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FACULDADEDECINCIAS
DEPARTAMENTODEQUMICAEBIOQUMICA
EstudodaRegulaodaExpressodoSintasede
cidosGordosdeSaccharomycescerevisiaena
AquisiodeResistnciaaoPerxidodeHidrognio
AndreiaFilipaPereiraCepeda
MestradoemBioqumica
EspecializaoemBioqumicaMdica
2010
UNIVERSIDADEDELISBOA
FACULDADEDECINCIAS
DEPARTAMENTODEQUMICAEBIOQUMICA
EstudodaRegulaodaExpressodoSintasede
cidosGordosdeSaccharomycescerevisiaena
AquisiodeResistnciaaoPerxidodeHidrognio
AndreiaFilipaPereiraCepeda
MestradoemBioqumica
EspecializaoemBioqumicaMdica
DissertaoorientadapelaProf.DoutoraLuisaCyrne
2010
i
NDICE
AGRADECIMENTOS...............................................................................................................iv
LISTADEABREVIATURASENOMENCLATURA........................................................................v
RESUMO.............................................................................................................................viii
ABSTRACT............................................................................................................................ix
I. INTRODUO.................................................................................................................1
I.1. Osintasedecidosgordos(FAS)deSaccharomycescerevisiae...............................1
I.1.1. OrganizaoefunodoFAS................................................................................2
I.1.2. RegulaodaexpressodosgenesFAS1eFAS2..................................................4
I.1.2.1. RegulaoanveltranscricionaldosgenesFAS1eFAS2..................................5
I.1.2.2. OelementoUAS
INO
eabiossntesedefosfolpidos...........................................7
I.1.2.3. Inositolcomoprincipalefectordaregulaodaexpressodosgenesque
contmoelementoUAS
INO
.............................................................................................10
I.1.2.4. Inositolderivadosefontes...........................................................................12
I.2. AleveduraSaccharomycescerevisiaecomomodelobiolgico..............................14
I.3. Operxidodehidrognio(H
2
O
2
)eostressoxidativo............................................16
I.3.1. OH
2
O
2
comoindutordestressoxidativo............................................................16
I.3.2. OestadoestacionriodeH
2
O
2
comoindutordestressoxidativo......................18
I.3.3. AadaptaoaoH
2
O
2
emS.cerevisiae.................................................................20
I.3.4. AregulaodaexpressognicaemcondiesdeadaptaoaoH
2
O
2
emestado
estacionrio.........................................................................................................................22
II. OBJECTIVOS.................................................................................................................25
III. MATERIAISEMTODOS...............................................................................................27
III.1. Materiais..............................................................................................................27
III.2. Materialbiolgico................................................................................................27
III.3. MtodosExperimentais........................................................................................28
III.3.1. CondiesdeCrescimento..................................................................................28
III.3.2. CurvasdeCrescimento........................................................................................29
III.3.3. DeterminaodasconstantesdeconsumodeH
2
O
2
pelasclulas.....................29
III.3.4. Adaptaodasclulasa150MdeH
2
O
2
emestadoestacionrio....................30
III.3.5. TranslocaodofactornuclearGFPOpi1p.........................................................31
III.3.5.1. Obtenodostransformantesopi1+GFPOpi1p.....................................31
III.3.5.2. VisualizaodatranslocaoporMicroscopiadefluorescncia................31
ii
III.3.6. Quantificaodosnveisdefosfolpidostotaisemclulascontroloetratadas
comH
2
O
2
,porCromatografiaemcamadafinabidimensional...........................................32
III.3.6.1. Extracodoslpidostotais.........................................................................32
III.3.6.2. SeparaodoslpidosporTLCbidimensional.............................................33
III.3.6.3. Quantificaodosfosfatos..........................................................................33
III.3.7. QuantificaodosextractosproteicospeloMtododePeterson.....................34
III.3.8. PCRquantitativoemtemporeal(RealtimeQPCR)...........................................35
III.3.8.1. PreparaodoRNAtotaldaleveduraS.cerevisiae....................................36
III.3.8.2. TratamentocomDNaseI............................................................................36
III.3.8.3. AmplificaodeumasequnciadecidosnucleicosporPCR....................37
III.3.8.4. SntesedaprimeiracadeiadecDNAusandoRevertAid
TM
HMinusReverse
Transcriptase(Fermentas)..............................................................................................38
III.3.8.5. AnliseporPCRquantitativoemtemporeal(RealtimeQPCR)................38
III.3.9. DoseamentodoInositolIntracelular...................................................................40
III.3.9.1. Obtenodeextractostotais......................................................................40
III.3.9.2. Tratamentodoextractocelular..................................................................41
III.3.9.2.1. Precipitaodaprotena.........................................................................41
III.3.9.2.2. CromatografiadeTrocaInica................................................................41
III.3.9.2.3. Liofilizao...............................................................................................42
III.3.9.2.4. Remoodainterfernciadaglucose.....................................................42
III.3.9.3. Mtodoenzimticoespectrofotomtricodedoseamentodoinositol.......42
III.3.10. Anliseestatstica............................................................................................44
IV. RESULTADOSEDISCUSSO..........................................................................................45
IV.1. TranslocaonucleardofactorGFPOpi1p............................................................45
IV.1.1. Caracterizaodasestirpeswt,opi1eopi1+GFPOpi1p..............................46
IV.1.2. OptimizaodascondiesparaestabeleceroestadoestacionriodeH
2
O
2
....49
IV.1.2.1. Actividadedoenzimaglucoseoxidase........................................................49
IV.1.2.2. ConsumodeH
2
O
2
pelasclulasintactas.....................................................49
IV.1.2.3. ClculodosvolumesdeglucoseoxidaseeH
2
O
2
paraestabeleceroEstado
EstacionriodeH
2
O
2
.......................................................................................................51
IV.1.3. VisualizaodatranslocaonucleardofactorGFPOpi1ppormicroscopiade
fluorescncia.......................................................................................................................51
IV.2. QuantificaodosnveisdefosfolpidostotaisporTLCbidimensional..................55
IV.3. QuantificaodediversostranscritosreguladospeloinositolporPCRquantitativo
emtemporeal.................................................................................................................59
iii
IV.4. DeterminaodosnveisdeinositolemclulascontroloetratadascomH
2
O
2
......66
IV.4.1. OptimizaodoMtododeDoseamento...........................................................66
IV.4.2. CurvadeCalibraodoMtodoEspectrofotomtrico.......................................69
IV.4.3. Mediodosnveisintracelularesdeinositolemclulascontroloeadaptadasa
150MdeH
2
O
2
...................................................................................................................69
V. CONSIDERAESFINAIS...............................................................................................72
VI. PERSPECTIVAS..............................................................................................................74
REFERNCIASBIBLIOGRFICAS............................................................................................76
iv
AGRADECIMENTOS
minhafamliaeamigos,emparticular:
Aos meus pais e irm, pelo apoio e pacincia demonstrados, e por compreenderem a
dedicaoexclusivanecessriaaestetrabalho.
Rita, sem a qual no teria conseguido ultrapassar mais esta etapa. Obrigada pelo
apoio,pelainfinitapacinciaeporestaressemprepresente!
Filipa, que se tornou uma grande amiga e confidente nos momentos em que me
sentianumbecosemsada.
E por ltimo mas no menos importante, ao Juan pela boa disposio, pelo
companheirismo, pelo apoio incondicional e por se ter revelado um amigo para a vida.
Obrigadaportudo!
LISTADEABREVIATURASENOMENCLATURA
3PPI3fosfatofosfoinositol
Abs
xnm
Absorvnciaaxnm
ATPTrifosfatodeadenosina
ATP2NaTrifosfatodeadenosinadisdico
bHLHdoinglsbasicHelixLoopHelix
BrEtBrometodeetdeo
BSAdoinglsBovineSerumAlbumin,albuminadesorobovino
CLCardiolipina
CDPDifosfatodecitidina
CDPDAGCDPdiacilglicerol
CTPTrifosfatodecitidina
DaDalton
DAGDiacilglicerol
DAGPPPirofosfatodediacilglicerol
DNAcidodesoxirribonucleico
DNaseIDesoxirribonucleaseI
dNTPDesoxirribonucletido
dsDNAdoinglsdoublestandDNA
EROsEspciesReactivasdeOxignio
FASdoinglsFattyAcidSynthase,sintasedecidosgordos
G6PDH6fosfatodeglucosedesidrogenase,omesmoqueZWF1
GOGlucoseoxidase
GPxGlutationoperoxidase
H
2
O
2
Perxidodehidrognio
HO
Radicalhidroxilo
vi
INTCloretodeiodonitrotetrazlio
IPCInositolfosfoceramida
MIMioinositol
MIDHMioinositoldesidrogenase
MIPCManosilinositolfosfoceramida
M(IP)
2
CManosildiinositolfosfoceramida
mRNARNAmensageiro
NAD
+
Dinucletidodeadeninaenicotinamida(formaoxidada)
NADHDinucletidodeadeninaenicotinamida(formareduzida)
NADPHFosfatodedinucletidodeadeninaenicotinamida(formareduzida)
O
2
Oxigniomolecular
O
2
Radicalaniosuperxido
1
O
2
Dioxigniosingleto
OD
600
Densidadepticaa600nm
ONOO
Peroxinitrito
PAcidofosfatdico
pbparesdebases
PCFosfatidilcolina
PCRdoinglsPolymeraseChainReaction
PDEouPDMEFosfatidildimetiletanolamina
PEFosfatidiletanolamina
PEGPolietilenoglicol
PGFosfatidilglicerol
PiFsforoinorgnico
PIFosfatidilinositol
PIP4fosfatofostatidilinositol
PIP
2
ouPI(4,5)P
2
4,5bifosfatodefostatidilinositol
PI(3,5)P
2
3,5bifosfatodefostatidilinositol
PMEouPMMEFosfatidilmonometiletanolamina
PMSFFluoretodfenilmetilsuonilo
PSFosfatidilserina
RNAcidoribonucleico
RNaseRibonuclease
RO
Radicalalcoxilo
ROO
Radicalperoxilo
vii
ROOHHidroperxidosorgnicos
SCdoinglsSyntheticComplete,SintticoCompleto
SDSDodecilsulfatodesdio
SODSuperxidodismutase
ssDNAdoinglssinglestandDNA,DNAdecadeiasimples
TAGTriacilglicerol
TFKTampodefosfatosdepotssio
TLCdoinglsThinLayerChromatography,CromatografiaemCamadaFina
TrisTrishidroximetilaminometano
UAS
INO
doinglsinositolsensitiveupstreamactivatingsequence
UVUltravioleta
VLCFAdoinglsVeryLongChainFattyAcids,cidosgordosdecadeiamuitolonga
YNBdoinglsYeastNitrogenBase
ZWF1verG6PDH
viii
RESUMO
AexposiodasclulasdeSaccharomycescerevisiaeadosessubletaisdeH
2
O
2
torna
as mais resistentes a doses letais posteriores, ocorrendo alteraes na permeabilidade da
membrana plasmtica. As clulas adaptadas ao H
2
O
2
apresentam uma menor expresso do
gene FAS1 e uma diminuio da actividade do sintase de cidos gordos. O FAS1 regulado
pelosnveisdeinositol,possuindoasequnciaUAS
INO
naregiopromotora,sendoaexpresso
reprimida quando o inositol aumenta intracelularmente. Na tentativa de compreender os
mecanismos moleculares envolvidos na regulao do gene FAS1 pelo H
2
O
2
, tomouse como
premissa que o H
2
O
2
reprime a expresso do gene FAS1 atravs da induo dos nveis de
inositol.Determinaramseosnveisdeinositolemclulaswtcontroloetratadascom150M
de H
2
O
2
em estado estacionrio (10 min e 20 min), observandose uma diminuio drstica
destes nveis nas clulas tratadas, contrariando a hiptese inicial. Contudo, expondo clulas
opi1 + GFPOpi1p ao H
2
O
2
nas mesmas condies, observouse a translocao mxima da
protena Opi1p do retculo endoplasmtico para o ncleo aos 20 min, de acordo com o
mecanismoderegulaopeloinositol.Paraapoiarahiptese,quantificaramseosfosfolpidos
cuja sntese regulada pelo inositol e analisouse a expresso de alguns genes cujo produto
regulaessasntese.Noforamobservadasdiferenassignificativasnacomposiofosfolipdica
total durante a exposio ao H
2
O
2
, excepto uma tendncia para um aumento de
fosfatidiletanolamina aos 5 min e uma diminuio aos 10 min, e um aumento dos nveis de
fosfatidilcolinaaos20min.OH
2
O
2
reprimiu(INM1,INO2,CHO1,URA7ePIS1)einduziu(GPT2)
a expresso de vrios genes da sntese de fosfolpidos. A expresso de INO1 foi oscilatria,
sendo induzida e reprimida aos 20 e 40 min, respectivamente. A expresso de ITR1 foi
reprimida logo aos 10 min. Estes resultados apoiam a existncia nas clulas de levedura de
uma resposta coordenada da expresso de genes envolvidos na biossntese de fosfolpidos e
cidosgordosaoH
2
O
2
.
Palavraschave:Perxidodehidrognio(H
2
O
2
),FAS1,inositol,Opi1p,UAS
INO
,fosfolpidos.
ix
ABSTRACT
Keywords:hydrogenperoxide(H
2
O
2
),FAS1,inositol,Opi1p,UAS
INO
,phospholipids.
I. INTRODUO
I.1. Osintasedecidosgordos(FAS)deSaccharomycescerevisiae
Figura 1 Sequncia reaccional da sntese e elongao dos cidos gordos. ACC, AcetilCoA carboxilase; KS, 3
oxoacil sintase; KR, 3oxoacil redutase; DH, enoil desidratase; ER, enoil redutase. Adaptado de (Tehlivets et al.,
2007).
I.1.1. OrganizaoefunodoFAS
A sntese de novo de cidos gordos levada a cabo pelo sistema enzimtico FAS, que
catalisa ciclos de reaces qumicas com vrios passos, essenciais a todos os organismos
(Lomakin et al., 2007). Apesar de apresentar variaes estruturais considerveis nas suas
estruturas moleculares consoante o organismo, o mecanismo de reaco essencialmente o
mesmo em todos os sistemas biolgicos. O sistema composto por vrias actividades
enzimticas [ac(et)il transferase (AC); malonil/acetil ou malonil/palmitoiltransferase (AT,
MPT); oxoacil sintase (KS); oxoacil redutase (KR); enoil desidratase (DH); enoil redutase (ER);
acilcarrierprotein(ACP);tioesterase(TE)],havendoumaorganizaoestruturalespecficaem
cada organismo. As vrias actividades enzimticas podem (i) estar associadas numa nica
3
cadeiapolipeptdicaou(ii)estarassociadasemsistemasmultienzimticos(Figura2).Osistema
FASdiferetambmnasualocalizaosubcelularconsoanteoorganismo,podendolocalizarse
no apenas no citoplasma, mas tambm em organelos e em membranas microssomais.
