UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

CAMILA VALENTE MAIOLINO

DESENVOLVIMENTO INICIAL DO CRNIO- MANDBULA DE Rhamdia quelen (Siluriformes: Heptapteridae)

CURITIBA 2009

ii CAMILA VALENTE MAIOLINO

DESENVOLVIMENTO INICIAL DO CRNIO-MANDBULA DE Rhamdia quelen (Siluriformes: Heptapteridae)

Monografia apresentada disciplina de Estgio em Biologia Celular como requisito parcial concluso do Curso de Bacharelado em Cincias Biolgicas, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran. Orientadora: Prof Dr Flavia SantAnna Rios

CURITIBA 2009

iii

Dedico este trabalho a meus pais e av, que me proporcionaram uma educao adequada para respeitar, estudar e admirar o mundo natural. Devo minha escolha e paixo pela profisso a eles.

Agradeo muito a meus pais, Nancy e Claudio, pela presena e apoio em todas as etapas da minha vida. A minha orientadora Flavia, por toda a pacincia e confiana que depositou em mim, alm da ajuda profissional. Ao MSc. Fernando A. Sedor (Museu de Cincias Naturais UFPR) e ao colega Andr M. Fontanelli pelo auxlio com a tcnica. Ao tcnico Jorge Daniel Mikos e ao Prof. Dr. Peter G. Kirschnik, pela ajuda e pela utilizao das dependncias do Setor de Piscicultura (LAPEP - PUCPR) durante as desovas induzidas. s colegas de trabalho Alana M. Rodrigues-Galdino e Patrcia R. Strher, pela disposio e auxlio durante a acomodao dos embries e registro fotogrfico. Um obrigado muito especial a todos os meus amigos queridos da biologia, da equipe do laboratrio de Biologia Adaptativa, do Museu de Cincias Naturais e do Colgio Militar de Curitiba, que estiveram sempre ao meu lado, seja em momentos de alegria ou desespero, com os melhores conselhos, piadas e companhia. A todos vocs, muito obrigada!

iv RESUMO A ontogenia inicial do crnio do peixe Rhamdia quelen foi descrita durante 13 estdios, sendo o primeiro equivalente ao momento da ecloso, 5 estdios larvais e 7 estdios ps-larvais, totalizando 26 dias de desenvolvimento a 26oC. O objetivo deste estudo foi descrever o desenvolvimento inicial do esqueleto da regio ceflica da espcie Rhamdia quelen, identificando os principais centros de ossificao, a seqncia de aparecimento e a morfologia de seus principais componentes. Foi empregada a tcnica de diafanizao e colorao do esqueleto, que precisou ser adaptada para organismos de tamanho reduzido. A anlise do material processado foi feita sob estereomicroscpio. No momento da ecloso nenhum componente esqueltico ceflico foi visualizado. Aps um dia de desenvolvimento, as larvas apresentavam as cartilagens iniciais de formao do neurocrnio e componentes do arco mandibular e hiide (viscerocrnio) em formao. Com 48h de desenvolvimento ps-ecloso (hpe), notou-se grande aumento de complexidade do condrocrnio. As cpsulas ticas e arcos branquiais comeam a se desenvolver e as trabculas marginais partem como processos da poro anterior das cpsulas ticas em formao. Com 72h de desenvolvimento, as trabculas cranii (cartilagens pr-cordais) unem-se anteriormente formando a placa etmoidal. Com 96hpe, verifica-se o aparecimento da lmina orbitonasal e a unio das trabculas marginais com a placa etmoidal, delimitando a regio da narina. De 96hpe at o primeiro estdio ps-larval estudado (7 dias), notam-se poucas alteraes no desenvolvimento craniano de R. quelen, mas os primeiros centros de ossificao aparecem, sendo estes referentes a placas drmicas associadas aos ltimos arcos branquiais. Em ps-larvas com 11 dias de desenvolvimento psecloso (dpe), verifica-se o aparecimento do centro de ossificao basioccipital, sobre a poro anterior da notocorda e a presena de otlitos (dois por cpsula tica). Os ossos dentrios e oprculos comeam a ser formados. Com 14 dpe, os ossos pr-maxilares comeam a ossificar. Os centros de ossificao exoccipitais e paraesfenide aparecem prximos ao basioccipital; as cartilagens hipoiais so formadas e verifica-se o incio da ossificao de certos componentes dos arcos branquiais 17 dias aps a ecloso. Com 21 dpe, a ponte epifisial formada e as cartilagens ceratoiais e osso angular comeam a ossificar. Os ossos drmicos maxilares, interoperculares e pterticos tambm iniciam seu desenvolvimento. No ltimo estdio analisado neste estudo (25 dpe), a ossificao dos arcos branquiais avana e o centro de ossificao paraesfenide une seus prolongamentos na regio anterior. Os resultados do presente estudo demonstram que, como esperado, o desenvolvimento inicial do crnio de R. quelen semelhante ao descrito para espcies de telesteos, apresentando algumas particularidades tpicas da Ordem Siluriformes, em decorrncia da morfologia e hbitos destes animais. Embora as estruturas cranianas apresentem baixa complexidade no momento da ecloso, o aparato bucal necessrio para a captura de alimento, bem como o aparato branquial, desenvolve-se durante o perodo larval e ps-larval, permitindo o incio da alimentao exgena. Palavras-chave: Dermatocrnio. Diafanizao. Jundi. Neurocrnio. Viscerocrnio.

v LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Exemplares juvenis de Rhamdia quelen.............................................2 Figura 2 - Esquema comparativo da vista dorsal da parte anterior do corpo de (A) Pimelodella (Pimelodidae) e (B) Rhamdia (Heptapteridae)................4 Figura 3 - Etapas do processo de diafanizao e colorao do esqueleto de pslarva de Rhamdia quelen, 21 dia ps-ecloso...................................11 Figura 4 - Regio ceflica de larva de Rhamdia quelen recm eclodida, diafanizada e corada.............................................................................................16 Figura 5 - Larvas de Rhamdia quelen com 24 horas de desenvolvimento psecloso diafanizadas e coradas.........................................................17 Figura 6 - Larvas de Rhamdia quelen com 48 horas de desenvolvimento psecloso diafanizadas e coradas.........................................................18 Figura 7 - Larvas de Rhamdia quelen com 96 horas de desenvolvimento psecloso diafanizadas e coradas.........................................................20 Figura 8 - Ps-larva de Rhamdia quelen com 11 dias de desenvolvimento psecloso, diafanizada e corada...........................................................22 Figura 9 Ps-larvas de Rhamdia quelen com 17 dias de desenvolvimento psecloso, diafanizadas e coradas.......................................................24 Figura 10 Ps-larvas de Rhamdia quelen com 21 dias de desenvolvimento psecloso, diafanizadas e coradas.......................................................25 Figura 11 Ps-larvas de Rhamdia quelen com 25 dias de desenvolvimento psecloso, diafanizadas e coradas.......................................................27

