Universidad Autnoma de Chiriqu Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Escuela de Qumica

Curso de Bioqumica II (QM 382-L)

Pruebas de Caracterizacin de los cidos Nucleicos

Estudiantes: Bejerano Daniel Castro Lidia P. Sobenis Eira M. 4-777-1401 4-759-375 4-758-271

Profesora: Albertina Montenegro

II Semestre 2012

Fecha de entrega: 22/10/2012

Pruebas de caracterizacin de los cidos Nucleicos

I-

Objetivos:

1- Trabajar con los cidos nucleicos aislados experimentalmente en experiencias anteriores. 2- Realizar pruebas de caracterizacin a las muestras obtenidas. 3- identificar los tipos de cidos nucleicos y conocer las principales diferencias existentes entre estas molculas.

II-

Introduccin:

En todas las clulas vivas hay cidos nucleicos; en su mayora estn constituyendo las nucleoprotenas, complejos formados por protenas bsicas (protaminas e histonas) y cidos nucleicos. Desde que Miescher aislara por vez primera una nucleoprotena, en 1869, se han puesto a prueba numerosas tcnicas para separar los cidos nucleicos de las protenas a las que estn unidas. Se sabe que no todos los cidos nucleicos son iguales; en los tejidos constituidos por clulas provistas de grandes ncleos, como el Timo, predomina un tipo de cido nucleico, llamado antes cido timonucleico; en otras clulas, que tienen ncleos diminutos, como las levaduras, predomina un tipo distinto: cido nucleico de levadura. Estos dos tipos de cidos nucleicos se denominan hoy, atendiendo a su composicin qumica, cido desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) respectivamente. El ADN est fundamentalmente compuesto de fosfato, las bases pricas: adenina y guanina, las bases pirimdicas: uracilo; en lugar de la timina y el azcar 2-desoxidribosa. El ARN difiere del ADN por contener la base pirimdicas uracilo en lugar de la timina y el azcar 2-desoxi-d-ribosa. Los cidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden encontrar en las clulas asociadas a protenas formando complejos llamados ncleo-protena. Estas protenas tienen carcter bsico mientras que los cidos nucleicos son cidos. Se conocen dos grupos de cidos nucleicos: ARN (cido ribonucleicos) y el ADN (cido desoxirribonucleico). La hidrlisis controlada de ARN y ADN produce nucletidos. Si la hidrolisis continua se produce nuclesidos y finalmente fosfatos, azucares y bases pricas y pirimidnicas.

Para evidencias la presencia de cidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere clulas en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrlisis de los cidos nucleicos por nucleasas.

III-

Materiales y Reactivos:

Instrumento Cantidad Probetas 2 Goteros 4 Plancha 1 Gradilla 1 Varilla de vidrio 2 Vasos Qumicos 4 Solucin de ADN y ARN obtenida en periodos anteriores. Reactivos: Difenilamina C12H11N Propiedades fsicas: Estado de agregacin: Slido Apariencia: cristal blanco, con olor dulce floral Masa molar: 169.23 g/mol Punto de ebullicin: 302C Punto de fusin: 53C Punto de inflamacin: 153C c.c. Temperatura de autoignicin: 634C Densidad: 1,2 g/cm3 Solubilidad en agua: (muy escasa)

Capacidad 10, 50 mL 100, 250 mL.

Riesgos para la salud: Inhalacin: Tos. Dolor de garganta. Ingestin: Dolor de garganta. Piel y Ojos: Enrojecimiento. Es posible la explosin del polvo si se encuentra mezclado con el aire en forma pulverulenta o granular. La sustancia se descompone al calentarla intensamente o al arder, produciendo humos txicos, incluyendo xidos de nitrgeno. Reacciona con oxidantes fuertes y cidos fuertes. Orcinol C7H8O2 Propiedades fsicas: Apariencia: slido cristalino blanco, con olor caracterstico Masa molar: 142.16 g/mol