Ocasionalmente, pode tambm ser encontrado associado a estruturas subcelulares, que
subsequentementeservemdeaceitadorasdosseusprodutosreaccionais.Deacordocomestas
caractersticas,ossistemasFASforamagrupadosem3classes:tipoIa,tipoIbetipoII(Lomakin
etal.,2007;SchweizerandHofmann,2004).
Figura2OrganizaodosdomniosdossistemasFAStipoIemdiversosorganismos.AC,ac(et)iltransferase;AT
ou MPT, malonil/acetil ou malonil/palmitoiltransferase; KS, oxoacil sintase; KR, oxoacil redutase; DH, enoil
desidratase; ER, enoil redutase; ACP, acil carrier protein; TE, tioesterase, PPT, fosfopantetena transferase.
Adaptadode(SchweizerandHofmann,2004).
6
(6 subunidades e 6
4
subunidades)demassamolecular2,5MDa,paraconstituiremosistemamultienzimticoFAS
funcional(Kolodziejetal.,1996;SchweizerandHofmann,2004;Tehlivetsetal.,2007).
Figura 3 Organizao dos domnios do sistema FAS tipo Ia em Saccharomyces cerevisiae. A subunidade , que
compreende as actividades ACERDHMPT, codificada pelo gene FAS1; a subunidade , que compreende as
actividades ACPKRKSPPT, codificada pelo gene FAS2. AC, acetil transferase; ER, enoil redutase; DH, enoil
desidratase; MPT, malonil/palmitoiltransferase; ACP, acil carrier protein; KR, oxoacil redutase; KS, oxoacil sintase;
PPT,fosfopantetenatransferase.Adaptadode(SchweizerandHofmann,2004).
I.1.2. RegulaodaexpressodosgenesFAS1eFAS2
AssubunidadesFas1eFas2estopresentesemquantidadesequimolaresnocomplexo
6
,sugerindoumaregulaocoordenadadosgenesFAS1eFAS2.Noentanto,foiobservado
que a quantidade do holoenzima FAS determinada pelos nveis da protena Fas1, e que o
contedodestaprotena controlado aonveldaexpressotranscricionaldo geneFAS1 e da
estabilidadedaprotena(Tehlivetsetal.,2007).Poroutrolado,quandoogeneFAS1foisobre
FAS1 FAS2
5
expressoobservouseumaumentoconcomitantedosnveisdomRNAdogeneFAS2,enquanto
os nveis do mRNA do gene FAS2 diminuram em clulas mutantes fas1. Curiosamente, a
expressodogeneFAS1independentedosnveisdeexpressodeFAS2(Wenzetal.,2001).
I.1.2.1. RegulaoanveltranscricionaldosgenesFAS1eFAS2
excessoouemquantidadesreduzidas,inibemouactivam,respectivamente,atranscriodos
genes que possuem o elemento UAS
INO
nos seus promotores. Mais tarde foi visto que a
expresso dos genes FAS reprimida quando h aumento do inositol intracelular,
independentemente da presena de colina (Jesch et al., 2005). Para alm danecessidade dos
factores Ino2p e Ino4p, a represso/activao da expresso dos genes que possuem o
elementoUAS
INO
nassuasregiespromotorascontroladapelaprotenareguladoranegativa
Opi1p,cujafunodeterminadapelasualocalizaonuclear(verI.1.2.3).
Figura 4 Representao e localizao dos locais de regulao da expresso dos genes FAS1 e FAS2. Esto
evidenciados os locais de activao da transcrio gerais (Rap1, Rep1, Abf1) e a sequncia UAS
INO
, cisacting
elementslocalizadosnasregiespromotorasamontantedosgenesFAS1eFAS2.PresumesequeasequnciaDRS,
na sequncia codificante do gene FAS2, interage com Fas1 directamente ou em combinao com um factor X
desconhecido.Abf1,Reb1eRap1,locaisdeligaodosfactoresdetranscriocomomesmonome;Ino2peIno4p,
factoresdetranscrio; DRS,DownstreamRepressionSite;UAS
INO
,inositolsensitiveupstreamactivating sequence.
Adaptadode(SchweizerandHofmann,2004).
a sequncia DRS (downstream repression site) presente na regio codificante do gene FAS2
(Figura 4) era responsvel por este efeito repressor. Quando se delectou a sequncia DRS,
houve uma desrepresso da expresso de FAS2, mesmo na ausncia de FAS1. Portanto, FAS1
obviamente interfere com o retardamento da transcrio de FAS2 dependente de DRS. O
mecanismo pelo qual isso acontece ainda desconhecido. De acordo com o esquema
hipottico apresentado na Figura 4, um excesso de subunidade (codificada por FAS1) pode
aliviar a aco de DRS tanto por interaco directa ou em associao com um factor X
desconhecido. Assim, a sntese de subunidade estimulada at um nvel em que as duas
subunidades esto presentes em concentraes celulares equivalentes (Schweizer and
Hofmann,2004).
Os nveis celulares de FAS esto ainda sujeitos a controlo pstraducional. Foi
demonstradaaocorrnciadedegradaodassubunidadesFASnoassociadas,porproteases
vacuolares (subunidade ) e citoplasmticas (subunidade ) (Schweizer and Hofmann, 2004).
Enquanto o oligmero FAS
6
6
proteoliticamente estvel, as suas subunidades livres so
rapidamentedegradadas(Hanetal.,2002;Kvametal.,2005;Schneideretal.,1995).
I.1.2.2. OelementoUAS
INO
eabiossntesedefosfolpidos
controladosporvriosfactorescomolpidos(ex.PA,CDPDAG),precursoreslipdicos(inositol
e/oucolina,etanolamina),produtosfosfolipdicos,assimcomopornucletidos(ex.ATPeCTP)
e por modificaes pstraducionais (ex. (des)fosforilao). A disponibilidade de nutrientes
(zinco e azoto), a fase de crescimento, o pH e a temperatura tambm se revelam factores
importantes no processo de regulao da biossntese dos fosfolpidos (Carman and Han,
2009b;CarmanandHenry,2007;CarmanandZeimetz,1996;Iwanyshynetal.,2004).
Os fosfolpidos PE e PC podem ser sintetizados por duas vias distintas: (i) a partir de
CDPdiacilglicerol (CDPDAG) pela via de sntese de novo (assinalada a vermelho na Figura 5),
como todos os outros fosfolpidos, ou (ii) atravs da via metablica de Kennedy (assinalada a
verdenaFigura5)(CarmanandZeimetz,1996).
Ocidofosfatdico(PA)assumeumpapelfulcralnabiossntesedefosfolpidos,nos
por ser um intermedirio principal, como tambm por desempenhar um papel ao nvel da
sinalizaocelularnesteprocesso(Loewenetal.,2004).OPAsintetizadodenovoapartirdo
3fosfato de glicerol (Gro3P) que, por sua vez, transformado em cido lisofosfatdico
(LisoPA) numa reaco catalisada pelo produto do gene GPT2, o enzima 3fosfato de glicerol
aciltransferase.OPApodeaindaserformadoporoutrasvias,taiscomo(i)aacilaodocido
lisofosfatdico pelo lisoPAaciltransferase (LPAAT); (ii) via hidrlise da ligao PO da
fosfatidilcolina (PC) para produzir PA e colina, catalisada pelo fosfolipase D (codificado pelo
gene SPO14); (iii) por fosforilao do diacilglicerol (DAG), catalisada pelo DAG cinase 1
dependente de CTP (codificado pelo gene DGK1); (iv) por desfosforilao do DAGPP
(pirofosfatodediacilglicerol)aPAePi,catalisadapeloDAGPPfosfatase(codificadopelogene
DPP1)(CarmanandHan,2009b;CarmanandHenry,2007).
Uma via de ramificao na biossntese de fosfolpidos envolve os enzimas PS sintase
(codificadopelogeneCHO1)ePIsintase(codificadopelogenePIS1)quecatalisamasntesede
PS e PI, respectivamente, utilizando CDPDAG como substrato. Ao contrrio do que acontece
com o PS sintase, a actividade do PI sintase no regulada por precursores fosfolipdicos,
fosfolpidos, bases esfingides ou fosforilao. A partio de CDPDAG entre PS e PI no
governada pelas afinidades que o PS sintase e o PI sintase tm para o CDPDAG. Dados os
baixosnveisintracelularesdeinositol,provvelqueasntesedePIpeloPIsintaseinvivoseja
reguladapeladisponibilidadedestesubstrato(CarmanandZeimetz,1996).
OfosfolpidoPIumintermedirioparaasntesedefosfoinositis(PIP,PIP
2
e3PPI)e
esfingolpidos (IPC, MIPC e M(IP)
2
C), como se encontra representado Figura 5. Visto isto, a
regulao das actividades enzimticas PI 4cinase (codificado pelo gene PIK1), que catalisa a
conversodePIaPIP,eIPCsintase(codificadopelogeneAUR1),quecatalisaaconversodePI
9
a IPC, podem desempenhar um papel central na partio de PI por estes lpidos (Carman and
Zeimetz,1996).
Figura5ViasbiossintticasdesntesedefosfolpidosemS.cerevisiae.Aviadenovoestassinaladaavermelho
e a via de Kennedy a verde. Encontramse indicados os genes estruturais, estando evidenciados a azul os genes
regulados pelo inositol. As reaces indicadas so catalisadas pelos seguintes enzimas: 1. 3fosfato de glicerol
aciltransferase; 2. lisoPA aciltransferase (LPAAT); 3. CDPdiacilglicerol sintase (CDS); 4. PS sintase (PSS); 5. PS
descarboxilase(PSD);6.PEmetiltransferase(PEMT);7.fosfolpidometiltransferase(PLMT);8.PAfosfatase(PAP);9.
Etanolamina cinase (EK); 10. fosfoetanolamina citidiltransferase (ECT); 11. Etanolamina fosfotransferase (EPT); 12.
Colinacinase;(CK);13.fosfocolinacitidiltransferase(CCT);14.Colinafosfotransferase(CPT);15.DAGaciltransferase
(DGT);16.1fosfatodeinositolsintase(IPS);17.1fosfatodeinositolfosfatase(IPP);18.PIsintase(PIS);19.PIcinase
(PIK);20.PIPcinase(PIPK);21.PI3cinase;22.IPCsintase(IPCS);23.PGPsintase(PGPS);24.PGPfosfatase(PGPP);
25. CL sintase (CLS); 26. Fosfolipase D (PLD); 27. CTP sintase (CTPS); 28. DAG cinase 1 dependente de CTP (DGK1);
29. DAGPP fosfatase (DPP1). 6PGlucose, 6fosfato de glucose; 1PInositol, 1fosfato de inositol; 3P Glicerol, 3
fosfatodeglicerol(Gro3P);LisoPA,cidolisofosfatdico;PA,cidofosfatdico;DAGPP,pirofosfatodediacilglicerol;
DAG, Diacilglicerol; TAG, Triacilglicerol; CDPDAG, CDPdiacilglicerol; PI, Fosfatidilinositol; PIP, 4fosfato
fosfatidilinositol; PIP
2
, 4,5bifosfato de fosfatidilinositol; IPC, Inositol fosfoceramida; MIPC, Manosilinositol
fosfoceramida; M(IP)
2
C, Manosildiinositol fosfoceramida; 3PPI, 3fosfato fosfoinositol; PG, Fosfatidilglicerol; CL,
Cardiolipina; PS, Fosfatidilserina; PE, Fosfatidiletanolamina; PME, Fosfatidilmonometiletanolamina; PDE,
Fosfatidildimetiletanolamina;PC,Fosfatidilcolina;Cho,Colina;Etn,Etanolamina.Adaptadode(CarmanandZeimetz,
1996;Chenetal.,2007).
3PGlicerol LisoPA PA
Etn
PEtn
CDPEtn
DAG
CDPDAG
PG
PGP
PS
PME
PDE
PI
PIP
PIP
2
IPC
MIPC
M(IP)
2
C
3PPI
Inositol
1PInositol
6PGlucose
CL
PE
PC
ViadeKennedy
SCT1
GTP2
DPP1
(2)
(8)
(15)
PAH1
(3)
(16)
INO1
(17)
INM1
CDS1 DGK1
DAGPP
SLC1
ALE1
CTP
PPi
UTP
URA7
URA8 CMP
PIS1 (18)
CHO1
(23) Serina
CMP
(5)
PSD1
PSD2
(6)
CHO2
(7)
OPI3
(7)
OPI3
CO
2
CH
3
CH
3
SPO14
(26)
EKI1
(9)
ECT1
(10)
ATP
ADP
CTP
PPi
CMP
UTP
(27)
Viadenovo
AcilDHAP DHAP
AYR1
DGA1
LRO1
CRD1
PGS1
TAG
Cho
PCho
CDPCho
ATP
ADP
CTP
PPi
UTP
(27)
CMP
CPT1 (14)
CKI1
(12)
PCT1
(13)
PIK1
(1)
(21)
(22) (19)
(20)
(24)
(25)
(27)
(4)
(28)
(29)
AUR1
EPT1 (11)
10
I.1.2.3. Inositol como principal efector da regulao da expresso dos genes que contm o
elementoUAS
INO
Figura 6 Interaces regulatrias dos factores de transcrio envolvidos na expresso dos genes FAS
dependente de UAS
INO
, em S. cerevisiae. As interaces que activam (a verde) ou reprimem (a vermelho) a
transcriodosgenesFASencontramseassinaladascomdiferentescores.Sin3,histonedeacetylasecomplex;Ino2p
e Ino4p, factores de transcrio; RNA Pol II, RNA polimerase II; TAD, domnio de activao da transcrio; RID,
domniodeinteracorepressor;SID,domniodeinteracocomSin3;bHLH,basichelixloophelix;UAS
INO
,inositol
sensitiveupstreamactivatingsequence.Adaptadode(SchweizerandHofmann,2004).
11
opi1 transformada com um plasmdeo que possui uma regio GFPOpi1p (Loewen et al.,
2004).
