DESNATURALIZACIN Y PLEGAMIENTO DE PROTENAS

H. Eugenio Arriagada M. Depto. Bioqumica y Biologa Molecular harriaga@udec.cl

La desnaturalizacin conduce a la prdida de la estructura nativa de las protenas

La desnaturalizaci desnaturalizacin resulta en el despliegue y desorganizaci desorganizacin de las estructuras secundarias y terciarias ( y cuaternaria si hubiera) hubiera) La estructura primaria no es afectada por este proceso. El estado desnaturalizado, se correlaciona siempre con prdida de la funci funcin. Lo anterior no es necesariamente sin sinnimo de desnaturalizaci desnaturalizacin. Porqu Porqu? La desnaturalizaci desnaturalizacin proteica puede ser, bajo ciertas condiciones, reversible. reversible. En este caso, la prote protena recupera su estructura nativa cuando se retira el agente desnaturalizante (Renaturaci Renaturacin) Sin embargo, la mayor mayora de las prote protenas una vez desnaturalizadas, permanecen en ese estado permanentemente. Las prote protenas desnaturalizadas son a menudo insolubles, insolubles, y por tanto precipitan en soluci solucin.

Agentes desnaturalizantes interfieren con fuerzas que estabilizan el plegamiento

AGENTE

BLANCO enlacesenlaces-H, interacciones hidrof hidrofbicas puentes salinos interacciones hidrof hidrofbicas interacciones hidrof hidrofbicas puentes disulfuro enlacesenlaces-H, interacciones hidrof hidrofbicas

Calor pH Detergentes Urea Mercaptoetanol Agitaci Agitacin

Agentes desnaturalizantes interfieren con fuerzas que estabilizan el plegamiento

La mayor mayora de las prote protenas, pueden desnaturalizarse por calor, calor, lo que afecta las d dbiles interacciones en una prote protena (principalmente uniones H) produci producindose el despliegue de la prote protena y la p prdida de las estructuras secundaria y terciaria. Las prote protenas se suelen desnaturalizar con agentes caotr caotrpicos (urea, sales de guanidinio) guanidinio) y detergentes. detergentes. Los agentes caotr caotrpicos, picos, aumentan la solubilidad de sustancias apolares en agua, interrumpiendo interacciones hidrof hidrofbicas estabilizantes de la estructura a trav travs de un mecanismo desconocido y la desnaturalizan. Los detergentes, como el SDS, se asocian con los residuos apolares de las prote protenas interferiendo con las interacciones hidrof hidrofbicas en el interior de la prote protena desnaturaliz desnaturalizndola. La variaci n de pH altera los estados de ionizaci variaci ionizacin de los R de los residuos, lo que cambia la distribuci distribucin de carga de la prote protena y los requerimientos de enlace hidr hidrgeno.

Puentes disulfuro

Inhibidor de la tripsina de pncreas de bovino (BPTI)

-mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro a residuos cisteinil. cisteinil.

Puentes disulfuro

Recuerde que los enlaces o puentes disulfuro, se forman cuando los grupos tioles de dos cisteinas que se encuentran a la distancia adecuada son oxidados. Esta reacci reaccin es catalizada por disulfuros isomerasas. isomerasas. Los enlaces disulfuro entre residuos de Cys de una misma cadena (intercadena ) o bien entre cadenas polipept (intercadena) polipeptdicas distintas (intracadena intracadena), ), se forman cuando la prote ( prote na se pliega a su conformaci conformacin nativa. nativa. La abundancia de puentes disulfuro en prote protenas como las hormonas pept peptdicas, dicas, las enzimas digestivas o las inmunoglobulinas, les confiere la estabilidad necesaria para que puedan funcionar en el medio extracelular.

Determinacin de la desnaturalizacin de protenas

RNasa A

azl - absorcin al uv rojo viscosidad verde rotacin ptica

A pH 2,1 y fuerza i inica 0,019 M

Determinacin de la desnaturalizacin de protenas

La desnaturalizaci desnaturalizacin t trmica de ribonucleasa A (RNasa (RNasa A), se efectu efectu en un experimento calent calentndola en soluci solucin lentamente y siguiendo el proceso con varias t cnicas que informan del t cambio de conformaci conformacin (absorci (absorcin al uv, uv, viscosidad y rotaci rotacin ptica) Para esta prote protena, se necesita emplear tambi tambin un agente reductor (mercaptoetenol). mercaptoetenol). Porqu Porqu? La desnaturalizaci desnaturalizacin ocurre en un estrecho rango de temperaturas. Lo abrupto de los cambios, sugiere que el desplegamiento es un proceso cooperativo, cooperativo, la p prdida de estructura en una parte de la prote protena desestabiliza otras partes. En condiciones fisiol fisiolgicas, la mayor parte de las prote protenas son estables hasta 5050-60 C. Las prote protenas de bacterias termof termoflicas resisten temperaturas de alrededor de 100 100 C.