vi LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Principais eventos observados no desenvolvimento inicial do crnio de Rhamdia quelen em cada um dos 13 estdios estudados..............15

vii LISTA DE ABREVIATURAS

An angular (ossificao) bb I, II e IV cartilagem basibranquial I, II e IV bo centro de ossificao basioccipital cb 1, 2, 3, 4 e 5 cartilagens ceratobranquiais 1, 2, 3, 4 e 5 ch cartilagens ceratoiais co cpsulas ticas csa canal semicircular anterior csp canal semicircular posterior De dentrio (ossificao) eb 1, 2, 3 e 4 cartilagens epibranquiais 1, 2, 3 e 4 fbc formen basicapsular fj formen jugular hh cartilagens hipoiais hm cartilagens hiomandibulares hp 1, 2 e 3 cartilagens hipobranquiais 1, 2 e 3 ih cartilagens interiais lon lmina orbitonasal Mc cartilagens de Meckel Mx maxilar (ossificao) Op oprculo (ossificao) ot otlitos pc cartilagens paracordais pcor processo coronide da cartilagem de Meckel pd placa drmica munidas de dentes pe placa etmoidal Pesf centro de ossificao paraesfenide Pm pr-maxilar (ossificao) pop processo opercular da cartilagem hiomandibular pp processo pterigide ppe ponte epifisial Qu quadrado (ossificao)

viii qu cartilagens quadradas rb raios branquiostegais tc trabculas cranii tm trabculas marginais

ix SUMRIO

1 INTRODUO........................................................................................................ 1 2 OBJETIVOS............................................................................................................ 8 3 MATERIAL E MTODOS........................................................................................ 9 3.1. Obteno e incubao dos embries............................................................... 9 3.2. Amostragens de larvas e ps-larvas................................................................ 9 3.3. Fixao........................................................................................................... 10 3.4. Diafanizao e colorao do esqueleto.......................................................... 10 3.5. Captura de imagens....................................................................................... 13 4 RESULTADOS...................................................................................................... 15 4.1. Ecloso (Estdio 25)....................................................................................... 16 4.2. Larva 24h (Estdio 27).................................................................................... 17 4.3. Larva 48h (Estdio 27+).................................................................................. 17 4.4. Larva 72h (Estdio 28).................................................................................... 19 4.5. Larva 96h (Estdio 28+).................................................................................. 19 4.6. Larva 120h (Estdio 28++)............................................................................... 20 4.7. Ps-larva 7 dias (Estdio 29).......................................................................... 21 4.8. Ps-larva 11 dias (Estdio 29+)...................................................................... 21 4.9. Ps-larva 14 dias (Estdio 29++)..................................................................... 23 4.10. Ps-larva 17 dias (Estdio 30-)..................................................................... 23 4.11. Ps-larva 21 dias (Estdio 30)...................................................................... 25 4.12. Ps-larva 23 dias (Estdio 30+).................................................................... 26 4.13. Ps-larva 25 dias (Estdio 30++)................................................................... 27 5 DISCUSSO......................................................................................................... 29 6 CONCLUSO........................................................................................................ 34 REFERNCIAS........................................................................................................ 35

1 1. INTRODUO

Os peixes exibem grande diversidade na sua morfologia, habitat ocupado e biologia. Primeiramente, importante esclarecer que o termo peixe utilizado de diversas formas no meio cientfico. Para alguns, o termo refere-se apenas a gnatostomados (peixes com mandbula). Para outros, inclui tanto os peixes mandibulados, quanto os agnatos (sem mandbula). De qualquer maneira no possvel considerar o grupo peixes como monofiltico a partir dessas concepes, uma vez que, mesmo possuindo ancestral comum, ele exclui os tetrpodes. Sem carter filogentico, os peixes podem ser definidos como vertebrados aquticos, que apresentam brnquias durante a vida e apndices locomotores (quando presentes) em forma de nadadeiras (NELSON, 1994). Os peixes sseos (Osteichthyes) constituem o maior grupo vivente de Vertebrata. Seus primeiros fsseis datam do final do Siluriano e, durante o Devoniano, verifica-se uma grande radiao deste grupo, divergindo em peixes com nadadeiras raiadas (Actinopterygii) e peixes com nadadeiras lobadas (Sarcopterygii) (SCHULTZE, 1993). Esta radiao deve-se principalmente a especializao dos mecanismos de alimentao, diretamente relacionada a um aumento da mobilidade dos ossos do crnio e do aparelho bucal (POUGH et al., 2003). Apesar do nome, a presena de ossos no uma caracterstica exclusiva dos Osteichthyes. Evidncias fsseis sugerem que grupos anteriores no apenas apresentavam ossificao, mas muitos eram mais ossificados do que alguns grupos viventes atualmente (LAGLER et al., 1962). De qualquer forma a antiga classe Osteichthyes hoje considerada parafiltica, mas permanece sendo utilizada como forma de referir-se a Actinopterygii e Sarcopterygii, sem incluir as demais classes de Gnatostomata (NELSON, 1994). Os Actinopterygii compem o grupo de gnatostomados do qual se derivou a maioria dos peixes atuais. Apesar da grande diversidade de caractersticas derivadas no grupo, sugere-se que seja monofiltico. Divide-se nos grupos Condrostei, Holostei e Teleostei, sendo que este ltimo compreende cerca de 96% dos peixes viventes (BONE et al., 1995). O peixe empregado no presente estudo foi o bagre dulccola Rhamdia quelen (QUOY & GAIMARD, 1824), pertencente Ordem Siluriformes. Dentre os

2 telesteos, a ordem dos siluriformes constitui um grupo de grande sucesso evolutivo, diversidade e distribuio. Porm, suas relaes filogenticas soainda bastante incertas. Compe-se de 34 famlias, 412 gneros e aproximadamente 2400 espcies (NELSON, 1994). Rhamdia quelen (Fig. 1) encontrado comumente em rios, lagos e reservatrios na Amrica do Sul e Central (GOMES et al., 2000; PERDICES et al., 2002; SCHULZ; LEUCHTENBERGER, 2006). Popularmente, as espcies do gnero Rhamdia so chamadas de jundi, apresentando diversos sinnimos em todo o territrio nacional, como jandi, jundi-tinga e mandi, dentre outros

(BALDISSEROTTO; RADNZ-NETO, 2004).

Figura 1 - Exemplares juvenis de Rhamdia quelen. FONTE: Imagem gentilmente cedida por Peter G. Kirschnik (PUC-PR).