Figura 7 Modelo de regulao da expresso dos genes que possuem o elemento UAS
INO
pelo inositol, em S.
cerevisiae. A. Quando o inositol est ausente, a protena Opi1p localizase no RE, associada protena Scs2p e ao
PA,sendoosgenesquepossuemassequnciasUAS
INO
nasregiespromotorasexpressos.B.Quandooinositolest
presente,osnveisdePAbaixamnoRE,ocomplexoScs2pOpi1pPAdissociado,eaprotenaOpi1ptranslocada
para o ncleo das clulas, ligandose ao heterodmero Ino2pIno4p nas sequncias UAS
INO
, sendo a expresso dos
genes reprimida. Scs2, membranespanning protein; PA, cido fosfatdico; Ino2p e Ino4p, factores de transcrio;
UAS
INO
,inositolsensitiveupstreamactivatingsequence;RE,retculoendoplasmtico.Adaptadode(Carman,2005).
Tendo em considerao o que foi dito, reconhecido o papel do inositol como factor
determinante na regulao da expresso dos genes que contm o elemento UAS
INO
nas suas
regiespromotoras.
I.1.2.4. Inositolderivadosefontes
Figura 8 Diversidade e nomenclatura dos cinco ismeros de inositol mais comuns na natureza. Adaptado de
(Michell,2008).
Figura 9 Vias para a biossntese de fosfolpidos, biossntese de inositol e uptake de inositol em S. cerevisiae.
Encontrase apresentado um esquema das vias relevantes. PE, fosfatidiletanolamina; PDME,
fosfatidildimetiletanolamina; PMME, fosfatidilmonometiletanolamina; PA, cido fosfatdico; CDPDAG, CDP
diacilglicerol;Ino1p,1fosfatodeinositolsintase;Itr1peItr2p,transportadoresdeinositollocalizadosnamembrana
plasmtica.Adaptadode(LaiandMcGraw,1994).
14
I.2. AleveduraSaccharomycescerevisiaecomomodelobiolgico
AslevedurassofungosunicelularespertencentesaofiloAscomycete.Tmvindoaser
reconhecidas como um sistema modelo bastante importante, representando um eucariota
simplescujogenomapodeserfacilmentemanipulado(Sherman,2002).Emborapossuamuma
complexidadegenticasuperiordosprocariotas,partilhamcomelesalgumascaractersticas
quetornamasuautilizaovantajosaemestudosbiolgicos:(i)crescimentosimpleserpido;
(ii) facilidade de isolamento de mutantes e clulas transformantes; (iii) sistema gentico bem
15
animais bastante demorado e complexo, pelo que a levedura um bom modelo de partida
parasimularascondiesencontradasnasclulasanimais(Cunha,2001).
I.3. Operxidodehidrognio(H
2
O
2
)eostressoxidativo
I.3.1. OH
2
O
2
comoindutordestressoxidativo
),oradicalhidroxilo(HO
),radicaisperoxilo(ROO
),os
radicaisalcoxilo(RO
),mastambmmolculascomoodioxigniosingleto(
1
O
2
),operxidode
hidrognio (H
2
O
2
) e outros hidroperxidos orgnicos (ROOH) e ainda o peroxinitrito (ONOO
)
(Cadenas,1998).
17
DevidonaturezaubquadasEROs,nodeestranharqueamaioria(senotodos)os
organismos tenham desenvolvido formas de protegerem os seus componentes celulares
contraostressoxidativo(Jamieson,1998).Sobcondiesfisiolgicasnormais,osmecanismos
de defesa antioxidantes so quase certamente adequados para manter as EROs em nveis
basais, no lesivos, e para reparar os danos celulares infligidos. As defesas primrias
neutralizam as EROs, enquanto as secundrias reparam ou removem os produtos do dano
oxidativoaoDNA,protenaselpidos(MoradasFerreiraetal.,1996).Todososorganismosque
sobrevivem custa do metabolismo aerbio so continuamente expostos a estes agentes,
levando a uma situao de stress oxidativo. O stress oxidativo representa um desequilbrio
entreaproduodeEROseacapacidadeantioxidantedaclulaparadestoxificarrapidamente
osintermediriosreactivosoupararepararosdanoscelularesinduzidos,afavordaproduo
deEROs(Jamieson,1998;Sies,1997).
O perxido de hidrognio (H
2
O
2
) a principal ERO formada endogenamente e a que
apresentaumamaiorestabilidade(Giorgioetal.,2007),daquetenhavindoareceberespecial
ateno por parte da comunidade cientfica devido a ser um forte oxidante e sua presena
ubqua em todos os organismos aerbios (Chance et al., 1979). Os organismos estudados at
aomomentodemonstraramumaelevadasensibilidadeapequenasvariaesnaconcentrao
desta molcula, pelo que se torna bvia a necessidade de possurem mecanismos de
eliminao desta espcie qumica e de obviao dos seus efeitos (Giorgio et al., 2007). Esta
EROtemumadualidadefuncional,umavezquesurgeassociadaavariadasreacesqumicas
deoxidaodetiiseinactivaodeenzimas(Grant,2001)mastambmsinalizaocelular
emdiversosprocessos(desenvolvimento,proliferao,mortecelular,transduodesinal).
O H
2
O
2
pode ser gerado endogenamente atravs de variadas reaco catalisadas
enzimaticamente (Chance et al., 1979). Uma das principais fontes endgenas de H
2
O
2
a
reaco de dismutao do O
2
Jamieson,1998;LeMoanetal.,2006).OsdanosinduzidospeloH
2
O
2
podemocorrerdeforma
indirecta, atravs da formao do radical hidroxilo (HO
ocorrevia
reacodeFenton(Equao1)porreacocomiesdemetaisdetransioreduzidoscomoo
Fe
2+
eoCu
+
,quesooxidadosduranteoprocesso(Templeetal.,2005;Toledanoetal.,2003).
H
2
O
2
+Fe
2+
Fe
3+
+HO
+HO
Equao1
I.3.2. OestadoestacionriodeH
2
O
2
comoindutordestressoxidativo
Nosentidodesimularascondiesexistentesinvivoaquandodaexposiodasclulas
ao H
2
O
2
, nomeadamente em situaes de stress oxidativo, tm sido feitas vrias abordagens
em diversos sistemas biolgicos. Porm, a grande maioria delas baseiase na adio de uma
dose bolus de H
2
O
2
correspondente concentrao desejada, sendo o H
2
O
2
consumido pelos
peroxidases intracelulares, como o caso do catalase, sem que haja qualquer fonte de
produodomesmonosentidodeorepor,peloqueasuaconcentraoserdecrescenteao
longodotempoemquedecorreaexperincia(AntunesandCadenas,2001).Estasituaono
se assemelha que ocorre in vivo, que caracterizada por uma concentrao constante de
H
2
O
2
ao longo do tempo. Quando se adiciona H
2
O
2
em condies bolus, a concentrao de
H
2
O
2
vai decrescendo ao longo do tempo (Figura 10B) pelo que h, frequentemente, uma
necessidade de adicionar doses iniciais de H
2
O
2
muito elevadas, na ordem dos 10
5
10
3
M,
duas a cinco vezes superior concentrao de H
2
O
2
encontrada in vivo. Estes nveis
elevadssimosdeH
2
O
2
representamumchoqueagudonofisiolgico,provocammodificaes
oxidativas severas (algumas das quais irreversveis), disrompem a homeostase celular e
induzemrespostascelularesquepodemnoestarrelacionadascomasinduzidaspelasbaixas
concentraes de H
2
O
2
encontradas in vivo. Como tal, a adio de H
2
O
2
em bolus no um
mtodo adequado para estudar questes fundamentais sobre os efeitos biolgicos do H
2
O
2
a
19
nvel regulatrio (Antunes and Cadenas, 2001). Foi, portanto, desenvolvida uma abordagem
experimental que permite mimetizar a concentrao constante de H
2
O
2
observada in vivo, a
aproximao de adio de H
2
O
2
em estado estacionrio (Antunes and Cadenas, 2001) (Figura
10B). O estado estacionrio de H
2
O
2
obtido adicionando ao meio de cultura uma fonte
geradora de H
2
O
2
, o enzima glucose oxidase (GO) (Figura 10A), que compensa o consumo
levado a cabo pelos peroxidases intracelulares (catalase e glutationo peroxidases). O enzima
glucose oxidase utiliza como substrato a glucose presente em excesso no meio de cultura
(AntunesandCadenas,2001).
difundeseparaointeriordasclulaserapidamenteconsumidodevidoacodosenzimasantioxidantes,como
oGlutationoperoxidase(GPx)eocatalase(Cat).Devidoaesteconsumo,naadioembolus(1)tmdeserusadas
elevadasconcentraesdeH
2
O
2
parasereminduzidasrespostascelulares.Naaproximaodeestadoestacionrio
(2) a concentrao de H
2
O
2
mantida constante durante o ensaio devido adio de glucose oxidase (GO),
simultaneamente com uma dose inicial de H
2
O
2
concentrao desejada. Adaptado de (OliveiraMarques et al.,
2009).
v
2
v
1
=k[H
2
O
2
]
[H
2
O
2
]
Produo de H
2
O
2
pelo
enzima glucose oxidase
Consumo de H
2
O
2
pela clula
A
B
20
AadiodeH
2
O
2
emestadoestacionriovantajosarelativamenteadioembolus
porque: (i)mimetizaaproduoendgenadeH
2
O
2
contnuainvivo,contrariamenteadio
embolusquedisrompeahomeostasecelular;(ii)uniformizaaentregadoH
2
O
2
,porqueeste
fornecido numa concentrao de estado estacionrio (concentrao de H
2
O
2
mantmse
constante);(iii)naadioembolusadoseefectivadeH
2
O
2
entregueporcluladesconhecida
porque depende tanto da densidade celular como do consumo de H
2
O
2
pelo meio de
crescimento, o que torna a comparao de dados entre laboratrios difcil; (iv) permite a
distino de respostas celulares de acordo com a concentrao de H
2
O
2
que as desencadeia,
contrariamente adio em bolus, onde as respostas celulares surgem todas associadas; (v)
permitedeterminaraconcentraodeH
2
O
2
aolongodoensaio.
O modelo de estado estacionrio consiste, ento, numa melhor aproximao s
condiesfisiolgicas,comavantagemdenodisromperahomeostasecelular.
I.3.3. AadaptaoaoH
2
O
2
emS.cerevisiae
UmaspectointeressantedarespostaadaptativaaoH
2
O
2
queainduodediferentes
padres de alteraes proteicas e de expresso gnica em S. cerevisiae tambm observada
em outras situaes de stress oxidativo. Muitas das protenas cuja expresso gnica se
encontra alterada em resposta ao H
2
O
2
, vem tambm a sua expresso alterada quando
expostasaoutrosfenmenosindutoresdestressoxidativoquenoosprovocadospeloH
2
O
2
.
Estas observaes indiciam uma resposta comum entre fenmenos de stress (Godon et al.,
1998;MoradasFerreiraetal.,1996).
Recorrendo ao uso de microchips de DNA e a tcnicas genmicas avanadas foi
possvelobservaralteraesnosnveisdemRNAdurantearespostaadaptativaaoH
2
O
2
.Foram
observadasalteraesemcercadeumterodogenomadeS.cerevisiaesendoque,deentreo
grande nmero de genes que viram a sua expresso alterada, aproximadamente 500 esto
envolvidosnarespostaafenmenosdestress(Caustonetal.,2001;Gaschetal.,2000).Destes
so induzidos aqueles associados ao metabolismo glicdico, resposta ao stress celular e
gerao de energia (via gliclise). Os reprimidos esto ligados traduo e sntese proteicas
(Godon et al., 1998). Foi observado que a respostaao H
2
O
2
caracterizase principalmente por
uma forte induo de genes associados destoxificao de EROs (Superxido dismutases
SOD e glutationo peroxidases GPx) e de genes relacionados com reaces de oxidao
reduointracelulares.Porm,estesresultadosforamobtidosatravsdaadiodeumadose
bolus (letal) de H
2
O
2
, que resulta em concentraes de H
2
O
2
em nada semelhantes s
observadas in vivo. Neste tipo de aproximao experimental a resposta observada envolve
muitomaisgenesdevidoquerprpriarespostadaclulaaostressoxidativoquerenorme
alterao do estado redox da clula, havendo uma juno de diferentes respostas que
conduzem a resultados inespecficos e em muitos casos inconclusivos. Recentemente, foi
estudadaarespostagnicadasclulasdeS.cerevisiaeadaptadasa150MdeH
2
O
2
emestado
estacionrio durante 90 min (Pedroso, 2008) (ver captulo I.3.4). Nestas condies
experimentais foi analisada a expresso gnica por anlise de microarrays, tendo sido
observadas variaes na expresso de um total de 385 genes, correspondendo esses genes a
6%dototalexistentenogenomadeS.cerevisiae(Pedroso,2008).Verificouse,portanto,uma
respostadistintadaquelaobservadacomadiodeH
2
O
2
embolus,devidosobretudosdoses
subletais de H
2
O
2
s quais as clulas foram expostas e maior especificidade da resposta
celular(Pedroso,2008).
22
emestadoestacionrio
se difunde livremente atravs das biomembranas. Este novo modelo implica que sejam
formadosgradientesdeH
2
O
2
atravsdasmembranas(Pedrosoetal.,2009).
Um dos aspectos mais notveis da resposta das clulas presena de H
2
O
2
a
capacidade de se adaptarem presena deste agente atravs da aquisio de resistncia. Foi
visto que clulas expostas a doses subletais de H
2
O
2
(150 M H
2
O
2
em estado estacionrio
durante1590min)conseguemadaptarseaexposiesposteriorescomdosesletais(700M
H
2
O
2
em estado estacionrio durante 60 min) atravs da aquisio de resistncia. Isto
reflectido numa maior velocidade de sobrevivncia das clulas quando expostas a
concentraesletaisdomesmoagente(Pedroso,2008).
Na levedura S. cerevisiae a resposta adaptativa ao stress oxidativo baseiase
principalmente no aumento da expresso dos enzimas que catalisam a eliminao do H
2
O
2
e
dos sistemas responsveis pela reparao dos danos induzidos pelo H
2
O
2
(Pedroso et al.,
2009). Porm, foi recentemente demonstrado que, durante a adaptao de clulas de S.
cerevisiae ao H
2
O
2
, h tambm uma diminuio da permeabilidade da membrana plasmtica
aoH
2
O
2
,limitandooinfluxodesteagente(Brancoetal.,2004).Aalteraodapermeabilidade
ocorre rapidamente durante a adaptao e acompanhada por um decrscimo da fluidez da
membrana (Folmer et al., 2008). Portanto, a diminuio da permeabilidade da membrana
associadaaoaumentodaactividadedosenzimasqueremovemoH
2
O
2
,levaaumaumentodo
gradientedeH
2
O
2
atravsdamembrana(Brancoetal.,2004).