Punto de fusin: 50-60C Punto de ebullicin: 290C Densidad (Agua1) : 1.29 kg/L a 20C Solubilidad: ligeramente soluble en agua Riesgo Inhalacin: Irritaciones de las vas respiratorias superiores. Ingestin: Molestias. Contacto con la piel: Irritaciones, enrojecimiento y Dolor. Posibilidad de ingresar por la piel. Contacto visual: Irritaciones. Enrojecimiento. Dolor. cido Perclrico HClO4 Propiedades fsicas: Apariencia: Lquido incoloro de olor caracterstico ocre. Punto de Ebullicin (C): 19 Punto de Fusin (C): -112 Masa molecular: 100.46 g/mol. Presin de Vapor (mm Hg): 44.0 / 20C Solubilidad: miscible en agua Densidad relativa (agua = 1): 1.76 a 22C Densidad relativa de vapor (aire = 1): 3.5 Riesgos para la salud Inhalacin: Corrosiva. Sensacin de quemazn. Tos. Dificultad respiratoria. Dolor de garganta. Ingestin: Corrosivo. Dolor abdominal. Sensacin de quemazn. Diarrea. Shock o colapso. Dolor de garganta. Vmitos. Piel: Corrosivo. Enrojecimiento. Quemaduras cutneas. Dolor. Ojos: Corrosivo. Enrojecimiento. Dolor. Prdida de visin. Quemaduras profundas graves. cido Tricloroactico CCl3COOH Propiedades fsicas: Estado de agregacin: Slido. Apariencia: Blanco-cristalino, olor picante parecido a cloro. Masa Molar: 163,39 g/mol. Punto de fusin: 58C Punto de ebullicin: 198C Solubilidad: 120% en Agua Riesgo para la salud: Inhalacin: Irritacin en las vas tractorespiratorias, Puede causar estado de coma dificultad para respirar. Contacto con los ojos: Causa severas quemaduras en los ojos pueden ser daos permanentes como la ceguera. Contacto con la piel: Este producto es extremadamente irritante para la piel, causa severas quemaduras dejando cicatrices. Ingestin: El producto causa quemaduras y ulceraciones del tracto-gastro-intestinal Sulfato de Amonio (NH4)2SO4

Propiedades fsicas: Apariencia: Slido blanco cristalino granulado. Inodoro. Peso molecular: 132.14 g/mol. pH (10% sol n/agua): 5 Punto de ebullicin: Descompone Punto de fusin 235C (455F) Gravedad especfica g/cc 0.913 (agua=1) Solubilidad: Fcilmente soluble en agua caliente. Soluble en agua fra. Riesgos para la salud: El contacto prolongado con este producto puede producir irritacin en los ojos y la piel. Sobre exposicin por inhalacin puede causar irritacin del tracto respiratorio. La ingestin de esta sustancia puede producir irritacin del tracto gastro-intestinal, caracterizado por quemaduras y diarrea. IVProcedimiento

Preparamos tres tubos de ensayo y adicionamos las cantidades de reactivos que se indicaban:

1- PRECIPITACIN CON SULFATO DE AMONIO: Mezclamos 1 mL de extractos de cidos nucleicos con 1 mL de solucin saturada de sulfato de amonio.

2- PRUEBA DE DIFENILAMINA: Mezclamos 0,5 mL de extracto de cido nucleico con 1 mL de cido perclrico 1M y 2 mL del reactivo de Difenilamina. Calentamos en bao de agua hirviendo por 15 minutos.

3- PRUEBA DE ORCINOL: Mezclamos 0,5 mL del extracto de cido nucleico con 2 mL de cido tricloroactico al 5% y 2 mL del reactivo de Orcinol. Calentamos en bao de agua hirviendo por 10 minutos.

Para las pruebas 2 y 3 preparamos una muestra control o blanco con agua destilada en lugar del extracto de cido nucleico. V. Resultados Cuadro 1.Prueba de Precipitacin con Sulfato de Amonio.

Tipo de prueba Prueba de precipitacin con sulfato de amonio

Observacin

ADN ARN Agua

Prueba positiva Prueba positiva Prueba negativa

Cuadro 2. Prueba de Difenilamina. Tipo de prueba/muestra Observacin

Prueba de Difenilamina

ADN

ARN Agua

Prueba positiva Complejo de color azul-verdoso, debido al desoxirribosa del ADN, luego de hidrolizar en medio cido y calor. Prueba negativa Prueba negativa Cuadro.3.Prueba de Orcinol

Tipo de prueba/muestra Prueba de Orcinol

Observacin

ADN ARN

Prueba negativa Prueba positiva verde

Complejo de color

Agua

La ribosa del ARN reacciona con el orcinol dando una coloracin verde Prueba negativa

VI.