A classificao deste gnero ainda bastante discutida, sendo inicialmente inserido na famlia Pimelodidae, com quase 100 espcies. Em 1996, Silfvergrip1 (apud BALDISSEROTTO; RADNZ-NETO, 2004; GOMES et al., 2000) realizou uma reviso taxonmica baseada em morfologias internas e concluiu que para este gnero havia apenas 11 espcies. No entanto, muitos pesquisadores acreditam que a classificao de Rhamdia quelen esteja incorreta, sendo comum entre os especialistas em Siluriformes dividir a famlia Pimelodidae em Pimelodidae, Heptapteridae e Pseudopimelodidae. Nesta classificao, R. quelen pertenceria famlia Heptapteridae (BALDISSEROTTO; RADNZ-NETO, 2004; FROESE; PAULY, 2007). A espcie R. quelen tambm referida em textos mais antigos como
1

SILFVERGRIP, A.M.C. (1996). A systematic revision of the neotropical catfish genus Rhamdia (Teleostei, Pimelodidae). PhD (Thesis) Department of Zoology, Stockholm University and Department of Vertebrate Zoology, Swedish Museum of Natural History, Stockholm, Sweden, 156p.

3 R. branneri, R. sapo, R. hilarii, e R. sebae. Por ser uma espcie endmica, de fcil reproduo e outras propriedades zootcnicas apropriadas, seu cultivo vem aumentando no sul do Brasil, apresentando boa aceitao pelo mercado consumidor (GOMES et al., 2000). De modo geral, formas jovens de bagres facilitam estudos de

desenvolvimento morfolgico, uma vez que esses peixes produzem grande nmero de ovos, normalmente maiores do que outras espcies de telesteos, facilitando assim seu manuseio para estudos descritivos e experimentais (NORTHCUTT, 2003). No caso do jundi particularmente os ovos no se destacam pelo tamanho, medindo aproximadamente 1 mm de dimetro, mas so produzidos em grande quantidade e no so adesivos (GOMES et al., 2000), o que facilita a sua incubao e coleta. Os principais estdios de desenvolvimento da espcie foram previamente descritos (GODINHO et al., 19782, apud PEREIRA et al. 2006, LUCHINI; RANCEL, 1981; PEREIRA et al., 2006; RODRIGUES-GALDINO, 2006; RODRIGUESGALDINO et al., in press ). Seus ovos so esfricos e translcidos, com espao perivitelnico bem definido e crion resistente. Suas larvas, quando incubadas a 26C, eclodem com cerca de 27 horas aps a fertilizao (RODRIGUES-GALDINO, 2006) e parecem ter certa averso a luz, chegando a se alimentar melhor e crescer mais rapidamente quando incubadas em ambientes escuros (PIAIA et al., 1999; BEHR et al., 1999). Este comportamento pode ser decorrente dos prprios hbitos da espcie, que onvora e noturna (SCHULZ; LEUCHTENBERGER, 2006). R. quelen possui desenvolvimento similar ao de outras espcies do gnero Rhamdia, todavia poucas informaes a respeito da osteologia deste gnero encontram-se descritas (BICHUETTE; TRAJANO, 2005). Podem ser consideradas autapomorfias osteolgicas do gnero a presena de fontanela interrompida no nvel da borda posterior do olho e o processo occipital estreito e curto, no atingindo a placa pr-dorsal (Fig. 2). A superfcie superior do crnio normalmente recoberta por uma pele fina e a cabea comprimida dorso-ventralmente (BRITSKI et al., 1999).

GODINHO, H. M., FENERICH, N. A., NARAHARA, M. Y. (1978) Desenvolvimento embrionrio e larval de Rhamdia hilarii (Valenciennes, 1840) (Siluriformes, Pimelodidae). Revista Brasileira de Biologia, 38 (1): 151-156.

Figura 2 Esquema comparativo da vista dorsal da parte anterior do corpo de (A) Pimelodella (Pimelodidae) e (B) Rhamdia (Heptapteridae). FONTE: Britski et al., (1999), p. 175.

Para os vertebrados de forma geral, o crnio corresponde estrutura mais amplamente estudada e documentada sob o ponto de vista morfogentico (TORREY, 1978). Para Adriaens e Verraes (1997), no entanto, grande parte dos estudos referentes a peixes prioriza componentes sseos do crnio e, em alguns casos, somente no indivduo adulto. Em 1937, de Beer reuniu seus trabalhos anteriores publicando um dos livros mais importantes sobre o desenvolvimento do crnio de vertebrados, padronizando nomenclaturas at ento bastante diversas. Nas ltimas dcadas o interesse pelo estudo do crnio dos vertebrados, seu desenvolvimento e evoluo tem aumentado. Segundo Hanken e Hall (1993), isso se deve a diversos fatores, como o aumento de tecnologias empregadas e o grande desenvolvimento da sistemtica de vertebrados, o que torna o crnio uma fonte importante para a busca de caractersticas que possam ser usados no estudo filogentico. Tambm se observa o surgimento de uma nova tendncia para o estudo ontogentico, relacionando-o com o processo evolutivo. Segundo Carroll (2006, p.8): O desenvolvimento est intimamente ligado evoluo, porque a diversidade morfolgica surge por meio de alteraes nos embries. O crnio torna-se especialmente importante nesse tipo de estudo por possuir a funo de proteo do crebro e de grande parte dos rgos sensoriais localizados na cabea (CHAI; MAXSON, 2006). Tal funo acarreta em pouca flexibilidade para mudanas evolutivas, tornando essa poro do esqueleto bastante conservadora e conseqentemente de grande importncia para anlises filogenticas. O desenvolvimento do crnio e mandbula bastante complexo por existirem origens distintas para cada uma de suas pores, alm de diferentes tipos

5 e graus de ossificao (ROMER; PARSONS, 1985). Basicamente, os materiais que compem o crnio so dois tipos de tecidos conjuntivos de origem mesenquimal: cartilagens e ossos. No entanto, esse mesnquima pode ser derivado tanto do tubo neural (crista neural), como ocorre com grande parte das cartilagens formadoras do neurocrnio, quanto da mesoderme envolvida na formao do canal alimentar (mesoderme esplncnica), formando cartilagens do esqueleto visceral e tambm parte do neurocrnio (de BEER, 1937; THOROGOOD, 1993). A ossificao ainda pode ter uma terceira origem, sendo o resultado da invaso de cartilagens por vasos sanguneos e osteoblastos, formando centros de ossificao. Neste caso a ossificao conhecida como endocondral e os ossos resultantes deste processo, ossos de substituio. Ossos formados diretamente de precursores mesenquimais so chamados de ossos intramembranosos (de BEER, 1937). Acredita-se que muitos ossos, especialmente alguns da cabea, tenham evoludo de placas drmicas, o que poderia indicar a passagem de um esqueleto externo para interno nos ancestrais dos vertebrados (TORREY, 1978). Por isso, ossos intramembranosos eventualmente tambm so chamados de ossos drmicos. Ao longo do desenvolvimento embrionrio, o crnio dos vertebrados pode passar ento por trs estdios sucessivos: um estdio membranoso, um cartilaginoso (que se mantm em Condrichthyes adultos) e finalmente um estdio sseo, em que a cartilagem substituda por tecido sseo, total ou parcialmente (DEVILLERS, 1958). Segundo Depew e Simpson (2006) ainda, os gnatostomados apresentam trs crnios estruturalmente diferentes ao longo de sua ontogenia. Tipicamente, um crnio larval, um juvenil e finalmente um crnio adulto. O termo crnio, assim como o termo peixes discutido anteriormente, empregado de forma bastante variada. Normalmente, no senso comum, o termo equivale aos elementos do esqueleto ceflico. Para alguns autores, no entanto, o crnio formado apenas por dermatocrnio e neurocrnio, excluindo-se o viscerocrnio (formado por elementos derivados dos primeiros arcos branquiais) (KENT, 2001). Para outros, o termo crnio deve ser evitado, referindo-se somente aos seus trs componentes (ROMER; PARSONS, 1985). O incio do desenvolvimento do esqueleto ceflico em gnatostomados se d com a formao de um condrocrnio, formado por cartilagens e elementos endocondrais. Este condrocrnio composto por dois elementos chamados neurocrnio e viscerocrnio (KENT, 2001; DEPEW; SIMPSON, 2006). Num