De forma a entender o mecanismo que modula o decrscimo da permeabilidade da
membranaaoH
2
O
2
,averiguousequaisoscomponentesnamembranaplasmticaquepodem
serresponsveispelasalteraesobservadas.FoiobservadoqueaadaptaoaoH
2
O
2
modula
rapidamente a expresso de genes que codificam para enzimas envolvidos na via de
biossntesedoergosterol (ERG1, ERG3,ERG7, ERG25,ERG6)enometabolismolipdico (ELO1,
23
ELO2,ELO3,OLE1,FAS1,FAS3,LAC1,LIP1,GPT2)(Quadro1).Verificousetambmquehuma
alterao do perfil lipdico da membrana plasmtica: a adaptao das clulas ao H
2
O
2
leva a
umaredistribuiodosdomniosricosemesteroleaumaumentodosdomniosordenadosda
membranaplasmtica(Pedrosoetal.,2009).
Um dos genes cuja expresso se encontra reprimida nos instantes iniciais aps
exposio a doses adaptativas de H
2
O
2
o gene FAS1 (Pedroso, 2008) que codifica para a
subunidade do sintase de cidos gordos (FAS), cuja regulao objecto de estudo do
presentetrabalho.
Quadro 1 A adaptao ao H
2
O
2
altera a expresso de genes que codificam enzimas envolvidos na via de
biossntesedoergosterolenometabolismolipdico.Adaptadode(Pedroso,2008).
ExpressodemRNAaolongodaadaptaoao
H
2
O
2
FoiobservadoqueoH
2
O
2
reprimeaexpressodogeneFAS1em1,5xaps15minde
exposio a 150 M de H
2
O
2
em estado estacionrio, havendo uma recuperao para os
valoresiniciaisaps60mindeadaptao.AdeterminaodosnveisdemRNAdogeneFAS1
porNorthernblotconfirmouestesresultados(Matiasetal.,2007).Essesnveisdiminuramem
90 e 80% relativamente aos nveis controlo aps exposio a 150 M H
2
O
2
durante 15 e 30
min, respectivamente, regressando aos valores controlo aps 60 min de exposio. Foi
demonstradopelaprimeiravezqueoFAStemumpapelimportantenarespostacelulardaS.
cerevisiae ao H
2
O
2
, visto que durante a adaptao destas clulas a 150 M em estado
estacionriodeH
2
O
2
houveumdecrscimotantodaexpressocomodaactividadeFAS. Mais
relevanteaindafoiofactodequeadiminuiodaactividadeFASem50%,atravsdedeleco
deumdosalelosFAS,aumentouaresistnciadasclulasadosesletaisdesteagente(Matiaset
al.,2007).
OsmecanismospelosquaisodecrscimodaexpressodoFASlevaaumaumentoda
resistncia ao H
2
O
2
ainda no foram completamente elucidados. No entanto, verificouse um
aumentodosnveisdecidosgordosdecadeiamuitolonga(VLCFA)namembranaplasmtica,
sugerindo que estes cidos gordos podem diminuir a permeabilidade da membrana ao H
2
O
2
,
conferindoassimumamaiorresistnciaaesteagente(Matiasetal.,2007).
25
II. OBJECTIVOS
26
a)OH
2
O
2
induzoaumentodosnveisdeinositol
Abordagem experimental: Determinao dos nveis de inositol em clulas controlo e
submetidasadosesadaptativasdeH
2
O
2
recorrendoaummtodoespectrofotomtrico
b) O H
2
O
2
, atravs do aumento dos nveis de inositol, induz a translocao da Opi1p para o
ncleo
Abordagemexperimental:AnlisedatranslocaonucleardofactorGFPOpi1p,napresenae
ausnciadeH
2
O
2
pormicroscopiadefluorescncia
c) O H
2
O
2
, atravs do aumento dos nveis de inositol, leva a uma alterao do perfil
fosfolipdicoglobal
Abordagemexperimental:Quantificaodosnveisdefosfolpidostotaisemclulascontroloe
tratadascomH
2
O
2
,porTLCbidimensional
d) O aumento dos nveis de inositol induzido pelo H
2
O
2
leva alterao da expresso de
vriosgenes
Abordagem experimental: Quantificao de diversos transcritos regulados pelo inositol por
PCRquantitativoemtemporeal(realtimeQPCR)
27
III. MATERIAISEMTODOS
III.1. Materiais
A Bacto peptona, o YNB (Yeast Nitrogen Base), o Bacto agar e o extracto de levedura
foram adquiridos da Difco (Detroit, MI, EUA). A glucose e o perxido de hidrognio foram
obtidosdaMerck(WhitehouseStation,NJ).Ocatalase(defgadodebovino),oglucoseoxidase
(de Aspergillus niger), o cloreto de iodonitrotetrazlio (INT), o mioinositol desidrogenase (de
Enterobacter aerogenes), o diaforase (de Clostridium kluyveri), o hexocinase, os aminocidos
do meio de crescimento, o fluoreto de fenilmetilsulfanilo (PMSF), o NAD, o trifosfato de
adenosina disdico (ATP2Na), o Triton X100 e o reagente de Folin foram obtidos da Sigma
Aldrich (St Louis, MO, EUA). As placas de slica gel 20 cm x 20 cm para TLC e a resina Dowex
50W200400meshforamobtidasdaFluka(StLouis,MO,EUA).Amembranadeseparaode
fases 1PS foi obtida da Whatman (Kent, UK). A membrana TYPE HA 0,45 m do sistema de
vcuo para recolha das clulas foi obtida da Millipore (Billerica, MA, USA). O kit de extraco
deRNAtotaldeS.cerevisiaefoiadquiridoAmbion(Austin,TX,USA).ADNaseIeokitparaa
sntese da primeira cadeia de cDNA RevertAid
TM
H Minus Reverse Transcriptase foram
adquiridos Fermentas (Maryland, USA). O Brilliant SYBR Green Masater Mix para
amplificaoemPCRquantitativoemtemporealfoiobtidodaStratagen(Kirkland,MA,USA).
III.2. Materialbiolgico
Quadro2EstirpesdeS.cerevisiaeutilizadasnotrabalhoexperimental.
Designao Estirpe Gentipo
wt(haplide) Y00000 BY4741;MATa;his31;leu20;met150;ura30
opi1 Y00943 BY4741;MATa;his31;leu20;met150;ura30;YHL020c::kanMX4
III.3. MtodosExperimentais
III.3.1. CondiesdeCrescimento
O crescimento das culturas foi realizado em meio Sinttico Completo (SC Synthetic
Complete) (Branco et al., 2004). O meio SC constitudo por glucose 2% (m/v), YNB 6,85%
(m/v), aminocidos e bases Triptofano 0,005% (m/v), Histidina 0,01% (m/v), Leucina 0,01%
(m/v), Adenina 0,0025% (m/v), Uracilo 0,0025% (m/v), Treonina 0,02% (m/v), Serina 0,04%
(m/v), Arginina 0,002% (m/v), Metionina 0,002% (m/v), Tirosina 0,003% (m/v), Isoleucina
0,003% (m/v), Lisina 0,003% (m/v), Fenilalanina 0,005% (m/v), Valina 0,015% (m/v), cido
Asprtico0,01%(m/v),cidoGlutmico0,01%(m/v).Assoluesnecessriasparaobtereste
meio foram autoclavadas a 120 C durante 20 min (YNB e glucose), ao passo que as solues
deaminocidosforamautoclavadasa110Cdurante20min.
ParaoarmazenamentofoiusadomeioYPDslido,feitoapartirdemeioYPpeptona
2% (m/v); extracto de levedura 1% (m/v) suplementado com Bacto agar 2% (m/v) e glucose
2% (m/v). O armazenamento foi feito: a) em placas com meio YPD slido, a 4 C (com um
mximo de duas passagens para uma nova placa a cada 20 dias); b) em suspenso numa
soluodeglicerol20%(v/v),a80C.
O crescimento das clulas foi feito em meio lquido, a 30 C e 160 rpm num agitador
orbital.Osestudosforamefectuadoscomculturasemfasedecrescimentoexponencialapsa
ocorrncia de pelo menos dois ciclos de duplicao, feitas a partir de prculturas com 1416
horasdecrescimento.Asleiturasdedensidadepticadasculturasforamefectuadasa600nm
(OD
600
)numespectrofotmetroBeckmanDU68(1OD
600
~2x10
7
clulas).
29
III.3.2. CurvasdeCrescimento
Foi necessrio realizar um estudo do perfil de crescimento das estirpes (wt, opi1,
opi1 + GFPOpi1p), conseguido atravs da realizao das suas curvas de crescimento. Este
procedimentofoinecessrioparasepoderdeterminarotempoqueasculturasdemoravama
atingirasdiferentesfasesdecrescimento.
Paracadaestirpeasculturasforaminoculadasa0,03OD
600
/mL,colocadasacrescera
30Ce160rpmnumagitadororbital,eefectuadasleiturasdedensidadeptica(OD)a600nm
emintervalosdetemporelativamentecurtos(1hou1h30).
III.3.3. DeterminaodasconstantesdeconsumodeH
2
O
2
pelasclulas
determinadofazendoarazoentrek(min
1
)eaOD
600
/mLaqueaculturaseencontranoincio
doensaio(Equao2).
Consumo ue B
2
0
2
(min
-1
. (0BmL)
-1
) =
k (mIn
-1
)
OD
600
mL
Equao2
III.3.4. Adaptaodasclulasa150MdeH
2
O
2
emestadoestacionrio
AadaptaodasclulasaoH
2
O
2
foiinduzidaporexposiodasclulasaumadosesub
letal de 150 M de H
2
O
2
em estado estacionrio, durante 1590 min (Branco et al., 2004). A
adaptao iniciouse com as clulas em fase de crescimento exponencial (0,15 OD
600
/mL)
(1OD
600
=23x10
7
clulas).
Para a criao do estadoestacionrio adicionouse, simultaneamente, 150 M H
2
O
2
e
o enzima glucose oxidase s clulas em cultura, de modo a que a velocidade de produo de
H
2
O
2
por parte do glucose oxidase igualasse a velocidade de consumo de H
2
O
2
pelas clulas.
Destemodo,consegueseumaconcentraodeH
2
O
2
constantenodecorrerdosensaios.
Foi efectuada a quantificao do H
2
O
2
presente nas culturas ao longo do tempo de
adaptao, com o intuito de confirmar a criao do estado estacionrio concentrao de
H
2
O
2
pretendida.
Como ao longo do tempo dos ensaios a densidade ptica da cultura vai aumentando,
significando um maior nmero de clulas, o consumo de H
2
O
2
cada vez mais acentuado.
Portanto,aconcentraodeH
2
O
2
naculturavaidiminuindo,peloquenecessrioreportanto
o H
2
O
2
como o glucose oxidase. Os volumes de H
2
O
2
e de glucose oxidase adicionados
inicialmenteparaoestabelecimentodoestadoestacionrioassimcomoosacertosnecessrios
nodecorrer dotempodeadaptaoforamcalculadosapartirdadensidade pticadacultura
noinciodaadaptao,daactividadedoglucoseoxidaseedaconstantede consumodeH
2
O
2
pelasclulas,determinadasexperimentalmente.
AactividadedoglucoseoxidasefoideterminadaemmeioSC,seguindoaproduode
H
2
O
2
peloenzimaaolongodotempo.Oensaiofoifeitoem10mLdemeiodeculturaaoqual
foram adicionados 50 L de uma soluo de glucose oxidase 0,0531U diluda 1000x.
Assumindo uma reaco de primeira ordem, a actividade em M/min corresponder ao
declive da recta ajustada aos pontos do grfico da [H
2
O
2
] (M) vs. tempo (min). Tendo em
consideraoosvolumesdoensaio(meiodeculturaesoluodeglucoseoxidase)calculouse
aactividadeespecficadoenzimaemmol/min/L.
31
Asdeterminaesdaconcentraode H
2
O
2
foramefectuadasnumelctrododeClark
(HansatechInstruments,UK),comoexplicadoemIII.3.3.
III.3.5. TranslocaodofactornuclearGFPOpi1p
III.3.5.1. Obtenodostransformantesopi1+GFPOpi1p
Atransformaodasclulasopi1foiefectuadadeacordocomomtododescritopor
Ito e colaboradores (Ito et al., 1983). A transformao foi feita a partir de uma prcultura
opi1 com 1416h de crescimento, colocada a crescer a 30 C, com agitao a 160 rpm.
Recolheuse 1 mL dessa prcultura para um tubo eppendorf de 1,5 mL. Aps centrifugao
durante 2 min a 3000 rpm (centrfuga Eppendorf 5415), lavouse o sedimento de clulas com
500Ldeguaestril.Apsnovacentrifugao,ressuspendeuseosedimentodasclulasem
500LdeumasoluoTE/LiAc(Acetatodeltio0,1M;TrisHCl10mM,pH8,0;EDTA1mM).
Deixouseasuspensoobtidaa4Cdurante1hora.Paracadatransformaopreparouse,em
tubos eppendorf de 1,5 mL, a mistura de reaco de transformao contendo 50 L de
suspenso celular, 5 L (~100 g) do DNA plasmdico (pTL212), 5 L de DNA carrier (25 g)
previamente desnaturado na placa trmica a 90 C durante 2 min, e 300 L de uma soluo
LiAc/TEcomPEG40%(m/v).Apsincubaoa30C,durante30mincomagitaoa160rpm,
a mistura de reaco de transformao incubou a 42 C durante 20 min. No final desta
incubao colocouse a mistura reaccional a 4 C, durante 30 min. Por fim, centrifugouse a
7000rpmnacentrfugaEppendorf5415durante2min.Osedimentoobtidofoiressuspendido
em100Ldeguaestrileplaqueadoemplacascommeiosintticosemuracilo(SCUra
).As
placasforaminvertidasedeixadasdurantecercade3diasa30C.
