PRESERVANDO PARA O FUTURO

Duas pacientes de mesma idade so diagnosticadas com um tumor de mama. Elas so submetidas ao mesmo procedimento cirrgico e, aps anlise do tumor retirado (do mesmo tipo nas duas pacientes), recebem tratamentos complementares absolutamente idnticos. No entanto, uma paciente fi ca curada ao fi nal de cinco anos, enquanto na outra a doena retorna. Onde est a diferena que fez com que apenas uma paciente se curasse? Na busca da resposta para esta e outras perguntas, um banco de amostras de tumores criado no Brasil tem fornecido material para uso em pesquisas cientfi cas, inclusive no exterior, o que coloca o pas na vanguarda da luta contra o cncer.
Antnio Hugo Jos Fres Marques Campos Banco de Tumores, Hospital A. C. Camargo, Fundao Antonio Prudente Dirce Maria Carraro Laboratrio de Genmica e Biologia Molecular, Centro Internacional de Pesquisa e Ensino (Cipe), e Banco de Macromolculas, Hospital A. C. Camargo Emmanuel Dias-Neto Laboratrio de Genmica e Bioinformtica, Centro Internacional de Pesquisa e Ensino (Cipe), Hospital A. C. Camargo

A IMPORTNCIA DE UM BANCO DE TUMORES PARA A PESQUISA SOBRE O CNCER

Toda a informao necessria para o funcionamento de uma clula (in- cluindo a maneira como ela se rela- ciona com outras, para formar teci- dos e rgos no corpo humano) est contida em seu material gentico, ou genoma uma longa molcula de ci-do desoxirribonucleico (DNA) guardada em seu n- cleo. Para que ocorra a produo de protenas e ou- tras molculas regulatrias, partes do DNA servem de molde, em um processo denominado transcrio, para a sntese de molculas de cido ribonucleico (RNA). Uma parte desses RNAs os conhecidos como RNAs mensageiros fornecem as instrues para a produ- o de protenas e de outras molculas importantes. Uma clula normal sintetiza os RNAs e, com base neles, produz as protenas e outras molculas de que precisa para seu funcionamento normal e sua multi- plicao. Numerosos fatores, porm, podem desre- gular esse processo e fazer com que as clulas cres-am e se reproduzam de modo desordenado condi-o conhecida como cncer. Muitos estudos relacio- nam alteraes ocorridas no material gentico e no processo de produo do RNA (ou na leitura deste, na produo de protenas e molculas) ao apareci-mento e progresso de diversos tipos de cncer, e sabe-se que essas alteraes tm ainda a capacidade de influenciar a conduta teraputica. O sequenciamento completo do genoma humano por um consrcio internacional de pesquisa, entre 1980 e 1990, determinou o conjunto das unidades fun- damentais do DNA (os nucleotdios, em termos tcni- cos) de uma clula humana e identificou os genes de nossa espcie. Isso levou ao desenvolvimento de no- vas tcnicas de biologia molecular, capazes de gerar informaes com maior rapidez e qualidade e menor custo. Embora no tenha participado desse projeto pioneiro, o Brasil contribuiu de modo significativo para os estudos dos genes humanos por meio do Projeto Genoma Humano do Cncer.

Esse projeto baseou-se em amostras tumorais e no tumorais, das quais foi extrado RNA de alta qualidade, revertido em DNA complementar (cDNA) por uma enzima especfica e ento sequenciado (essa reverso permite um enfoque na poro do genoma que de fato transcrita). Isso possibilitou identificar cerca de 1,2 milho de sequncias derivadas de genes ativos nas amostras estudadas, depositadas em bancos de dados pblicos. Projetos desse tipo so viveis apenas quando os cidos nucleicos (DNA e RNA) das amostras de interesse esto muito bem preservados e disponveis. Assim, quando o Projeto Genoma Humano do Cncer comeou, o Hospital A. C. Camargo (tambm conhecido como Hospital do Cncer) decidiu criar um banco biolgico, com amostras de tecidos tumorais e normais armazenadas em condies ideais de preservao, que permitisse obter cidos nucleicos de alta qualidade (ver Iniciativa brasileira). Quando um paciente com cncer submetido a uma cirurgia, seu tumor retirado e analisado por mdicos patologistas, o que permite fornecer informaes importantes para a definio do tratamento. No entanto, o modo tradicional de confeccionar as lminas com material do tumor, para anlise ao microscpio, no adequado para a

preservao dos cidos nucleicos, sobretudo no caso do RNA. Para que esses cidos sejam aproveitados para estudos moleculares, o material excedente do tumor, que seria descartado, processado em condies altamente controladas, que mantm sua qualidade, fundamental para os projetos de pesquisa. As amostras, em condies adequadas, podem ser preservadas indefinidamente. Para isso, preciso definir procedimentos para coleta, armazenamento e manipulao dos tecidos, at o momento da extrao dos cidos nucleicos. Uma das etapas cruciais o congelamento das amostras em nitrognio lquido (a 196 C). Nos ltimos 12 meses, o biobanco aperfeioou os processos de coleta e armazenamento de tecidos, permitindo obter DNA e RNA com o mesmo nvel de qualidade que teriam se a extrao ocorresse no dia em que as amostras foram extradas dos pacientes.
o