6 segundo momento, a ontogenia do crnio marcada pelo aparecimento do dermatocrnio, composto por ossos intramembranosos que recobrem e

desenvolvem juntamente com o condrocrnio, sendo normalmente classificados topologicamente (DEPEW; SIMPSON, 2006). O neurocrnio, tambm chamado caixa craniana (ROMER; PARSONS, 1985), constitui a base do crnio e serve de proteo para o crebro e alguns rgos sensoriais. Seu desenvolvimento bastante similar em todos os gnatostomados, iniciando com o surgimento de algumas cartilagens isoladas que se desenvolvem at que possam se unir, formando placas maiores que, por sua vez, desenvolvem-se e constituem um neurocrnio cartilaginoso (KENT, 2001). Acreditase que tambm a poro anterior da notocorda tenha participao na induo da formao do neurocrnio (DEPEW; SIMPSON, 2006). Ao longo do desenvolvimento do neurocrnio so formados vrios centros de ossificao nas regies occipital, esfenide, etmide e tica, que se ampliam at que a estrutura se torne parcial ou totalmente ossificada (KENT, 2001). O viscerocrnio, tambm chamado esplancnocrnio (ADRIAENS; VERRAES, 1997; DEPEW; SIMPSOM, 2006), complexo palatino (ROMER; PARSONS, 1985) ou simplesmente, esqueleto visceral (de BEER, 1937; SCHULTZE, 1993), corresponde ao esqueleto formado por elementos derivados de arcos branquiais, os quais formam a base da arcada superior e inferior, ou arco mandibular (ROMER; PARSONS, 1985; DEPEW; SIMPSOM, 2006) e arco hiide (KENT, 2001). Alguns autores incluem tambm os arcos branquiais como esqueleto visceral. Basicamente, podem ser reconhecidos dois elementos principais no arco mandibular: o palato quadrado (dorsalmente) e a cartilagem de Meckel (ventralmente) (KENT, 2001). Dentes podem estar conectados ao tecido conjuntivo sobre estas estruturas ou nos ossos drmicos que as recobrem (SCHULTZE, 1993). O arco hiide, normalmente sustenta a arcada superior e inferior e os arcos branquiais, apresentando o maior nmero de segmentos, sustentam as brnquias e por vezes, placas drmicas com dentes (KENT, 2001). O dermatocrnio, tambm conhecido por escudo drmico (ROMER; PARSONS, 1985) o conjunto de ossos intramembranosos do crnio. Seus componentes so os ossos drmicos que recobrem o neurocrnio sobre o crebro, ossos drmicos da arcada superior, ossos drmicos do primeiro palato e ossos operculares (KENT, 2001). As variaes encontradas nessa poro do crnio dentro

7 do grupo Actinopterygii so extremas, contando com variaes nas propores entre os ossos, nmero, forma e espessura (SCHULTZE, 1993). Por ser um grupo bastante diversificado, os peixes apresentam diferentes especializaes, de acordo com as adaptaes ocorridas em cada grupo. O estudo comparativo do esqueleto ceflico de grupos relacionados pode facilitar a compreenso da histria evolutiva desses grupos e a forma como a estrutura modificou-se ao longo do tempo (KURATANI, 2007). Ao longo da evoluo, o que se observa uma tendncia reduo do nmero de ossos da cabea (GREGORY, 1965). Isto significa que em peixes, normalmente existem muito mais estruturas para serem visualizadas, compreendidas e identificadas, aumentando a

complexidade de seu estudo. No existem trabalhos publicados acerca do desenvolvimento da regio craniana da espcie Rhamdia quelen. No presente estudo, a formao do esqueleto ceflico do jundi (R. quelen) foi analisada desde o momento da ecloso at o incio do perodo juvenil (30 dias aps a ecloso), visando contribuir com o acmulo de informaes acerca da espcie. Por ser uma espcie de posio taxonmica ainda discutvel, o estudo ontogentico do crnio pode fornecer grande nmero de caractersticas, que possibilitem o melhor posicionamento taxonmico e

filogentico.da espcie.No entanto, no se pretende neste momento fazer interpretaes e discusses filogenticas com base nos resultados obtidos, sendo esta uma possibilidade para trabalhos futuros.

8 2. OBJETIVOS

Objetivo Geral:

Descrever o desenvolvimento inicial do esqueleto da regio ceflica do peixe jundi (Rhamdia quelen) no perodo larval e ps-larval.

Objetivos Especficos:

Descrever a seqncia ontogentica da formao do esqueleto na regio ceflica de R. quelen. Descrever a morfologia das principais estruturas do neurocrnio viscerocrnio e dermatocrnio durante a sua formao. Identificar os principais centros de ossificao do crnio.

9 3. MATERIAL E MTODOS

3.1 Obteno e incubao dos embries

Os ovos utilizados foram obtidos e fertilizados no Laboratrio de Pesquisas em Piscicultura (LAPEP) da PUC-PR (So Jos dos Pinhais PR) em 25/03/09. As matrizes foram selecionadas de acordo com o grau de maturao sexual e para a induo da desova, foi administrado extrato hipofisrio de carpa diludo em soro fisiolgico, seguindo o protocolo Baldisserotto e Radnz-Neto (2004). Os gametas extrados foram armazenados em recipientes individuais para anlise de volume e viabilidade at o momento da fertilizao. A mistura dos gametas foi realizada primeiramente a seco, para em seguida ser hidratada com pequena quantidade de gua das incubadoras, proporcionando a fecundao de fato. Os embries foram transportados para o Laboratrio de Biologia Adaptativa, Departamento de Biologia Celular, Setor de Cincias Biolgicas da UFPR, onde foram incubados em recipientes plsticos com aproximadamente 6L, com sistema esttico, aerao constante e temperatura de 26 C controlada por termostato . Devido ao pequeno tamanho dos ovos, optou-se pela no utilizao de filtros, sendo por isso necessrio que as incubadoras fossem sifonadas diariamente e a gua renovada a cada semana. O acompanhamento do desenvolvimento foi realizado ao microscpio ptico. A partir do segundo dia aps a ecloso, as larvas foram

alimentadas de duas a trs vezes por dia, com nuplios de artmias vivos, incubados em gua salobra com aerao a temperatura de 28C.