La secuencia aminoacdica de una protena determina su estructura tridimensional

El agente reductor rompe los cuatro puentes disulfuro dando ocho residuos Cys, Cys, y la urea rompe las interacciones hidrof estabilizantes, hidrofbicas estabilizantes, liberando al polip polipptido de su conformaci conformacin plegada. La desnaturalizaci desnaturalizacin de la RNasa est est acompa acompaada por una p de su prdida total actividad catal cataltica.

La secuencia aminoacdica de una protena determina su estructura tridimensional

La secuencia aminoacdica de una protena determina su estructura tridimensional

En 1957, Anfinsen desnaturaliz desnaturaliz RNasa A (prote (protena de 124 residuos) con urea 8 M y rompi rompi sus cuatro enlaces disulfuro con mercaptoetanol, mercaptoetanol, obtuvo una cadena polip polippt ptdica con 8 grupos sulfihidrilos. sulfihidrilos. La di dilisis de urea y el reductor y la exposici exposicin de la soluci solucin resultante a O2 a pH 8, permiti permiti obtener una prote protena 100% activa enzim enzimticamente y que era f fsicamente indistinguible de la prote protena nativa. nativa. Cuando se removi removi slo mercaptoetanol y la oxidaci oxidacin ocurri ocurri en presencia de urea, se recuper recuper slo el 1% de la actividad enzim enzimtica. Porqu Porqu? Las prote protenas inactivas ( (scrambled scrambled), se pudieron renaturalizar al eliminar urea y agregar trazas de mercaptoetanol que reformaron los puentes disulfuro apropiados.

Plegamiento de una protena globular

Se acepta generalmente que la informaci informacin necesaria para un plegamiento correcto est est contenida en la estructura primaria del polip ptido. polip Una prote protena comienza a plegarse en etapas mientras ocurre su sntesis, m ms que esperar que la s sntesis de la cadena entera est est completa. Esto limita la competencia de configuraciones de plegamiento de segmentos m ms largos del p pptido naciente. A medida que un p pptido se pliega, las cadenas laterales de sus amino aminocidos se atraen y repelen de acuerdo a sus propiedades qu qumicas. La secuencia de las cadenas laterales dicta el dise diseo del plegamiento de la estructura tridimensional y el ensamble de subunidades en estructura cuaternaria.

Plegamiento de una protena globular

Plegamiento de una protena globular

Ocurre a trav travs de una serie de pasos jerarquizados: estado desplegado, estructura secundaria, dominios, gl glbulo fundido fundido, estructura terciaria nativa. Primero, segmentos cortos se pliegan en estructuras secundarias locales (n (ncleo de plegamiento), las cuales deben adoptar una disposici disposicin apropiada. Luego, las regiones hidrof hidrofbicas se segregan hacia el interior de la prote protena lejos del solvente para formar un gl glbulo fundido fundido, una estructura colapsada. El gl glbulo fundido fundido es un polip polipptido parcialmente plegado en el cual los segmentos de estructura secundaria, se reordenan hasta que se alcanza la conformaci conformacin madura de la prote protena. Los pasos entre ese estado y la estructura terciaria nativa ocurre ocurre generalmente en forma lenta. lenta. Es impulsado por fuerzas hidrof hidrofbicas. bicas. Las prote nas pueden autoensamblarse, prote autoensamblarse, pero in vivo el proceso de plegamiento es ayudado por chaperonas. chaperonas.

Modelo para las etapas del plegamiento de protenas globulares

El embudo representa una superficie de energ energa libre para el proceso de plegamiento. El proceso de plegamiento es altamente cooperativo. cooperativo. La formaci formacin r rpida y reversible de estructuras secundarias es seguida por una fase m ms lenta en la cual el establecimiento de intermediarios parcialmente plegados conducen a la estructura terciaria final. Muy temprano en el proceso de plegamiento tiene lugar una substancial exclusi exclusin de agua. agua.