Discusin

En este experimento se realizaron diferentes pruebas especficas (3) para confirmar cidos Nucleicos (ADN y ARN) obtenidos experimentalmente en laboratorios anteriores. El la prueba de precipitacin utilizamos una solucin salina (Sulfato de Amonio) para hacerla reaccionar con extracto de ADN y ARN; de esta manera durante la reaccin se observ la precipitacin en ambos cidos nucleicos dando como resultado la prueba positiva. La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin. Se basa en la simultnea neutralizacin de las cargas negativas (mediante el aadido de sales), cual lleva a su precipitacin. En la prueba con Difenilamina para el ADN dio positiva en donde se pudo observar un complejo de color azul-verdoso, el ARN dio negativa a esta prueba. Cuando se trata ADN con Difenilamina en condiciones cidas (cido perclrico 1M) se forma un compuesto azul. Este colorante reacciona selectivamente con 2-deoxipentosas. En disolucin cida la deoxipentosa se convierte en el altamente reactivo hidroxilevulinoaldehdo que reacciona con la difenilamina para dar un compuesto azul. El ARN da negativo simplemente por no contener deoxipentosa. La prueba de orcinol da positiva en ARN; mientras que para el ADN es negativa. En la prueba de orcinol la ribosa del ARN reacciona con el orcinol; se debe a la formacin de furtural cuando se calienta en medio acido (T.C.A). El orcinol reacciona con el furtural en presencia de cloruro frrico como catalizador, dando un complejo de coloracin verde. Con la pentosa, la prueba ms sensible y comnmente empleada es; no obstante, la del orcinol, que es la que se utiliza para la estimacin del RNA. En la estimacin de la desoxirribosa se ha empleado frecuentemente la reaccin de la difenilamina (Bioqumica de los cidos nucleicos de Davidson, J. Davidson, R. L. P. Adams. Page. 65).

Reacciones: Reaccin.1. Precipitacin de A. Nucleicos con sulfato de amonio.

cidos nucleicos + (NH4)2SO4

cidos nucleicos + SO4 + NH4+

Reaccin.2.Prueba de Difenilamina para A. Nucleicos.

Reaccin.3. Prueba de Orcinol para A. Nucleicos.

VII.

Conclusiones.

 En la naturaleza existen solo dos tipos de cidos nucleicos: El ADN (cido desoxirribonucleico) y el ARN (cido ribonucleico) y estn presentes en todas las clulas. Los cidos nucleicos pueden precipitar por efecto de soluciones alcalinas como sulfato de amonio; adems tambin precipitan por efecto de alcoholes en presencia de sales alcalinas. La prueba de Difenilamina es til para determinar ADN; el cual se evidencia por la reaccin de su pentosa (desoxirribosa) con el reactivo de difenilamina, se forma un complejo azul-verdoso. La prueba de Orcinol sirve para caracterizar ARN en donde se puede observar un complejo verde debido a la reaccin de la ribosa con el orcinol. Par llevar a cabo las pruebas de caracterizacin a excepcin de la prueba de precipitacin, es necesario realizarlas en medio cido y calor ya que de esta manera se puede transformar o convertir los cidos nucleicos en otros compuestos el cual sern los que reaccionen con cada reactivo y originen la coloracin esperada para cada prueba. Qumicamente, los cidos nucleicos estn formados, por una pentosa o azcar de cinco carbonos. Se conocen dos tipos de pentosas que forman parte de los nucletidos, la ribosa y la desoxirribosa, esta ltima se diferencia de la primera por que le falta un oxgeno y de all su nombre. El ADN slo tiene desoxirribosa y el ARN tiene slo ribosa, y de la pentosa que llevan se ha derivado su nombre, cido desoxirribonucleico y cido ribonucleico, respectivamente.

Tambin contienen una base nitrogenada: que son compuestos anillados que contienen nitrgeno. Se pueden identificar cinco de ellas: adenina, guanina, citosina, uracilo y timina. Los cidos nucleicos presentan un radical fosfato: es derivado del cido fosfrico (H3PO4-).

VIII. Bibliografia: Olive, M. and Bean, P. 1999. Principles and applications of methods for DNAbased typing of microbial organisms. J. of Clinical Microbiology. 37(6):16611669.

Rapley R. 2000. Recombinant DNA technology. In. Walker, J. M. and R. Rapley (Ed). Molecular Biology and Biotechnology (4th Ed). RSC. London UK. 563p. Davidson, J. N: The biochemistry of Nucleic Acids, Academic, Nueva York, 1972. Breve tratado sobre los aspectos de la bioqumica de los cidos nucleicos.

 Kornberg, A.: DNA Synthesis, Freeman, San Francisco, 1974. Descripcin de la bioqumica del DNA. http://biogenomica.com/ADN.htm Fuente: Biologa Cuarto Medio, Glavic-Ferrada. Ediciones Pedaggicas Chilenas.