3.2 Amostragens de larvas e ps-larvas

As larvas e ps-larvas foram coletadas com o uso de pipetas e transferidas primeiramente para placas de Petri, para facilitar sua captura com o mnimo de gua possvel. Foram amostrados no total 13 estdios, compreendendo o momento da ecloso, 5 estdios larvais (coleta diria) e 7 estdios ps-larvais (duas coletas por semana). Cada amostra consistiu de 6 indivduos.

10 3.3 Fixao

As amostras foram divididas no momento da fixao, sendo 3 indivduos de cada estdio fixados em paraformaldedo 4% diludo em tampo PBS 0,1 M, pH 7,2 (PFA4%) e os outros 3 indivduos fixados em formaldedo 5%. Em ambos os casos o tempo de fixao foi de 3 a 6 horas e aps este perodo as amostras eram transferidas para lcool 70%, armazenadas sem exposio luz e em temperatura ambiente, at o momento da diafanizao, por no mximo 30 dias. O pH do fixador extremamente importante para a preservao de estruturas mineralizadas, sendo por isso neutralizado previamente e armazenado sob refrigerao com a mnima exposio luz, para evitar a formao de cido (VANZOLINI, 1967)

3.4 Diafanizao e colorao do esqueleto

A diafanizao consiste em clarear os tecidos, possibilitando o estudo de estruturas internas. Juntamente com o uso de coloraes especficas, a tcnica bastante til para o estudo de esqueletos delicados, uma vez que mantm todos os seus componentes em suas posies originais (SOUZA, 2002). No presente

estudo, a tcnica foi testada e adaptada para a obteno de melhores resultados para o material biolgico em estudo, uma vez que no havia informao na literatura desta tcnica em formas jovens de peixes. Todo o material foi processado individualmente em placas de Petri de 3,5 ou 6,0 cm de dimetro, de acordo com o tamanho do exemplar. Antes de iniciar o processo de diafanizao e colorao, os exemplares foram imersos em gua de torneira por um perodo de 1 a 4h, para retirar o excesso de fixador ou lcool (Fig. 3 A). Para a colorao de cartilagens, o material foi imerso em uma soluo alcolica de Azul de Alcian 8GX 0,2 mg/mL preparada conforme se segue (modificado a partir de DINGERKUS; UHLER, 1977), em volume suficiente para cobrir o exemplar (Fig. 3 B):

1mg de Azul de Alcian 8GX 4mL de lcool 95% P.A. 1mL de cido actico glacial

11

Figura 3 - Etapas do processo de diafanizao e colorao do esqueleto de ps-larva de Rhamdia quelen, 21 dias ps-ecloso. (A) Lavagem do material em gua de torneira. (B) Colorao de cartilagens com Azul de Alcian. (C) Ao inicial da soluo diafanizadora (KOH 6%). (D) Larva aps tratamento inicial de KOH 6%, seguido de tratamento com gua oxigenada 10V por 3 minutos. (E) Adio de uma gota de soluo supersaturada de Vermelho de Alizarina S. Destaque para a mudana de cor do laranja ao prpura, quando em contato com a soluo bsica KOH 6%. (E) Larva diafanizada e corada, armazenada em glicerina pura. *bolha de ar presa na cavidade farngea, formada devido ao tratamento anterior com gua oxigenada 10V. Escala: 0,5 mm.

O tempo de imerso na soluo corante foi definido por meio da observao do exemplar sob um estereomicroscpio, verificando a colorao nos pontos em que a presena de cartilagens esperada, como a regio ceflica e nadadeiras. Notou-se que este perodo varia de acordo com o fixador utilizado. Para algumas larvas fixadas em PFA 4% o tempo de colorao foi menor, levando menos de 2 horas, enquanto larvas de mesmo estdio fixadas em formaldedo 5% levaram de 5

12 a 7 horas para ficarem bem coradas. Segundo Hanken & Wassersug (1981), os exemplares no devem ser deixados excessivamente na soluo de Alcian Blue, para evitar que tecidos sseos comecem a perder clcio. Isto ainda mais preocupante no estudo do desenvolvimento, pois alguns estdios so marcados pelo primeiro aparecimento de estruturas sseas, o que pode ser mascarado pela m administrao desta etapa. Aps a colorao de cartilagens, a soluo de Azul de Alcian substituda por lcool 95% e aps 15min, por lcool 70%, tendo permanecido nesta soluo por mais tempo se necessrio para acomodao de horrios, ou iniciado o processo de diafanizao aps 15min. Para o processo de diafanizao, utilizaram-se solues aquosas de hidrxido de potssio (KOH) na concentrao de 6%. Os exemplares ficaram imersos nestas solues at ser possvel a visualizao de estruturas internas do animal, como o olho do lado oposto ou at mesmo componentes esquelticos (Fig. 3 C). Neste momento, procedeu-se a colorao das estruturas mineralizadas. Exemplares muito pigmentados (normalmente ps-larvas) foram submetidos tambm a um tratamento com gua oxigenada 10 volumes, durante o processo de diafanizao. Para isso, estas amostras foram inicialmente embebidas pela soluo diafanizadora (KOH 6 ou 12%) e quando encontravam-se parcialmente clarificadas, mas ainda com forte pigmentao superficial, eram transferidas para a gua

oxigenada 10 volumes, por um perodo de 3 a 5 minutos (Fig. 3 D). Depois retornavam para um novo KOH de mesma concentrao anterior, aonde aguardariam um maior grau de clarificao para que suas estruturas mineralizadas pudessem ser coradas. Infelizmente, o tratamento com gua oxigenada pode resultar na formao de bolhas no interior do material, muitas vezes dificultando sua anlise. No entanto, sua aplicao de grande valia para a total despigmentao do pele, o que tambm seria prejudicial para a anlise. Para a colorao das estruturas mineralizadas utilizou-se uma soluo supersaturada de Vermelho de Alizarina S em cido actico glacial (modificado a partir de WASSERSUG, 1976). Essa soluo utilizada em pequena quantidade (1 a 2 gotas por amostra), que deve ser adicionada placa contendo a soluo de KOH supracitada. O Vermelho de Alizarina S freqentemente usado como corante para estruturas contendo clcio (LILLIE, 1977), embora possa ser tambm considerado como indicador cido-base, alterando-se do amarelo para o prpura na