CONTROLE DE QUALIDADE E ELEVADO APROVEITAMENTO

Um artigo interessante publicado em junho deste ano na revista norte-americana Wired Magazine, voltada para a divulgao de inovaes tecnolgicas, faz uma revelao surpreendente: muitos biobancos dos Estados Unidos, lder mundial em pesquisas cientficas e avanos tecnolgicos, tm amostras biolgicas humanas com qualidade inferior necessria para a conduo de estudos com tcnicas moleculares modernas. Isso evidencia a importncia de padronizao das etapas do processo, desde a coleta at a purificao das molculas de interesse. Diversos fatores podem interferir na qualidade do material, como tamanho das amostras coletadas, exatido do diagnstico, tempo para o congelamento (existe um tempo mximo aceitvel, chamado de tempo de hipxia fria, para a preservao de uma amostra de tecido fresco) e temperatura de armazenamento a longo prazo. Essa qualidade depende ainda da manuteno dos equipamentos usados na preservao e do treinamento adequado do pessoal encarregado da manipulao das amostras biolgicas. Para assegurar um padro exemplar, ficou clara a necessidade de controle minucioso da purificao dos cidos nucleicos das amostras de tumores. Por isso, em meados de 2004, o Hospital A. C. Camargo criou outro biobanco: o de macromolculas, incumbido de purificar DNA e RNA das amostras de tumores e do material biolgico dos pacientes. Esse novo banco tem como objetivo a recuperao de material gentico de alta qualidade e em gran

INICIATIVA BRASILEIRA. O Projeto Genoma Humano do Cncer (HCGP, na sigla em ingls) foi
lanado em 1999 pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (Fapesp) e pelo Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Cncer, ligado ao Hospital A. C. Camargo. Naquele momento, pesquisadores do estado de So Paulo finalizavam o sequenciamento do genoma da bactria Xylella fastidiosa (que ataca as laranjas), dentro de um programa da Fapesp, e as instituies e os pesquisadores envolvidos decidiram ousar, saltando dos genes de um organismo mais simples (no visado por outros grupos) para os humanos (tarefa de alta complexidade, que envolvia centenas de grupos mundiais). Alm disso, enquanto o genoma da X. fastidiosa foi sequenciado com mtodos j conhecidos, no caso dos genes do cncer foi utilizada uma tecnologia indita, desenvolvida no Brasil. O resultado foi um projeto de quase US$ 20 milhes, envolvendo mais de 30 laboratrios de pesquisa do estado de So Paulo. Aps cerca de trs anos de trabalho, que geraram algumas dezenas de artigos cientficos, o Brasil tornou-se o segundo maior contri-buidor mundial de sequncias derivadas de genes humanos e ativas em tecidos tumorais.

Figura 1. Total de amostras coletadas pelo Banco de Tumores do Hospital A. C. Camargo de 1997 a 2009. Ao fundo, imagem de tumor de mama

de quantidade. Ter um banco de cidos nucleicos vinculado ao banco de tumores vantajoso por- que possibilita extrair grande quantidade de DNA e RNA da mesma amostra de tecido, para uso em vrios estudos. O uso de maior nmero de amostras aumenta a capacidade de identificar marcadores moleculares nesse caso, caractersticas especfi- cas no DNA ou no RNA que podem ser associadas a determinadas caractersticas clnicas do paciente. O Banco de Tumores e o Banco de cidos Nu- cleicos no s controlam o diagnstico das amostras coletadas, mas tambm garantem a qualidade dos cidos nucleicos purificados desse material. Todas as etapas que podem afetar a qualidade final do material so controladas: o momento da coleta de amostras no centro cirrgico, o registro em um sistema informatizado, o congelamento e o armazenamento do tecido, a solicitao da amostra, a retirada do material do Banco de Tumores, a puri- ficao do DNA e do RNA, a avaliao de sua in- tegridade, a distribuio da molcula aos pesquisadores e o armazenamento do material excedente para uso posterior por outros projetos. Essa estrutura possibilitou altos ndices de apro- veitamento do material biolgico. Os dados mos- tram que, em conjunto, os dois bancos so capazes de preservar, com a qualidade necessria para uso em qualquer tipo de estudo molecular, o RNA de 73% das amostras de tecidos e o DNA de 99% de- las. Os biobancos contam hoje com mais de 20 mil amostras de tecidos (figura 1) e 5,5 mil amostras de cidos nucleicos extrados desses tecidos (3 mil amostras de RNA e 2,5 mil de DNA). Essas amos- tras de cidos nucleicos so utilizadas em projetos de pesquisa desenvolvidos no prprio instituto ou em colaborao com diversos outros projetos, na- cionais ou internacionais.

A TICA EM PESQUISA E OS BANCOS DE TUMORES A pesquisa com

amostras biolgicas humanas deve seguir princpios rgidos, regulamentados por nor- mas especficas no Brasil. Todo biobanco precisa ter um regulamento, aprovado pelo Comit de ti- ca em Pesquisa da instituio qual est vinculado, e os responsveis pela guarda do material e pela autorizao de uso devem ser identificados. O ma- terial guardado codificado, para assegurar a pri- vacidade do paciente doador da amostra e tornar confidenciais todos os dados associados. Alm disso, pesquisas que utilizem materiais do banco devem ser aprovadas pelo Comit de tica em Pesquisa, e h situaes em que necessria a aprovao da Comisso Nacional de tica em Pes- quisa. Para que amostras biolgicas sejam coleta- das e armazenadas para uso em pesquisas exigi- da a assinatura, pelo paciente ou responsvel legal, de um Termo de Consentimento Livre e Esclareci- do, que deve explicar, em linguagem clara e de

f- cil entendimento, o que um banco de tumores (ou qualquer outro biobanco com finalidade de pes- quisa) e qual a sua finalidade. Um aspecto interessante da regulamentao a exigncia de que os biobancos forneam, a intervalos predeterminados, informaes sobre as ati- vidades de pesquisa realizadas com as amostras ar- mazenadas. Essa talvez seja a finalidade principal de um biobanco: contribuir para o avano da pes- quisa em sade, para que, no futuro, possam ser obtidos resultados que levem a diagnsticos mais precisos, tratamentos mais adequados, melhores chances de sobrevida e melhor qualidade de vida.