIA

MARTIALAY VALLE, F. (MINISTERIO DE DEFENSA)(1988). Prontuario de tcnicas en microbiologa de alimentos. Pd de Defensa. PASCUAL ANDERSON, M.R. (1992). Microbiologa Alimentaria. Metodologa Analtica para alimentos y bebidas. Ed. Diaz de Santos. Madrid. ICMSF (1991). Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de analisis microbiolgico. Ed. Acribia. Zaragoza. HERNANDEZ JIMENEZ Y OTROS (1994) Anlisis microbiolgicos de alimentos y control de los procesos de fabricacin. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de los alimentos de la UPV.