13 faixa de pH 3,7-5,2 (Fig. 3 E) (LONG, 19613 apud. LILLIE, 1977). importante ento que a soluo supersaturada de Vermelho de Alizarina S seja adicionada exatamente nesta etapa, pois os tecidos estando parcialmente macerados permitem a penetrao do corante Para que os exemplares no fossem danificados por ao excessiva do hidrxido nesta etapa de colorao, em alguns casos adicionou-se pequena quantidade de glicerina. A glicerina neutra e, portanto no interfere na colorao, mas sua consistncia permite uma melhor sustentao das larvas, evitando rupturas at o fim da diafanizao. O tempo de imerso na mistura bsica contendo Vermelho de Alizarina S foi varivel, de 1 a 5 horas, dependendo apenas do grau de diafanizao procurado. Aps a colorao das estruturas sseas e diafanizao completa das amostras, todas foram transferidas para a glicerina pura. Aps alguns dias essa glicerina precisou ser trocada por nova, pois o excesso de corante a tornava levemente rosada. Em todos os exemplares larvais e ps-larvais processados notou-se o aparecimento de pontos azuis por toda a pele do espcime. Essas pontuaes so coradas pelo Alcian Blue e podem indicar a presena de clulas produtoras de muco. Em alguns exemplares mais tardios, ao final do processo de diafanizao a pele estava rompida, sendo por isso delicadamente removida com o auxlio de agulhas. Nos espcimes mais jovens, devido fragilidade do material esse procedimento no pode ser realizado. As amostras permanecem armazenadas em glicerina pura, abrigadas da luz (para evitar seu desbotamento), em pequenos frascos de vidro ou em placas de 24 poos, facilitando o estudo do desenvolvimento. Para garantir maior durabilidade do material processado, foram adicionados alguns cristais de Timol em todas as amostras armazenadas (DINGERKUS; UHLER, 1977; HANKEN; WASSERSUG, 1981).

3.5 Captura de imagens e identificao das estruturas

As amostras foram analisadas sobre um estereomicroscpio binocular ZEISS Stemi 2000-C. Para facilitar a compreenso e exposio do trabalho, foi feito

LONG, C. (1961). Biochemists Handbook. Princeton, N.J.: D.Van Nostrand Co., Inc.

14 o registro fotogrfico das vrias etapas do desenvolvimento sseo. As imagens digitais dos exemplares diafanizados e corados foram obtidas por meio de uma cmera Sony-Cyber Shot 13.6 MP, acoplada ao mesmo estereomicroscpio utilizado em sua anlise. O estadiamento da espcie foi feito de acordo com Rodrigues-Galdino et. al. (in press). A terminologia anatmica adotada neste trabalho corresponde a nomenclatura utilizada por de Beer (1937), considerando-se pequena alterao devido traduo.

15 4. RESULTADOS

Os principais eventos do desenvolvimento inicial do esqueleto ceflico da espcie Rhamdia quelen, quando incubada a 26C, sob condies laboratoriais, foram identificados e descritos. A Tabela 1 resume as principais alteraes observadas em cada estdio, acerca do desenvolvimento da regio ceflica. Os trs principais componentes do crnio (neurocrnio, dermatocrnio e viscerocrnio) foram analisados separadamente para cada estdio e encontram-se descritos a seguir. Uma vez que o dermatocrnio s comea a se formar 7 dias aps a ecloso, este componente comea a ser descrito a partir deste estdio.
TABELA 1. Principais eventos observados no desenvolvimento inicial do crnio de Rhamdia quelen em cada um dos 13 estdios estudados. Idade N Observaes Figura Ecloso 5 Provvel incio de formao das cartilagens paracordais. Fig. 4 (Estdio 25) Larva 24h 5 Incio da formao das cartilagens pr-cordais do Fig. 5 (Estdio 27) neurocrnio; aparecimento das cartilagens de Meckel, hiomandibulares, quadradas, interiais e incio da formao das cartilagens ceratoiais do viscerocrnio. Larva 48h 5 Incio do desenvolvimento das cpsulas ticas a Fig. 6 + (Estdio 27 ) aparecimento das trabculas marginais no neurocrnio. Processo pterigide da cartilagem quadrada comea a se desenvolver. Cartilagens ceratoiais e as trs primeiras ceratobranquiais formadas. Larva 72h 5 Trabculas cranii unidas anteriormente, formando a placa ____ (Estdio 28) etmoidal. A ponte epifisial comea a ser formada. As cartilagens basibranquial I, ceratobranquiais 4 e epibranquiais 1, 2 e 3 coram-se fracamente, indicando uma formao inicial. Larva 96h 5 Aparecimento da lmina orbitonasal e unio das Fig. 7 + (Estdio 28 ) trabculas marginais a placa etmoidal (delimitao da cavidade olfativa). As cartilagens paracordais unem-se formando a placa basal. Larva 120h 5 Formao dos pares de cartilagem epibranquiais 4 e ____ ++ (Estdio 28 ) ceratobranquiais 5. Ps-larva 7dias 5 Alongamento da poro do processo pterigide ligada a ____ (Estdio 29) cartilagem quadrada. Primeiros sinais de ossificao com placas drmicas sendo formadas prximas as cartilagens epibranquiais 4. Ps-larva 11 dias 5 Aparecimento do centro de ossificao basioccipital e Fig. 8 + (Estdio 29 ) visualizao de otlitos (dois em cada cpsula tica). Processo coronide da cartilagem de Meckel est bem desenvolvido. Incio da ossificao dos oprculos e aparecimento de dois pares de raios branquiostegais. O dentrio comea a ser formado. Ps-larva 14 dias 5 Aparecimento das cartilagens hipobranquiais 1, 2 e 3 e _____

16
(Estdio 29 ) incio da ossificao dos pr-maxilares e das cartilagens ceratobranquiais 5. Quatro pares de raios branquiostegais so visveis. Ps-larva 17 dias 5 Aparecimento dos centros de ossificao exoccipitais e (Estdio 30 ) paraesfenide. O centro de ossificao basioccipital desenvolve expanses e reentrncias. Aparecimento das cartilagens hipoiais e inicio da ossificao das cartilagens basibranquial I, ceratobranquiais 3 e 4 e epibranquiais 3 e 4. Ps-larva 21 dias 4 A ponte epifisial formada. As cartilagens ceratoiais (Estdio 30) comeam a ossificar, bem como suas articulaes com as cartilagens interiais. A cartilagem de Meckel comea a ossificar em sua extremidade dorsal (formao do osso angular). Ossos maxilares, interoperculares e pterticos (possivelmente) comeam a se formar. Dentrios e prmaxilares bem ossificados na poro rostral. Ps-larva 23 dias 6 O centro de ossificao paraesfenide une-se (Estdio 30+) anteriormente, assumindo a forma de uma seta. Todas as cartilagens ceratobranquiais e as epibranquiais 2, 3 e 4 iniciaram sua ossificao Ps-larva 25 dias 6 Os processos operculares das cartilagens ++ (Estdio 30 ) hiomandibulares e o primeiro par de cartilagens epibranquiais comeam a ossificar. N = nmero de exemplares processados e analisados em cada estdio.
++

Fig. 9

Fig. 10

____

Fig. 11

4.1. Ecloso (Estdio 25) No momento da ecloso, aparentemente no existe nenhum componente esqueltico formado. Em apenas um dos cinco exemplares processados, notam-se duas manchas azuis, prximas poro anterior da notocorda. A posio ocupada por tais estruturas indica que seriam os primrdios das cartilagens paracordais (Fig.4).