III.3.5.2. VisualizaodatranslocaoporMicroscopiadefluorescncia
Preparouseumaculturadaestirpeopi1+GFPOpi1p,inoculando25mLdemeioSC
Ura
III.3.6.1. Extracodoslpidostotais
OslpidostotaisdasclulasdeleveduraS.cerevisiaeforamextradosdeacordocomo
mtodo descrito por Folch e colaboradores (Folch et al., 1957), a partir de 25 OD totais de
clulasdecadaumadasamostras.InoculousemeioSCapartirdeumaprculturadaestirpe
wt,aumadensidadecelularde0,03OD
600
/mLerecolheuseasclulasa0,15OD
600
/mL,aps
vriostemposdeadaptaocom150MdeH
2
O
2
ousemadaptao.Asclulasequivalentesa
500 mL de cultura foram recolhidas com o auxlio de um sistema de vcuo, atravs de uma
membranaMilliporeTYPEHA0,45m.Apsfiltrao,asclulasfiltradasforamressuspendidas
emcercade20mLdeumasoluotampodefosfatosdepotssio0,1M,pH7,4(TFK0,1MpH
7,4),passandoasuspensocelularparatubosfalconde50mLecentrifugandoa4000rpm,1
min (centrfuga Sigma 302). Os sedimentos celulares obtidos foram congelados em azoto
lquido e guardados a 80 C at se proceder extraco dos lpidos totais.Para a extraco
dos lpidos totais, os sedimentos celulares foram ressuspendidos num total de 30 mL de
tampo TFK 0,1M pH 7,4. Transferiuse os ressuspendidos para um tubo do rotor JA20
(centrfugaBeckmanJ221M/E)ecentrifugousea8000rpm(5000xg),10min.Adicionouse
aosedimento1,5mLdesoluotampoTFK0,1MpH7,4,2volumesdeglassbeadse15lde
PMSF. Vortexouse 3x durante 2 min, alternando com colocao no gelo. Diluiuse 2x
(adicionando3mLdetampoTFK)emisturousenovortex.Centrifugousea2500rpm(530x
g),20min,norotorJA20.
Apsesteprocesso,recolheuseosobrenadanteparaumaprovetaesmeriladade100
mL, medindo o volume exacto de extracto recolhido, de forma a procederse extraco de
33
III.3.6.2. SeparaodoslpidosporTLCbidimensional
Oslpidos totaisforamanalisadosporTLCbidimensionaldeacordocomomtodode
Connerthecolaboradores(Connerthetal.,2009).Activouseumaplacadeslicagel20cmx20
cmparaTLC(Fluka99570)numaestufaa110Cdurante30min.Ressuspendeuseoextracto
lipdicoem100Ldeclorofrmio:metanol(1:1).Aplicouse80Ldoextractonocantoinferior
esquerdo da placa com a ajuda de um capilar de vidro. Guardouse os restantes 20 L para
quantificao de fosfatos totais. Desenvolveuse o cromatograma na primeira dimenso
usando o sistema de eluentes clorofrmio:metanol:amnia (65:35:5). Retirouse a placa da
cmara de eluio e deixouse secar muito bem ao ar na hotte. Rodouse a placa 90 para a
esquerda e desenvolveuse o cromatograma na segunda dimenso usando o sistema de
solventes clorofrmio:acetona:metanol:cido actico:gua (50:20:10:10:5). Aps secagem da
placa revelouse por exposio a iodo. Marcouse as manchas correspondentes aos vrios
fosfatoscomoauxliodeumlpisdeTLC,paraposteriorrecuperaodaplaca.
III.3.6.3. Quantificaodosfosfatos
OsnveisdefsforonosfosfolpidosseparadosporTLCforamdeterminadosusandoo
ensaio de Bartlett (Dittmer and Wells, 1969). Retirouse as pores de slica onde se
34
III.3.7. QuantificaodosextractosproteicospeloMtododePeterson
35
III.3.8. PCRquantitativoemtemporeal(RealtimeQPCR)
36
III.3.8.1. PreparaodoRNAtotaldaleveduraS.cerevisiae
A preparao do RNA total foi feita usando o kit da AMBION para extraco de RNA
totaldeleveduraS.cerevisiae,deacordocomoprotocolodosfornecedores.
O RNA total foi preparado a partir de 75 mL de cultura a 0,15 OD
600
/mL em fase
exponencialdecrescimento,semoucomadaptaodasclulasa150MdeH
2
O
2
emestado
estacionrio. As clulas foram recolhidas por centrifugao a 4 000 rpm, durante 1 min,
temperaturaambiente,nacentrfugaSigma302.Apslavagemdosedimentocomguaestril
epassadoparaumtuboeppendorf,foicongeladocomazotolquidoeguardadoa80C.
Ao tubo com o sedimento de clulas adicionouse as seguintes solues, pela ordem
apresentada: 480 L da soluo de lise, 48 L de SDS 10% (m/v) e 480 L da soluo
fenol:clorofrmio:lcool isoamlico, sendo as clulas completamente lisadas aps a adio de
750LdebeadsZirconiaeagitadasnumvortexdurante10min.Seguidamente,centrifugouse
a suspenso celular a 16 000 x g durante 5 min temperatura ambiente na centrfuga
EppendorfminiSpinetransferiuse400Ldafaseaquosaparatubosfalconfrescosde15mL.
Adicionouse 1,4 mL de tampo de ligao fase aquosa, misturouse bem e de seguida
adicionouse940Ldeetanolabsoluto.Aplicouse700LdamisturaaoFilterCartridgejunto
ao tubo de recolha e centrifugouse durante 0,5 1 min velocidade mxima na centrfuga
EppendorfminiSpinatamisturapassarpelofiltro.Deitouseforaoeludoerepetiusetodoo
processoatacabarasoluo.Porfim,lavouseofiltrocom700Ldesoluodelavagem1e
centrifugouse durante 1 min, nas mesmas condies. Lavouse o filtro 2x com 500 L da
soluodelavagem2/3.Centrifugousedurante1minpararemoveroexcessodesoluode
lavagem.ORNAfoieludodoFilterCartridgeparaumtuboderecolhanovo,aplicando2x50
Ldesoluodeeluioaquecidaecentrifugandodurante1minentrecadaaplicao.
A quantificao do RNA efectuouse recorrendo ao sistema de quantificao
NanoDrop.
III.3.8.2. TratamentocomDNaseI
Para remover o DNA genmico contaminante que pudesse ainda estar presente no
extracto de RNA, fezse um tratamento com DNase I (Desoxirribonuclease I) que degrada
ssDNAedsDNAnodesejado.
37
III.3.8.3. AmplificaodeumasequnciadecidosnucleicosporPCR
A ausncia de DNA nas amostras tratadas com DNase I foi confirmada aps uma
reacodeamplificaoporPCRusandoumpardeprimersqueapenasamplificamsequncias
de DNA. Escolheuse a sequncia do gene ZWF1, que codifica para o 6fosfato de glucose
desidrogenase,paraaconfirmaoanterior.
Quadro3SequnciasnucleotdicasdosprimersutilizadosparaasreacesdeamplificaoPCRdofragmentodo
geneZWF1.
Gene
Nome
primer
Tamanho
primer(nt)
T
m
(C) Sequncia(53) Tamanhodofragmento
amplificado(pb)
ZWF1
ZWF1F
ZWF1R
21
22
66
66
CCAGAGGCTTACGAGGTGTTG
GGGTGCTTTTCGGGCATAACAT
227
III.3.8.5. AnliseporPCRquantitativoemtemporeal(RealtimeQPCR)
O cDNA obtido no ponto anterior foi analisado por PCR quantitativo em tempo real
(Realtime QPCR) usando o termociclador Mx3000P QPCR e o software MXPRO
TM
QPCR
(Stratagene, LaJolla, CA). No Quadro 4 encontramse as sequncias nucleotdicas dos primers
39
utilizadosparaaquantificaodaexpressodosgenesemestudo.Assequnciasdosprimers
foramdeterminadasutilizandoosoftwarePrimerExpress3.0.
Quadro4SequnciasnucleotdicasdosprimersutilizadosparaasreacesdeamplificaoporPCRquantitativo
emtemporeal.
Gene
Nome
primer
Sequncia
(53)
URA7
URA7F
URA7R
ATTTAGGCAAAACCGTGCAAA
CCACGCGCTCAATCCAAT
GPT2
GPT2F
GPT2R
TTCTCATGACCGTCCTTCGTT
ACTGCGCCCAGAGCCATA
INM1
INM1F
INM1R
ACCGTGATTACTGATGATCCTACCT
CGCCTACTACGGGCTCTTTG
INO1
INO1F
INO1R
TGGACGAGTATTACAGTGAGTTGATG
AGCCAGTAAAGAATCTTCGCAAA
PIS1
PIS1F
PIS1R
GTTTCCCTGGTTACGTGTTCAAG
TGGCATCGTTGTCTGCTAAAA
ITR1
ITR1F
ITR1R
TGTCATTGGCGCAATCTTACA
ACCGAAACCCATGATCAGTCTAC
U2
U2F
U2R
GCTTTCTGTTTCTCCCTTAGTTTGG
AATCCCGCGTTGGACATAAA
CDS1
CDS1F
CDS1R
CCACCTCAAAGGCGATTGA
CGGCGTGACGGATTCG
CHO1
CHO1F
CHO1R
CATTAAGCAGAAGGGCCTCAA
TGATGTTCGTCACTTGTAAATTTTTG
INO2
INO2F
INO2R
GCAGATGTGCCAACTGAGTTCA
GGCGGGTTGTAGTGGTCATT
AsreacesdeamplificaodecorreramnapresenadeBrilliantSYBRGreenMasater
Mix (Stratagene), num aparelho de PCR Applied Biosystems 7900HT Fast RealTime PCR
System,segundooesquemaapresentadonoQuadro5.
40
Quadro5ProgramadeamplificaoutilizadonasreacesdeamplificaoporPCRquantitativoemtemporeal.
Etapa Programadeamplificao
Activaodoenzima 95C,10min
Amplificao (95C,15seg;60C,60seg)x40ciclos
Finalizao 4C
A quantificao dos nveis de mRNA foi feita com o auxlio do SDS Software 2.3 da
AppliedBiosystems,tendoosvaloressidonormalizadosrelativamenteaosnveisdetranscrito
U2naamostra(controlointerno).
III.3.9. DoseamentodoInositolIntracelular
III.3.9.1. Obtenodeextractostotais
celularesforamclarificadosporcentrifugao:2min,3500rpm, 4C(centrfugaSigma4K10
refrigerada Rotor eppendorf 5804 R); transferiuse os sobrenadantes para novos tubos
eppendorferecentrifugousedurante15mina12000rpmnamesmacentrfuga.Recolheuse
ossobrenadanteseconservousea4C.Doextractoobtido,retirouseumaalquotade50L
paraquantificaoproteicapelomtododePeterson.
III.3.9.2. Tratamentodoextractocelular
III.3.9.2.1. Precipitaodaprotena
Deformaaeliminartoda aprotenadasamostras,procedeuseaotratamentodestas
com cido perclrico de acordo com o mtodo descrito por Ashizawa e colaboradores
(Ashizawaetal.,2000).
Tendo em conta que para cada ensaio so precisos um branco e trs replicados (4
amostrasnototal),parasaberovolumedeextractoasubmeteraotratamentodeformaaque
acadaumadasamostrascorrespondessem1500gdeprotena,procedeuseprimeiramente
quantificao proteica pelo Mtodo de Peterson. Esta massa de protena foi calculada de
forma a terse uma quantidade de inositol possvel de ser medida pelo mtodo de Ashisawa,
dadoqueasensibilidadedomtodomuitobaixa(>2nmoldeinositol).
Cada125Ldeamostra(ondesecompletacomguaaalquotadeextractorecolhida
equivalente a 1500 g de protena) foram desproteinizados com 125 L de cido perclrico
16%(p/v),sendotudocentrifugadoa5000xgdurante10min,a4C(centrfugaSigma4K10
refrigerada Rotor eppendorf 5804 R). Os sobrenadantes foram neutralizados com 65 L de
K
2
CO
3
2Mecentrifugadosnovamente.
III.3.9.2.2. CromatografiadeTrocaInica
Antesdaprimeirautilizao,ascolunasforamlavadascomgua(aproximadamente5
vezesovolumetotaldacoluna).
As amostras desproteinizadas foram diludas em 5 mL de gua estril e aplicadas a
umacolunadetrocainica(contendoaproximadamente2mLderesinaDowex50W200400
mesh),tendoserecolhidooeludo.Lavouseacolunacom10mLdeguaestrilerecolheuse
novamenteoeludo.Asamostrasforamconservadasa4C.
III.3.9.2.3. Liofilizao
III.3.9.2.4. Remoodainterfernciadaglucose
III.3.9.3. Mtodoenzimticoespectrofotomtricodedoseamentodoinositol
formazan,reoxidandoseoNADH.Oformazanresultantemedidoespectrofotometricamente
a492nm(Figura11).
mioinositol mioinosose
MIDH
NAD
+
NADH
Formazan INT
Diaforase
44
Equao3
Abs
492nm
= (Abs
492nm ]nuI
-Abs
492nm ncuI
)
umostu
-(Abs
492nm ]nuI
-Abs
492nm ncuI
)
bunco
Aquantidadedeinositolnasamostras(nmolinositol/100gprotena)foicalculadapor
extrapolao dos valores de Abs
492nm
na curva de calibrao, efectuando as correces para
asdiluiesefectuadasecontabilizandoosgtotaisemcadaamostra.
III.3.10. Anliseestatstica
Osresultadosapresentadoscorrespondemmdia_desviopadrodenexperincias
independentes. A comparao de valores entre dois grupos distintos foi feita realizando o
testetdeStudentbilateral,assumindovarinciasiguaisentreosgrupos.Umvalordep<0,05
foi considerado estatisticamente significativo. Ambos os tratamentos foram realizados
recorrendoaoprogramaSigmaStatverso3.5.
45
IV. RESULTADOSEDISCUSSO
reprime a expresso do gene FAS1 por induo dos nveis de inositol. , portanto, essencial
quantificarosnveisdeinositolemclulascontroloeexpostasadosesadaptativasdeH
2
O
2
,no
sentido de observar se, de facto, o H
2
O
2
induz o aumento dos nveis de inositol
intracelularmente.
OsnveisdeinositoljforammedidosemS.cerevisiae(Azabetal.,2007),pelomtodo
fluorimtrico de Maslanski e Busa (Maslanski and Busa, 1990). No entanto, surgiram diversos
problemas para o reproduzir, nunca tendo sido obtidos resultados reprodutveis (ver IV.4.1).
Portanto, optouse pela optimizao de um mtodo espectrofotomtrico. Como houve uma
sriedeproblemas,tendoseconseguidoresultadosreprodutveisapenasnofinaldotrabalho
experimental,duranteaduraodoprojectoforamsidoadiantadastodasasrestantesetapas
propostas.
Assim, a ordem de trabalhos proposta nos objectivos foi alterada. So, portanto,
apresentados primeiramente os resultados referentes translocao da protena Opi1p do
retculo endoplasmtico para o ncleo das clulas quando submetidas a 150 M de H
2
O
2
em
estadoestacionrio.Seguidamente,osresultadosrelativosquantificaodosfosfolpidose
expresso dos diversos transcritos regulados pelo inositol. Finalmente, os resultados
respeitantes ao doseamento do inositol, sendo inicialmente feita uma breve descrio da
optimizaodomtodo.