Chaperonas asisten el plegamiento de protenas

Las chaperonas, Heat shock proteins proteins (Hsp), Hsp), interact interactan con el polip polipptido durante el proceso de plegamiento. En el interior celular, chaperonas se unen y estabilizan prote protenas desplegadas o parcialmente plegadas, evitando su agregaci agregacin y degradaci degradacin. Chaperonas Hsp70 (BiP (BiP en RER, Hsp70 en matriz mitocondrial y en citosol), citosol), que funcionan como mon monmeros, se unen a las cadenas polipept polipeptdicas nacientes hasta que su s sntesis est est completa no permitiendo que las cadenas incompletas se plieguen prematuramente.

Chaperonas asisten el plegamiento de protenas

Cuando la prote protena Hsp70 monom monomrica une ATP, asume una forma abierta en la cual un bolsillo hidrof hidrofbico se une en forma transiente a regiones hidrof hidrofbicas expuestas de una prote protena incompletamente plegada o parcialmente desnaturalizada. La hidr hidrlisis del ATP unido a un dominio que une nucle nucletido (NBD), estimulada por una coco-chaperona, lleva a la chaperona a una forma cerrada que une a la prote protena blanco m ms fuertemente, y esta uni unin m ms fuerte parece facilitar el plegamiento previniendo la agregaci agregacin con otras prote protenas desplegadas. El intercambio de ATP por el ADP unido al NBD estimulado por otra coco-chaperona, provoca un cambio conformacional en la chaperona que libera la prote protena. Si la prote protena est est plegada apropiadamente, no puede volver a unirse a una Hsp70.

Chaperonas asisten el plegamiento de protenas

Chaperoninas (Hsp60), prote protenas multisubunidad, multisubunidad, facilitan directamente el plegamiento de las prote protenas. Tienen forma de barril en el cual se ajusta la prote protena. Act Acta como molde, une y re rene porciones de la prote protena desplegada hasta que el plegamiento est est completo. La formaci formacin de enlaces disulfuro y la isomerizaci isomerizacin ciscis-trans de los enlaces pept peptdicos de Pro est estn catalizadas por la disulfuro isomerasa y la prolil cis, cis, trans isomerasa respectivamente.

Otras enzimas en el plegamiento de protenas

La formaci formacin de enlaces disulfuro (S (SS) es catalizada por la prote protena disulfuro isomerasa (PDI). Esta enzima mezcla mezcla puentes disulfuro; los reordena. Si se forma un enlace SS incorrecto, como es covalente no se puede romper espont espontneamente, generando una configuraci configuracin incorrecta del polip polipptido. PDI, rompiendo y reformando enlaces SS entre diferentes residuos cisteinil, cisteinil, permite la correcci correccin del plegamiento. En el interior del RER, se encuentran altas concentraciones de PDI involucrada en plegamiento de prote protenas destinadas a secreci secrecin. Los enlaces pept peptdicos X-Pro, en que X representa cualquier residuo, son sintetizados en configuraci configuracin trans. No obstante, en prote protenas maduras alrededor de 6% de estos enlaces son cis, que es frecuente en vueltas . La isomerizaci isomerizacin de trans a cis es catalizada por la enzima prolinaprolina-cis,trans-isomerasa. isomerasa.

Plegamiento anmalo en las protenas

El plegamiento de una prote protena es un proceso complejo, de ensayo y error, que puede algunas veces resultar en mol molculas plegadas en forma en forma incorrecta. El plegamiento an anmalo o plegamiento ineficiente puede conducir a la agregaci agregacin (asociaci (asociacin inadecuada de cadenas polipept polipeptdicas parcialmente plegadas) intra o extracelular de prote protenas mal plegadas que pueden acumularse, particularmente en personas de mayor edad. La agregaci agregacin de las prote protenas limita la capacidad de producci produccin. Las prote protenas plegadas err errneamente no son funcionales. funcionales. La recuperaci recuperacin de estas prote protenas puede ser dif difcil. Estas prote nas mal plegadas son generalmente marcadas y prote luego degradadas dentro de la c clula.

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Qu sucede si hay un plegamiento anmalo en las protenas?

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