Figura 4 Regio ceflica de larva de Rhamdia quelen recm eclodida, diafanizada e corada. pc cartilagens paracordais. Escala: 0,2 mm.

17 4.2. Larva 24h (Estdio 27) Neurocrnio Com um dia de desenvolvimento aps a ecloso, poucas estruturas do neurocrnio esto formadas (Fig. 5). Notam-se as cartilagens paracordais, ainda pouco desenvolvidas, posteriores ao olho e prximas da cartilagem hiomandibular (viscerocrnio). Notam-se tambm duas manchas alongadas fracamente coradas, conectadas as cartilagens paracordais e alcanando o nvel da margem anterior do olho. Por sua localizao, essas marcas provavelmente representam as cartilagens pr-cordais (trabcula cranii) em formao.

Figura 5 Larvas de Rhamdia quelen com 24 horas de desenvolvimento ps-ecloso diafanizadas e coradas. (A) vista lateral; (B) vista ventral. Cartilagens: ch - ceratoial; hm - hiomandibular; ih - interial; Mc - de Meckel; tc trabcula cranii. Escala: 0,2 mm

Viscerocrnio As larvas apresentam as cartilagens de Meckel j formadas e unidas rostralmente, cartilagens hiomandibulares com o formen para o nervo facial definido, cartilagens quadradas e interiais, conectadas respectivamente a cartilagem de Meckel e a cartilagem ceratoial em formao. Na poro ventral da cartilagem interial, sob vista lateral, observa-se uma expanso, a qual resultar na formao da cartilagem ceratoial. (Fig. 5) 4.3. Larva 48h (Estdio 27+) Neurocrnio Ao segundo dia de desenvolvimento, observa-se um grande aumento de complexidade do neurocrnio (Fig. 6). As cartilagens pr-cordais so estruturas alongadas, que passam ventralmente prximas aos olhos. Ainda no esto unidas

18 em sua extremidade anterior, onde formaram a placa etmoidal. Na outra extremidade, esto unidas as cartilagens paracordais, que acompanham

lateralmente a poro anterior da notocorda. A cpsula tica comea a se desenvolver neste estdio, sendo visvel uma fenestra grande na base de cada uma, com um formato irregular, pois ainda est se diferenciando em fenestras basicapsulares e formen jugular. As paredes laterais externas e posteriores das cpsulas ticas tambm comeam a se erguer, sendo identificados os canais semicirculares anterior e posterior. Conectadas aos canais semicirculares

anteriores, existem duas barras que se projetam para a poro anterior do crnio, paralelas s cartilagens pr-cordais, chamadas de trabculas marginais. Embora paralelas s trabculas cranii, essas cartilagens no so to longas e passam dorsalmente prximas aos olhos.

Viscerocrnio Neste estdio, o processo pterigide da cartilagem quadrada comea a se desenvolver. Uma poro rostral desse processo tambm aparece, prxima ao barbilho maxilar. As cartilagens ceratoiais formaram-se e quase se unem em sua poro anterior. Os trs primeiros arcos branquiais comeam a se formar, sendo visveis, no entanto apenas suas cartilagens ceratobranquiais. (Fig. 6).

Figura 6 Larvas de Rhamdia quelen com 48 horas de desenvolvimento ps-ecloso diafanizadas e coradas. (A) Vista latero-dorsal; (B) vista dorsal. cb 1, 2 e 3 cartilagens ceratobranquiais 1, 2 e 3; ch cartilagem ceratoial; co cpsulas ticas; fbc - formen basicapsular; fj formen jugular em formao; hm - cartilagem hiomandibular; ih - cartilagem interial; Mc cartilagem de Meckel; pc cartilagem paracordal; pp processe pterigide; qu cartilagem quadrada; tc trabcula cranii; tm trabcula marginal. Escala: 0,2 mm.

19 4.4. Larva 72h (Estdio 28) Neurocrnio Com trs dias de desenvolvimento, as trabculas cranii chegam a se unir anteriormente, iniciando a formao da placa etmoidal. As cartilagens paracordais tambm se aproximam, quase se fusionando na extremidade anterior da notocorda. O teto da cpsula tica comea a se formar, mas em sua base ainda identifica-se um nico formen de formato irregular. Nas trabculas marginais, forma-se um processo voltado para a regio dorsal do crnio, no nvel da margem anterior do olho. Esse processo dar origem ponte epifisial.

Viscerocrnio Verifica-se o aparecimento da cartilagem basibranquial I entre as pores anteriores das cartilagens ceratoiais. Embora bastante prximos, esses trs elementos no esto conectados. Os pares de cartilagem ceratobranquial 1, 2, 3 e 4 e das trs primeiras cartilagens epibranquiais j so visveis. O processo pterigide desenvolve-se muito pouco, tanto em sua poro rostral, quanto na poro conectada a cartilagem quadrada. Na cartilagem de Meckel, verifica-se o aparecimento do processo coronide, prximo ao contato com a cartilagem quadrada, mas voltado para a regio dos olhos. 4.5. Larva 96h (Estdio 28+) Neurocrnio A placa etmoidal se desenvolve e as lminas orbitonasais surgem como um processo em cada trabcula cranii, voltado para a poro dorsal do crnio e imediatamente anterior aos olhos. As trabculas marginais alcanam a placa etmoidal e a rea formada entre a lmina orbitonasal, a trabcula marginal e a placa etmoidal, delimita a regio da narina. As cartilagens paracordais finalmente se unem na extremidade anterior da notocorda, formando a placa basal. (Fig. 7)

Viscerocrnio Neste estdio o viscerocrnio apresenta poucas alteraes, sendo visvel um maior desenvolvimento dos trs primeiros arcos branquiais. A quarta cartilagem epibranquial ainda no est visvel, e posterior ao basibranquial I, a segunda

20 cartilagem basibranquial est comeando a se formar. O processo pterigide da cartilagem quadrada praticamente no se altera. (Fig. 7)

Figura 7 Larvas de Rhamdia quelen com 96 horas de desenvolvimento ps-ecloso diafanizadas e coradas. (A) Vista lateral; (B) vista dorsal; (C) vista latero-ventral; (D) vista anterior, rostral. cb 1, 2, 3 e 4 cartilagens ceratobranquiais 1, 2, 3 e 4; ch cartilagem ceratoial; co cpsula tica; csa canal semicircular anterior; csp canal semicircular posterior; eb 3 e 4 cartilagens epibranquiais 3 e 4; hm cartilagem hiomandibular; lon lmina orbitonasal; Mc cartilagem de Meckel; pc cartilagem paracordal; pcor processo coronide; pe placa etmoidal; pop processo opercular; pp processo pterigide; ppe: processo formador da ponte epifisial; qu cartilagem quadrada; tm trabcula marginal; * placa basal. Escala: 0,2 mm.