IV.1. TranslocaonucleardofactorGFPOpi1p
endoplasmtico.Quandoasclulasforamsujeitasaumadosede100Mdeinositolobservou
seoaumentodaintensidadedefluorescncianoncleodasclulascomoaumentodotempo
deincubao.
O objectivo desta etapa do trabalho foi observar o mesmo tipo de translocao, mas
submetendo as clulas da estirpe opi1 + GFPOpi1p no a um aumento da dose de inositol
mas sim a uma dose de 150 M de H
2
O
2
em estado estacionrio, com o intuito de apoiar a
hiptese de que o H
2
O
2
induz o aumento dos nveis de inositol no interior das clulas.
importante referir que no presente trabalho experimental as clulas cresceram sempre na
presenade11Mdeinositol.
IV.1.1. Caracterizaodasestirpeswt,opi1eopi1+GFPOpi1p
OD
600
/mL) aos da estirpe wt quando atinge a fase estacionria, enquanto a estirpe opi1 +
GFPOpi1patingevaloresinferiores(2,9OD
600
/mL),estatisticamentediferentesdosdaestirpe
wt(Figura12).
Figura12Representaodascurvasdecrescimentodasestirpeswt,opi1eopi1+GFPOpi1p.Representao
grficadeOD
600
/mLvs.tempo(min)paraasestirpes: estirpewt; estirpeopi1; estirpeopi1+GFPOpi1p.
Para cada ensaio foram inoculadas culturas a 0,03 OD
600
/mL (1 OD
600
/mL ~ 2 x 10
7
clulas/mL), a partir de pr
culturas,colocadasacrescera30Ce160rpmnumagitadororbital,sendooseucrescimentoseguidomedindoa
densidadepticaa600nm.Ospontosexperimentaiscorrespondemmdia_desviopadrodasleiturasobtidas
emcincoexperinciasindependentes.Foiconsideradoestatisticamentesignificativoumvalordep<0.05.
AtravsdalinearizaodosvaloresdeOD
600
/mLvs.tempo(min)foramdeterminadosa
taxa de crescimento especfico () e o tempo de gerao (t
g
) a partir da fase exponencial de
crescimento, para as trs estirpes. Os valores calculados para as diferentes estirpes
encontramseapresentadosnoQuadro6erepresentadosgraficamentenaFigura13.
Quadro6Valoresde(taxadecrescimentoespecfico)et
g
(tempodegerao)calculadosparaasestirpeswt,
opi1 e opi1 + GFPOpi1p, a partir das respectivas curvas de crescimento. Os resultados apresentados
correspondem mdia _ desvio padro de cinco experincias independentes. Foi considerado estatisticamente
significativoumvalordep<0.05.
(min
1
) t
g
(min)
wt 0,00759_0,000617 91,810_6,839
opi1 0,00651_0,000639 107,196_9,813
opi1+GFPOpi1p 0,00597_0,000560 116,927_10,708
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 500 1000 1500 2000
O
D
6
0
0
/
m
L
Tempo (min)
48
A B
Figura13Representaogrficadosvaloresdetaxadecrescimentoespecficoetempodegeraocalculados
paraasestirpeswt,opi1 eopi1 +GFPOpi1p.Representaogrficadosvaloresde(A)(taxadecrescimento
especfico) e (B) t
g
(tempo de gerao) calculados para as estirpes wt, opi1 e opi1 + GFPOpi1p, com base nas
respectivas curvas de crescimento. Os resultados apresentados correspondem mdia _ desvio padro de cinco
experinciasindependentes.*p<0.05vs.wt.
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
wt opi1 opi1+GFP-Opi1p
(
m
i
n
-
1
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
wt opi1 opi1+GFP-Opi1p
t
g
(
m
i
n
)
49
Paraestabeleceroestadoestacionriode150MdeH
2
O
2
foinecessriodeterminara
constantedeconsumodeH
2
O
2
pelasclulasintactaseaactividadedoenzimaglucoseoxidase
nomeiodecultura,demodoqueaproduodeH
2
O
2
peloglucoseoxidaseigualeoconsumo
pelasclulas.
Desta forma, comeou por determinarse a actividade do enzima glucose oxidase no
meiodecultura(meioSC)parasaberqualaquantidadenecessriaaadicionarsculturaspara
contrabalanaroconsumodeH
2
O
2
pelasclulas.
IV.1.2.1. Actividadedoenzimaglucoseoxidase
mol/min/L.
IV.1.2.2. ConsumodeH
2
O
2
pelasclulasintactas
A determinao do consumo de H
2
O
2
pelas clulas intactas foi feita de acordo com o
procedimentoreferidoemIII.3.3.Osvaloresdasconstantedeconsumok(min
1
)edeconsumo
de H
2
O
2
(min
1
.(OD/mL)
1
) obtidos, considerando a normalizao referida encontramse
apresentadosnoQuadro7erepresentadosnaFigura14.
Analisando os valores de consumo de H
2
O
2
para as estirpes wt, opi1 e opi1 + GFP
Opi1p, apresentados no Quadro 7 e representados na Figura 14, pode observarse que as
clulas mutadas opi1 consomem H
2
O
2
a uma velocidade menor, o que pode ser justificado
pelaintroduodamutao,queinterferecomometabolismocelular,nomeadamentecomo
metabolismo dos fosfolpidos. Relativamente estirpe opi1 + GFPOpi1p esperarseia, mais
uma vez, observar um comportamento semelhante ao da estirpe wt, o que no se verificou
possivelmente devido ao facto de as clulas estarem transformadas com plasmdeo no
50
integrativomulticpia,estandopresenteumaconcentraodaprotenaOpi1pmaiorque nas
clulas controlo, o que pode estar a influenciar negativamente, por exemplo, o metabolismo
dealgunsfosfolpidos.
Quadro7ConsumodeH
2
O
2
(min
1
.(OD/mL)
1
)econstantesdeconsumok(min
1
)determinadosparaasestirpes
wt, opi1 e opi1 + GFPOpi1p. Os resultados do consumo de H
2
O
2
(min
1
.(OD/mL)
1
) correspondem media _
desvio padro de pelo menos trs experincias independentes considerando as OD/mL medidas no incio de cada
ensaio (varivel de dia para dia). As constantes de consumo k (min
1
) foram calculadas com base nos consumos
(min
1
.(OD/mL)
1
) considerando 0,15 OD
600
/mL como densidade celular representativa de todos os ensaios. Foi
consideradoestatisticamentesignificativoumvalordep<0.05.
wt opi1 opi1+GFPOpi1p
k(min
1
) 0,015 0,013 0,009
ConsumodeH
2
O
2
(min
1
.(OD/mL)
1
) 0,098 _ 0,009 0,089 _ 0,005 0,063_0,003
Figura14RepresentaodosvaloresdoconsumodeH
2
O
2
(min
1
.(OD/mL)
1
)paraasestirpeswt,opi1eopi1+
GFPOpi1p. Os resultados do consumo de H
2
O
2
(min
1
.(OD/mL)
1
) correspondem media_ desvio padro de pelo
menostrsexperinciasindependentes.*p<0,05vs.wt.
ApartirdadeterminaoexperimentaldoconsumodeH
2
O
2
pelasclulasintactaseda
actividadedoenzimaglucoseoxidaseemmeioSC,foramdeterminadososvolumesdeglucose
oxidase a adicionar s culturas de modo a contrapor o consumo de H
2
O
2
pelas clulas, no
sentidodeseestabelecerumestadoestacionriode150MdeH
2
O
2
.
emestadoestacionrio.Deformaaterseumanootemporaldatranslocaodaprotenado
retculo endoplasmtico para o ncleo das clulas foram recolhidas imagens a vrios tempos
deadaptao.
Paracadaensaio,antesdoinciodaadaptaodasclulasopi1+GFPOpi1p,foifeito
um controlo de autofluorescncia recorrendo estirpe opi1 no tido sido observada
fluorescnciaparaasclulasdestaestirpe(dadosnoapresentados).Relativamentesclulas
opi1+GFPOpi1pcontrolo,nosujeitasaincubaocomH
2
O
2
,foipossvelobservardeforma
clara a marcao apenas na periferia do ncleo (Figura 15A), indicando que a GFPOpi1p se
encontralocalizadaexternamentemembrananuclear.Quandosesubmeteuasclulasauma
dosede150MdeH
2
O
2
emestadoestacionrioobservouseumaumentodaintensidadede
fluorescncia no interior do ncleo com o aumento do tempo de incubao das clulas com
este
10 m
(Figu
fluore
15C).
fluore
eraj
a pro
quan
Figura
estado
(B) 10
indepe
das c
progr
de in
clula
obser
clula
ncle
da in
A
agente.Aos
min j come
ra 15B), se
escente nes
Aos 30 m
escentemen
bastantere
otena Opi1p
doexpostas
a 15 Microsco
o estacionrio.
0 min e (C) 20
endentes.
Para com
clulas quan
rama ImageJ
ntensidade d
a, passando
rvar dois pic
as controlo,
eo (Figura 16
tensidade d
A
5mindeinc
ou a observ
endo que o
te comparti
min j foi
te no ncleo
eduzido(dad
p est a des
aumadose
opia de fluores
(A) clulas co
0 min. As imag
mprovar que,
ndo exposta
J (Abramoff
de fluoresc
pelo ncleo
cos de inten
havendo um
6C). J para
e fluorescn
cubaoasd
varse uma
o mximo d
mento foi o
notria um
o, sendo que
dosnoapre
slocarse do
subletalde
scncia de clu
ntrolo (sem H
2
gens apresenta
, de facto, s
as ao H
2
O
2
,
et al., 2004
ncia ao long
o. Analisando
nsidade de f
ma quebra n
as clulas ex
ncia medid
B
diferenaso
grande qua
do nmero
observado ao
ma diminui
e aos 40 min
esentados).E
o retculo en
eH
2
O
2
emes
ulas opi1 + G
O
2
); clulas ex
adas so repre
e observou
fezse um
; Rasband, 1
go das clul
o os resultad
fluorescnci
otria da int
xpostas ao H
da que se ca
bservadasfo
ntidade das
de clulas
os 20 min d
o do n
n o nmero
Estesresultad
ndoplasmtic
tadoestacio
FPOpi1p cont
postas a 150
esentativas de
um aument
tratamento
1997) que po
las, traando
dos apresent
a localizado
tensidade de
H
2
O
2
aos 20
aminha do c
orampouco
s clulas ma
marcadas
de exposio
mero de c
de clulas c
dosapoiam
co para o n
onrio.
rolo e exposta
M H
2
O
2
em es
um conjunto
to da fluores
das imagen
ossibilita a a
o uma linha
tados na Fig
s na perifer
e fluorescn
min, observ
itoplasma p
C
notrias,ma
rcadas no n
com a pro
o ao H
2
O
2
(F
clulas mar
com esse fen
ahiptesed
cleo das c
as a 150 M H
2
stado estacion
de trs exper
scncia no n
ns recorrend
aquisio do
a que atrave
ura 16, po
ria do ncle
ncia no inter
ase um aum
ara a perife
0
52
asaos
ncleo
otena
Figura
rcadas
ntipo
deque
clulas
2
O
2
em
rio aos
rincias
ncleo
do ao
perfil
essa a
ossvel
eo nas
ior do
mento
ria do
m10
53
ncleo das clulas, sendo essa intensidade de fluorescncia observada na periferia do ncleo
mantida quando se atinge o ncleo, como pode observarse pelo patamar de intensidade de
fluorescnciarepresentadonaFigura16D.
Figura16Perfisdeintensidadedefluorescnciaaolongodasclulasopi1+GFPOpi1pcontroloeexpostasa
150MdeH
2
O
2
.Imagemdemicroscopiadefluorescnciade:(A)Clulascontrolo(semH
2
O
2
);(B)clulasexpostas
a 150 M H
2
O
2
em estado estacionrio aos 20 min. Perfil de intensidade de fluorescncia de: clulas
controlo (sem H
2
O
2
); clulas expostas a 150 M H
2
O
2
em estado estacionrio aos 20 min. Os resultados
apresentadossorepresentativosdeumconjuntodetrsexperinciasindependentes.
Aquando da visualizao das clulas ao microscpio notouse sempre uma certa
heterogeneidade em cada preparao, isto , algumas clulas com fentipo distinto daquele
observado para a maioria. No de estranhar esta heterogeneidade pois as clulas opi1 +
GFPOpi1pestotransformadascom umplasmdeonointegrativo,oquefazcomque possa
haverumnmerodiferentedeplasmdeosemcadaclulatransformada,logocomintensidade
de expresso diferente. Para uma melhor quantificao do fenmeno observado, em cada
preparao,clulascontroloeadaptadascomH
2
O
2
aos10e20min,foicontadoonmerode
clulas correspondentes aos vrios fentipos observados, tendose achado por bem distribu
los por trs categorias: (a) clulas marcadas apenas na periferia; (b) clulas marcadas no
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
d
e
f
l
u
o
r
e
s
c
n
c
i
a
1
0
1
0
(
u
n
i
d
a
d
e
s
a
r
b
i
t
r
r
i
a
s
)
Distncia (pxeis)
A
B
C
0m5
54
ncleo; (c) clulas aberrantes ou de fentipo duvidoso. Depois de uma anlise detalhada das
vrias imagens recolhidas e das contagens efectuadas, representouse graficamente a
percentagemdeclulascomosfentiposmaioritrios(aeb)relativamenteaototaldeclulas
contadas,paraasclulascontroloeclulassubmetidasa150MdeH
2
O
2
durante10e20min,
considerando sempre as clulas de fentipo minoritrio (c) para o total de clulas contadas.
ComopossvelobservarnaFigura17,quandonohexposioaoH
2
O
2
(controlo)amaioria
dasclulasencontrasemarcadaapenasnaperiferiadoncleo(70,2%),indicandoqueaOpi1p
se encontra associada ao retculo endoplasmtico. Aos 10 min esse nmero comea a decair,
observandoseumaumentodonmerodeclulasmarcadasnoncleo(62,6%),indicandoque
aOpi1pestatranslocarseparaestecompartimento.Aos20minapsaexposioaoH
2
O
2
a
maioria das clulas encontrase marcada no ncleo (78,4%), sendo residual o nmero de
clulas marcadas apenas na periferia (5,4%) (Figura 17). Para os vrios tempos observados, o
nmerodeclulasaberrantesouduvidosascorrespondeuaaproximadamente18%dototalde
clulasanalisadas.
Figura17Nmerodeclulasopi1+GFPOpi1pcomosfentiposmaioritrios,duranteaexposioa150M
H
2
O
2
emestadoestacionrio.controloclulascontrolo,noexpostasaoH
2
O
2
;10minclulasexpostasa150M
H
2
O
2
em estado estacionrio aos 10 min; 20 min clulas expostas a 150 M H
2
O
2
emestado estacionrio aos 20
min. Percentagemdeclulasmarcadasnoncleo; Percentagemdeclulasmarcadasapenasnaperiferia. Os
dados apresentados resultam de trs experincias independentes, tendo sido contado um total de 476 clulas
controlo,374clulasexpostasa150MH
2
O
2
aos10mine445clulasexpostasa150MH
2
O
2
aos20min.
m
e
r
o
d
e
c
l
u
l
a
s
(
%
)
55
indutor de um aumento dos nveis de inositol no interior das clulas sendo desencadeado,
posteriormente,estemecanismodetranslocao.
Comointuitodecompreendermelhorestaregulaotocomplexa,quantificouseos
nveistotaisdosvriosfosfolpidosemclulascontroloesujeitasa150MdeH
2
O
2
emestado
estacionrio, por TLC bidimensional. Os tempos de adaptao ao H
2
O
2
foram escolhidos de
acordo com os resultados da microscopia de fluorescncia. Na anlise da translocao da
Opi1p para o ncleo, foi visto que quando as clulas foram expostas a doses adaptativas de
H
2
O
2
, aos 10 min de adaptao j se observou um nmero significativo de clulas marcadas
fluorescentemente no ncleo, sendo que aos 20 min j a protena Opi1p se encontrava no
ncleo da maioria das clulas visualizadas. Foram, portanto, escolhidos os tempos de
adaptaode10e20minparaanlisedosnveisdefosfolpidos.Partindodopressupostoque
as alteraes que se pretendem observar nos nveis dos fosfolpidos ocorrem antes deste
mecanismodetranslocao,escolheuseotempode5mincomorefernciaparaasalteraes
ocorridasnosmomentosiniciaisdeexposioaoH
2
O
2
57
Quadro8Quantificaodosnveisdefosfolpidostotaisemclulaswtcontroloeexpostasa150MdeH
2
O
2
em
estadoestacionrio.CLcardiolipina;PEfosfatidiletanolamina;PAcidofosfatdico;PCFosfatidilcolina;PS
Fosfatidilserina;PIfosfatidilinositol.Osresultadosapresentadoscorrespondemmdia_desviopadrodepelo
menosseisexperinciasindependentes.Foiconsideradoestatisticamentesignificativoumvalordep<0.05.
nmolPi/mgprotena
Fosfolpidos
CL PE PA PC PS PI
Controlo 0,26_0,08 3,56 _ 0,51 0,48 _ 0,17 3,74 _ 0,46 0,79_0,12 4,37_0,53
Adaptao
150MH
2
O
2
5min 0,25_0,10 4,23 _ 1,32 0,69_ 0,19 3,71 _ 0,70 0,61_0,30 4,52_1,01
10min 0,24_0,21 3,03_ 0,36 0,46 _ 0,15 3,51 _ 0,92 0,60_0,36 3,79_0,59
20min 0,41_0,03 3,59_ 1,16 0,62_ 0,12 4,63 _ 1,29 0,94_0,24 4,50_1,17
Figura18Quantificaodosnveisdefosfolpidostotaisemclulaswtcontroloeexpostasa150MdeH
2
O
2
em
estadoestacionrio. Clulascontrolo; Clulasadaptadasa150MH
2
O
2
aos5min; Clulasadaptadasa
150 M H
2
O
2
aos 10 min; Clulas adaptadas a 150 M H
2
O
2
aos 20 min. CL cardiolipina; PE
fosfatidiletanolamina; PA cido fosfatdico; PC Fosfatidilcolina; PS Fosfatidilserina; PI fosfatidilinositol. Os
resultadosapresentadoscorrespondemmdia_desviopadrodepelomenosseisexperinciasindependentes.
Foiconsideradoestatisticamentesignificativoumvalordep<0.05.
P
i
m
g
p
r
o
t
e
n
a
Fosfolpidos
58
observouse tambm um aumento dos nveis deste fosfolpido aos 20 min de adaptao
(Figura 18), confirmando a tendncia para a manuteno desses nveis aumentados com o
tempo de adaptao das clulas ao H
2
O
2
. No que diz respeito aos nveis de PE foi observada
umadiminuioem46%destefosfolpidonamembranaplasmticaaos90mindeadaptao
aoH
2
O
2
,notendosidoobservadaamesmatendncianosnveistotaisdefosfolpidos(Figura
18).
interessante referir que as alteraes dos nveis de fosfolpidos induzidos pelo
inositol observadas por Gaspar e colaboradores (Gaspar et al., 2006) representam uma
situao em que as clulas crescem na presena de 75 M de inositol, sendo os nveis de
fosfolpidos destas clulas comparados aos de clulas que crescem na ausncia de inositol
(controlo). No presente estudo, as clulas crescem normalmente na presena de 11 M de
inositol,oquepodernofacilitaravisualizaodealteraesnosnveistotaisdefosfolpidos
aps o tratamento com 150 M de H
2
O
2
em estado estacionrio, podendo este tratamento
induzirapenaspequenasalteraesnosnveisdeinositol,noatingindoos75Mdeinositol
utilizadosnoestudoanterior.
Relativamente proporo de cada fosfolpido nas clulas controlo observouse, do
fosfolpidopresente em maiorquantidadeparaofosfolpidopresente em menorquantidade,
PI>PC>PE>PS>PA>CL(Figura18).Hquereferirqueestaordemnosealterouquandofoi
contabilizado o total de fosfolpidos em cada ensaio (dados no apresentados). Comparando
estesvalorescomosobtidosporIwanyshynecolaboradores(Iwanyshynetal.,2004),PC>PE
> PI > PS > PA > CL, possvel observar que h diferenas para os fosfolpidos presentes em
maior quantidade. No entanto, estas discrepncias podem ser explicadas analisando os
resultados apresentados por Daum e colaboradores (Daum et al., 1999), onde se observam
diferenasnasproporesdosvriosfosfolpidosemdiferentestiposdeclulas.Porm,estas
diferenas podem tambm ser justificadas pelas diferentes composies dos meios de
crescimento utilizados. No presente trabalho experimental, as clulas crescem num meio
sinttico (meio pobre) na presena de 11 M inositol. O meio de crescimento das clulas
utilizadoporIwanyshynecolaboradores(meiosinttico)totalmentedesprovidodeinositol.
No caso de Daum de colaboradores as clulas crescem num meio com 0,1M de inositol e
desprovidodecolina.Poroutrolado,asdiferenasobservadaspodemdeversesensibilidade
da tcnica que conduz a erros significativos (ver desviospadro na Figura 18). Se os desvios
padroforemtidosemconta,podedizersequeaquantidadedosfosfolpidosPC,PEePIso
equiparveis, s podendo fazerse uma comparao mais exacta aumentando o nmero de
replicadosexperimentais.
59
NoseguimentodosresultadosobtidosparaaanlisedatranslocaodaOpi1pparao
ncleo das clulas quando expostas a doses adaptativas de H
2
O
2
, e tendo esta protena uma
funo repressora da transcrio dos genes que possuem a sequncia UAS
INO
nos seus
promotores, determinouse os nveis de expresso de diversos transcritos regulados pelo
inositol.
Comointuitodeanalisaraexpressodevriosgenesquecodificamenzimasdasvias
desntesedosfosfolpidos,cujaexpressodealgunsdelessepensaestaralteradaemresposta
ao aumento dos nveis de inositol induzidos pelo H
2
O
2
, quantificouse vrios transcritos por
PCRquantitativoemtemporeal.
Para este estudo, foram seleccionados vrios genes potencialmente relevantes na
respostaaoH
2
O
2
.Deacordocomahiptesedetrabalhoproposta(oH
2
O
2
induzumaumento
deinositolnaclula),foramescolhidosgenesquepodemestarrelacionadoscomessepossvel
60
aumento. Os genes INO1 e INM1, cujos produtos esto envolvidos na sntese de novo de
inositolapartirde6Pglucose(Figura5),foramescolhidosdevidosuaimportncianasntese
endgena de inositol. O gene ITR1, que codifica para o transportador Itr1p, foi seleccionado
devidosuarelevncianomecanismodetransportedeinositoldoexteriorparaointeriorda
clula.OgeneINO2codificaparaofactordetranscrioIno2p,umdosfactoresqueseliga
sequncia UAS
INO
, que tal como se disse anteriormente uma sequncia regulada pelo
inositol.Aanlisedasuaexpressotambmdeextremaimportnciavistoestaraestudarse
os mecanismos moleculares da expresso do gene FAS1, um dos genes que possuem a
sequnciaUAS
INO
nassuasregiespromotoras.dereferirquequeroINO1,queroITR1,quer
oINO2,sogenesreguladospeloinositol.
Foram ainda seleccionados alguns genes relevantes nas vias de biossntese dos
fosfolpidos.OgenePIS1 estenvolvidonasntese dePIa partirdoinositoledeCDPDAG.O
gene GPT2 codifica o enzima 3fosfato de glicerol aciltransferase 2, importante na converso
de 3fosfato de glicerol a cido lisofosfatdico, que depois convertido a PA. O gene CDS1
responsvelpelacodificaodoenzimaCDPdiacilglicerolsintase,quecatalisaaconversode
PA em CDPDAG. O gene CHO1, que codifica o enzima fosfatidilserina sintase (PS sintase),
envolvido na sntese de PS, relevante para a anlise da via de novo da biossntese dos
fosfolpidos. O gene URA7, cujo produto o enzima CTP sintetase, relevante nas vias de
sntese de CDPDAG a partir de PA, mas tambm na sntese de PE e PC. importante referir
queaexpressodosgenesCDS1eCHO1controladapelosnveisdeinositolintracelulares.
Paraadeterminaodosnveisdetranscrito,analisousequaisasalteraesocorridas
aos 10, 20 e 40 min de adaptao das clulas a uma dose de 150 M de H
2
O
2
em estado
estacionrio,porcomparaocomclulascontrolo.Ostemposdeadaptaoescolhidosesto
relacionados com as alteraes observadas nos estudos de translocao da Opi1p para o
ncleodasclulaspormicroscopiadefluorescncia,jexplicadoanteriormente.Observouse
o incio da translocao da Opi1p para o ncleo aos 10 min estando a Opi1p totalmente
translocadaaos20min.Dasededuzqueasalteraesobservadasaonveldaexpressodos
genesseroiniciadasprximodos10mindeadaptaooudepois.Comotal,escolheramseos
10,20e40mindeadaptaodasclulasaoH
2
O
2
paraanalisaressaspossveisalteraes.
Os RNA totais foram preparados de acordo com o kit da AMBION, como descrito em
III.3.9.1., sendo posteriormente quantificados no NanoDrop. De forma a remover o DNA
contaminante que possivelmente estaria presente no extracto de RNA tratouse as amostras
comDNaseI(Fermentas),quedegradaossDNAeodsDNA.ParaconfirmaraausnciadeDNA
genmico contaminante nas amostras tratadas com DNase I, fezse uma reaco de
amplificao por PCR usando um par de primers que apenas amplificam sequncias de DNA.
61
1000
200
400
600
800
1400
2000
230pb
Foram usados os primers ZWF1F e ZWF1R para as reaces de amplificao do fragmento do
gene ZWF1, que codifica para o enzima 6fosfato de glucose desidrogenase. Foi usado DNA
genmicocomocontrolopositivoeumaalquotadosvriosRNAstratados.Apsamplificao,
procedeuse anlise dos produtos resultantes da reaco de amplificao por electroforese
numgeldeagarosea2%(m/v)comBrEt0,2g/mL,talcomodescritoemIII.3.9.3.NaFigura
19 encontramse apresentados resultados representativos da separao electrofortica
efectuadaparaasvriasamostras.
Figura 19 Anlise dos produtos de PCR dos RNAs aps tratamento com DNase, utilizando o par de primers
ZWF1FeZWF1R.(1)DNAgenmico;(2)a(5)RNAtratadocomDNase;(2)RNAcontrolodeclulasnotratadascom
H
2
O
2
;(3),(4)e(5)RNAdeclulastratadascom150MdeH
2
O
2
emestadoestacionriodurante10min,20mine
40min,respectivamente.Osresultadossorepresentativosdeseisexperinciasindependentes.
Como possvel observar pela anlise da Figura 19, no houve formao de produto
dePCRnasamostrastratadascomDNase,peloquepodeconcluirsequeotratamentocomo
enzimafoieficaz(Figura19).Assim,prosseguiuseparaasntesedaprimeiracadeiadecDNA,
talcomodescritoemIII.3.8.4.,paradepoisseranalisadaporPCRquantitativoemtemporeal.
A sntese de cDNA foi confirmada por PCR utilizando os primers do gene ZWF1, tal como
descrito anteriormente, tendo os produtos resultantes da reaco de amplificao sido
analisadosporelectroforesenumgeldeagarosea2%(m/v)comBrEt0,2g/mL(Figura20).
12345M
Figura
ZWF1F
tratad
resulta
feita
osres
dimin
estad
H
2
O
2
acord
dimin
respe
result
obser
nos
a pro
gluco
intere
pelo
40 m
repre
H
2
O
2
expre
ao H
temp
expre
a20Anlised
F e ZWF1R. (C
as com 150 M
adossorepres
As amost
adetermina
sultadosdae
Relativam
nuiosignif
do estacion
nosocon
do com os re
nuiodaex
eito expre
tadosaos40
rvouse um
sejamestatis
oduo do e
osea1fosfat
essante nota
H
2
O
2
,notan
min. Gasch e
esso do gen
eumaindu
esso do gen
H
2
O
2
, havend
posde20e4
essodosme
dosprodutosd
) DNA genmic
M de H
2
O
2
em
sentativosdese
tras de cDNA
aodosnve
expressog
menteaosge
icativadaex
rio. Os resul
nclusivospoi
esultados de
xpressodes
sso do gen
0mindeexp
ligeiro aume
sticamented
nzima 1fosf
todeinosito
ar que h u
doseumau
colaborado
ne INO1 aos
odaexpre
ne ITR1 dimi
do valores e
40minitosde
ensageirosd
dePCRapsas
co; (2) cDNA d
m estado estac
eisexperincia
A foram ana
eisdemRNA
nicaaprese
enesenvolvid
xpressode
ltados da ex
sobtiveram
e Gasch e co
stegeneaos
ne INO1, est
osioaoH
2
ento da expr
diferentedo
fato de inos
ol,podendo
m comporta
umentodae
res observa
10 min e no
essodeste
inuiu gradua
estatisticame
eexposioa
destegene,e
sntesedaprim
de clulas no
ionrio durant
sindependente
alisadas por
Adoconjunto
entadosnaFi
dosnasntes
INM1aos10
xpresso des
sevaloresc
olaboradores
20mindee
ta permane
2
O
2
estejama
resso de IN
controlo.Ist
itol sintase,
esteseropa
amento oscil
expressoao
ram o mesm
o intervalod
geneaos20
almente ao l
ente diferen
aoH
2
O
2
.Em
enopodend
meiracadeiade
tratadas com
e 10 min, 20 m
es.
PCR quanti
odegeness
igura21.
seendgena
0mindeexp
te gene aos
comumgran
s (Gasch et a
exposioa
ceu praticam
afectadospo
NO1, embora
topodeindi
que catalisa
assolimitant
latrio da ex
os20min,se
mo tipo de r
de tempo de
0mindeexp
ongo do tem
ntes relativa
boraestejam
doextrapola
ecDNA,utiliza
H
2
O
2
; (3), (4) e
min e 40 min,
tativo em te
eleccionado
adeinositol,
posioa15
20 e 40 min
ndeerro.Este
al., 2000), o
0,32mMde
mente inalte
orumgrande
os nveis de
carumesfo
a a convers
teparaasn
xpresso des
eguidadeum
resposta osc
30 a 50 min
posioa0,3
mpo de adap
amente ao
maseranali
arparaosnv
ndoopardep
e (5) cDNA de
respectivamen
empo real, s
s,encontran
observouse
0MdeH
2
O
n de exposi
esdadosest
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62
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63
provvel que tambm estes estejam diminudos na membrana plasmtica. Se assim for, a
haveraumentodeinositolnaclula,estenoadvmdeummaioruptakeapartirdoexterior,
mas sim da sntese de novo. A diminuio da expresso do gene ITR1 est de acordo com o
aumento de inositol esperado, dado que se sabe que tanto a expresso como os nveis deste
transportadordiminuemquandohumaumentodeinositolintracelularmente.Relativamente
aosdadosdeGaschecolaboradores,observouseumarepressodaexpressodeITR1aos10
minenovamenteentreos30eos50mindeexposioaoH
2
O
2
,oqueestdeacordocomos
nossosdados.
0
100
200
300
400
500
600
GTP2
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140
160
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Genes
C
10'
20'
40'
*
*
*
*
*
*
*
*
*
64
AexpressodogeneINO2,quecodificaofactordetranscrioIno2p,diminuiuaos10
e aos 20 min de exposio ao H
2
O
2
, havendo uma reposio dos nveis de expresso para os
nveiscontroloaos40min.EstesresultadospodemserexplicadopelofactodogeneINO2ser
regulado pelo inositol. Por outro lado, foi observada a translocao da protena Opi1p para o
ncleo em resposta ao H
2
O
2
, concordante com a activao do mecanismo de regulao da
expresso dos genes que possuem a sequncia UAS
INO
nas regies promotoras. Estes dados
esto de acordo com os de Gasch e colaboradores,em que foi observada uma diminuio da
expressodeINO2duranteaexposioaoH
2
O
2
nosinstantesiniciais.importantereferirque
o facto de o gene INO2 estar reprimido no significa que a protena Ino2p (factor de
transcrio) no esteja em quantidade e com actividade suficientes para exercerem a sua
funo no mecanismo de regulao da expresso dos genes que possuem as sequncias
UAS
INO
,comoocasodoFAS1.
Os nveis de expresso do gene GTP2 aumentam drasticamente durante a exposio
dasclulasaoH
2
O
2
,resultadosestesconcordantescomosobtidosporGaschecolaboradores.
IstolevaacrerqueosnveisdePAdeveroestaraumentados,vistoestegenecodificarparao
enzima3fosfatodeglicerolaciltransferase2quecatalisaaconversode3fosfatodeglicerola
cidolisofosfatdico,umdosprecursoresdePA.Poroutrolado,humamanutenodonveis
de expresso do gene CDS1 (tambm observada por Gasch e colaboradores), que codifica o
enzima CDPdiacilglicerol sintase que catalisa a converso de PA em CDPDAG, e uma
diminuio da expresso de URA7 (igualmente observada por Gasch e colaboradores),
envolvido na sntese de CTP que actua como cofactor nesse processo de converso, o que
indicaquepoderestaraocorrerumaacumulaodePA,conduzindoaoaumentodosnveis
deste fosfolpido intracelularmente. Na verdade, tal como se viu anteriormente, no foram
observadas neste trabalho variaes significativas nos valores totais de PA na clula. No
entanto, o PA pode estar simultaneamente a ser convertido em pirofosfato de diacilglicerol
(DAGPP)ouDAG,sendoesteltimoutilizadonasntesedeTAGounasntesedePEePCpela
viadeKennedy(verFigura5).
Parece haver uma tendncia para a manuteno dos nveis de expresso de CHO1,
envolvido na sntese de PS a partir de CDPDAG, o que est de acordo com a tendncia para
uma diminuio dos nveis deste fosfolpido observada, ainda que essa diminuio no seja
significativa (Figura 18). Estes dados esto de acordo com os resultados de Gasch e
colaboradores, onde se observou uma manuteno da expresso de CHO1, havendo apenas
uma ligeira induo da expresso aos 30 min de exposio ao H
2
O
2
. Observouse uma
diminuio da expresso do gene PIS1, envolvido na sntese de PI a partir de CDPDAG e
inositol, o que pode indiciar uma diminuio dos nveis deste fosfolpido. Na verdade, esta
65
66
reprime a expresso do gene FAS1 por induo dos nveis de inositol. , portanto, essencial
quantificarosnveisdeinositolemclulascontroloeexpostasadosesadaptativasdeH
2
O
2
,no
sentido de verificar se, de facto, o H
2
O
2
que induz o aumento dos nveis de inositol
intracelularmente.
Aps uma vasta pesquisa, optimizouse um mtodo espectrofotomtrico para
determinarosnveisdeinositolemclulasdeS.cerevisiae(verIV.1.3.1).
IV.4.1. OptimizaodoMtododeDoseamento
umlimitededetecobaixo.Ofactodolimitededetecoserbaixovantajoso,poispermite
detectar quantidades reduzidas de inositol. No entanto, a grande sensibilidade faz com que
haja uma maior susceptibilidade a erros devido grande propagao de pequenas variaes
quepossamserintroduzidasnosistema.Nopresentetrabalhoexperimental,tentoumedirse
os nveis de inositol por este mtodo, mas nunca foram obtidos resultados reprodutveis. A
elevadasensibilidadedomtodoconduziuagrandesvariaesdeintensidadedefluorescncia
entre os vrios replicados de uma mesma amostra, no se tendo tambm observado
diferenasentreospoosdobrancoedoteste.
Procurouse, ento, outro mtodo que permitisse dosear o inositol no interior das
clulas. Recentemente, Ashizawa e colaboradores (Ashizawa et al., 2000) optimizaram um
mtodo espectrofotomtrico enzimtico para medio de inositol em soro de rato. Baseiase
na oxidao de mioinositol (MI) e na reduo do NAD
+
pelo enzima mioinositol
desidrogenase (MIDH), acoplado reaco catalisada pelo enzima diaforase que converte
cloretodeiodonitrotetrazlio(INT)aformazan,reoxidandoseoNADH.Oformazanresultante
medido espectrofotometricamente a 492 nm (Figura 11). Este mtodo tem a vantagem de
ter brancos da curva e das amostras baixos, havendo apenas um aumento da absorvncia
quaseimperceptvelnodecorrerdoensaio.Noentanto,asensibilidadedomtodobastante
baixa, de aproximadamente 2 nmol, tornandose complexa a sua optimizao quando se
queremmedirquantidadesbaixasdeinositol.
Antes de tudo, fezse um estudo terico para definir quais as concentraes de cada
um dos enzimas e metabolitos no sistema reaccional, de forma a que o sistema evolusse de
forma controlada, tendo em ateno que o INT e o NAD devem estar em excesso
relativamenteaosenzimasdosistema reaccional.Asconcentraeseactividadesenzimticas
definidasencontramsereferidasemIII.3.9.3.
ComofoiefectuadoporAshizawaecolaboradores,reproduziuseacurvadecalibrao
at 30 nmol de inositol, tendose observado linearidade at 20 nmol, tal como referido pelos
autores.
Seguidamente, partiuse para os ensaios com os extractos citoslicos de levedura,
tendo surgido uma srie de problemas. Inicialmente, efectuouse o ensaio com extracto final
sem ser sujeito a qualquer tipo de tratamento. Quando se adicionou MIDH ao sistema viuse
um aumento muito rpido da absorvncia para valores superiores ao limite de deteco do
leitor de microplacas. Tentou efectuarse vrias diluies do extracto antes de adicionar ao
poo de reaco, tendose observado valores de absorvncia inferiores mas, no entanto,
perdeusesensibilidadepoisaodiluirseoextractoesttambmadiminuirseaquantidadede
inositolquesequermedir.Paraalmdesteproblemaviuseque,quandoseadicionavaMIDH
68
emadiessucessivasocorriaumincrementonosvaloresdeabsorvnciaemtodasasadies,
indiciando que o MIDH estaria a interferir com a medio, ou algum dos componentes do
sistema reaccional estaria a contribuir para estes aumentos sucessivos de absorvncia aps a
adiodeMIDH.
Dados os problemas observados, resolveu fazerse um tratamento das amostras logo
apsaobtenodoextractofinal.TalcomoindicadoporAshizawaecolaboradores,tratouse
o extracto com cido perclrico 16% (p/v), neutralizando seguidamente com K
2
CO
3
2M, para
precipitartodaaprotenadoextractoequepoderestarainterferircomoensaio.Apseste
tratamento, incubouse ainda as amostras com hexocinase, no sentido de eliminar toda a
glucosequeseobservouinterferircomoensaio(Ashizawaetal.,2000).Foifeitonovamenteo
ensaio, com o extracto tratado e sem qualquer diluio, tendose observado um aumento de
absorvnciatantonopoodobrancocomonopooteste,devidoaoaumentodaturbidezdas
amostras nos poos (formao de um precipitado) quando se adicionou o reagente MI ao
extracto tratado. Testouse ainda um ensaio em que se retirou ao reagente MI alguns dos
componentes que se pensou interferirem com o ensaio: a) sem Triton; b); sem BSA; c) sem
Triton e sem BSA. Em todos os casos continuou a haver aumento de absorvncia devido ao
referido aumento de turbidez nos poos dos brancos e teste. Essa turbidez s deixou de ser
to acentuada quando se diluiu o extracto 100x, mas a temos o problema de estar a diluir
tambm100xoinositolaquantificar.
Dado que o mais provvel que ainda houvesse interferentes no extracto convinha
arranjarummtodoqueeliminasseamaioriadelessemqueoinositolfosseperdidoaolongo
do processo. Maslanski e Busa (Maslanski and Busa, 1990) referem um mtodo de
cromatografia de troca inica, usando uma resina Dowex 50W 200400 mesh, no qual as
amostras so eludas com gua recuperandose o inositol. O volume de gua com o qual as
amostras foram eludas e o volume de gua a aplicar no final para lavar a coluna foram
optimizadosdeformaarecuperartodooinositolaaplicarcoluna.
Noentanto,aindatnhamosoproblemadabaixasensibilidadedomtodo,quealiado
a todos os processos de tratamento poderia conduzir a perdas significativas. Como tal, fezse
um upscaling da cultura de forma a que no final, em cada poo, tivssemos quantidade
suficiente de inositol para que se pudesse efectuar uma medida minimamente rigorosa.
Optimizouseaquantidadedeculturae,consequentemente,aquantidadedeprotena(g)de
forma a terse, pelo menos, aproximadamente 6 nmol de inositol em cada poo de reaco.
Assim, todo o processo de preparao da amostra e o mtodo de doseamento encontramse
descritosempormenoremIII.3.9.Resumidamente:
69
A. Preparaodoextracto
B. Quantificaodeprotena,deformaaaplicar~6nmolinositolemcadapoo
C. Precipitaodaprotenacomcidoperclricoeneutralizao
D. Cromatografiadetrocainica,paraeluiroinositol
E. Tratamentocomhexocinase
F. EnsaioespectrofotomtricodeAshizawaecolaboradores
IV.4.2. CurvadeCalibraodoMtodoEspectrofotomtrico
Para a medio do inositol intracelular foi necessrio traar primeiro uma curva de
calibrao. Reproduziuse a curva de calibrao apresentada por Ashizawa e colaboradores
(Ashizawa et al., 2000) de acordo com a metodologia apresentada em III.3.9.3., tendose
observadolinearidadeat20nmol,talcomoreferidopelosautores.
Areproduodacurvadecalibraodomtodofoirelativamentesimples.Noquediz
respeito medio dos nveis de inositol em amostras biolgicas, nomeadamente em S.
cerevisiae, o processo foi algo complicado. Teve de ser feito um conjunto de testes e
optimizaes,jreferidosemIV.4.1.
Apstodasasoptimizaesefectuadas,foramanalisadasamostrasdeclulascontrolo
e amostras recolhidas aos tempos de adaptao de 5 e 10 min de incubao das clulas com
150MdeH
2
O
2
.Paraasclulascontroloobservouseumaumentodosvaloresdeabsorvncia
a 492 nm nos poos aos quais foi adicionado o enzima MIDH (Figura 22A). Para as clulas
submetidas a 150 M de H
2
O
2
durante 5 e 10 min, no houve um aumento de absorvncia a
492nm significativamente diferente do observado para as amostras com o enzima MIDH
relativamenteabsorvncianasamostrassquaisnofoiadicionadooenzimaMIDH (Figura
22B e Figura22C). Isto indica que h uma diminuio dos nveisde inositol quando as clulas
soexpostasadosesadaptativasdeH
2
O
2
.
70
B C
Figura 22 Ensaio representativo do doseamento do inositol intracelular em clulas controlo e expostas a 150
MdeH
2
O
2
.Encontramseapresentadososresultadosobtidosparaumdosensaiosefectuados.representadaa
variao de absorvncia a 492 nm em funo do tempo (min). A. Clulas controlo; B. Clulas expostas a 150 M
H
2
O
2
aos 5 min; C. Clulas expostas a 150 M H
2
O
2
aos 10 min. Branco do ensaio (sem MIDH); Teste
(comMIDH).Osresultadosapresentadossorepresentativosdetrsexperinciasindependentes.
4
9
2
n
m
Tempo(min)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5 10 15 20 25 30 35
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b
s
4
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Tempo(min)
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4
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2
n
m
Tempo(min)
71
72
V. CONSIDERAESFINAIS
74
VI. PERSPECTIVAS
76
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