4.6. Larva 120h (Estdio 28++) Neurocrnio e viscerocrnio Comparando-se as larvas de 120 horas de desenvolvimento e 96 horas, praticamente no h alterao. Com relao ao viscerocrnio, os pares de cartilagens epibranquiais 4 e ceratobranquiais 5 j esto formados.

21 4.7. Ps-larva 7 dias (Estdio 29) Neurocrnio e viscerocrnio O neurocrnio e viscerocrnio permanecem muito similares aos dois estdios anteriores. Os processos das trabculas marginais que formaro a ponte epifisial desenvolvem-se um pouco mais, mas ainda esto bem distantes um do outro. No viscerocrnio, notam-se que as cartilagens epibranquiais 1, 2, 3 e 4 e as cartilagens ceratobranquiais 1, 2, 3, 4 e 5 esto mais desenvolvidas, sendo o quinto par de ceratobranquiais um pouco menor que os demais. Tambm a articulao entre a cartilagem de Meckel e quadrada parece bem formada. As pores posteriores das cartilagens de Meckel apresentam uma fossa perfeita para o encaixe das cartilagens quadradas. Os processos pterigides destas ltimas tambm esto mais desenvolvidos, alcanando o nvel mdio dos olhos.

Dermatocrnio Com 7 dias de desenvolvimento aps a ecloso, aparecem os primeiros sinais de ossificao e formao de componentes do dermatocrnio. Prximas e ventrais s quartas cartilagens epibranquiais do viscerocrnio comea a se formar um par de placas drmicas, com alguns dentes voltados para baixo (cavidade farngea). Normalmente, essas placas com dentes so formadas abaixo das cartilagens faringobranquiais ou acima das cartilagens hipobranquiais, uma vez que as cartilagens ceratobranquiais e epibranquiais sustentam as brnquias (KENT, 2001). No entanto, cartilagens faringobranquiais ainda no so visveis neste estdio, mas possivelmente correspondem a regio do aparecimento destas placas drmicas. Em alguns exemplares essa ossificao bastante inicial, sendo visveis apenas pontuaes roxas na regio correspondente. Em outros, alguns dentes j podem ser visualizados. 4.8. Ps-larva 11 dias (Estdio 29+) Neurocrnio A ossificao do neurocrnio inicia-se pela placa basal, com aparecimento de um nico centro de ossificao basioccipital, localizado na extremidade anterior da notocorda. Os otlitos tornam-se visveis (dois em cada cpsula tica). (Fig. 8).

22 Viscerocrnio O processo coronide da cartilagem de Meckel est bem desenvolvido quase tocando a poro rostral do processo pterigide. Nenhum componente do viscerocrnio comea de fato a ossificar. No entanto, assim como no estdio anterior algumas de suas cartilagens comeam a ser recobertas por ossos drmicos. Essas ossificaes sero comentadas no dermatocrnio, uma vez que no constituem ossificaes de cartilagens e sim aparecimento de ossos intramembranosos.

Figura 8 Ps-larva de Rhamdia quelen com 11 dias de desenvolvimento ps-ecloso difanizada e corada. bo centro de ossificao basioccipital; pd placa drmica com dentes; ot otlitos. Escala: 0,5 mm.

Dermatocrnio O oprculo comea a ossificar, sob a forma de um tringulo posterior a cartilagem hiomandibular, com apenas duas margens ossificadas. A juno dessas margens coincide com o processo opercular da cartilagem hiomandibular. Dois pares de raios branquiostegais so agora visualizados, como finos arcos de ossificao. O dentrio comea a se formar ao redor da poro mais rostral da cartilagem de Meckel. Na arcada superior, so visveis algumas pontuaes abaixo da placa etmoidal, tambm na poro mais anterior, indicando o incio da ossificao dos pr-maxilares. As placas drmicas com dentes abaixo das quartas cartilagens epibranquiais esto um pouco maiores e apresentam vrios dentes cnicos em sua margem ventral. Posicionam-se abaixo das cpsulas ticas, prximas as margens laterais da notocorda, no entanto em um nvel inferior. (Fig. 8).

23 4.9. Ps-larva 14 dias (Estdio 29++) Neurocrnio O centro de ossificao basioccipital praticamente no avana,

permanecendo ao redor da poro anterior da notocorda (Fig. 10). Os processos das trabculas marginais tornam-se mais prximos, mas ainda no se encontram para formar a ponte epifisial.

Viscerocrnio Neste estdio, os trs primeiros arcos branquiais passam a apresentar cartilagens hipobranquiais, que ainda coram pouco, indicando que esto em formao. Estas cartilagens so menores e situam-se em pares, internas as cartilagens ceratobranquiais. A quinta cartilagem ceratobranquial comea a ossificar, tambm apresentando dentes voltados para a cavidade faringiana. Neste caso, a prpria cartilagem parece ossificar, diferentemente do que acontece com a quarta cartilagem epibranquial nos estdios anteriores, onde uma placa drmica com dentes aparece prxima a sua poro ventral. Ainda neste estdio, o processo pterigide da cartilagem quadrada apresenta um enorme desenvolvimento, chegando muito prximo de sua poro rostral.

Dermatocrnio Os pr-maxilares aparecem como centros de ossificao finos abaixo da placa etmoidal. A ossificao do dentrio, ao redor da cartilagem de Meckel avana, alcanando o processo coronide. Os oprculos se desenvolvem pouco e 4 pares de raios branquiostegais so visveis neste estdio, parecendo conectados a poro mais larga das cartilagens ceratobranquiais. 4.10. Ps-larva 17 dias (Estdio 30-) Neurocrnio Novos centros de ossificao do neurocrnio aparecem neste estdio. O paraesfenide reconhecido como um nico centro de ossificao bastante fino, imediatamente anterior ao basioccipital (Fig. 9). Esse centro bifurcado anteriormente, formando dois prolongamentos em direo a cartilagem etmoidal, que alcanam o nvel da margem posterior dos olhos. Na regio occipital, dois novos centros de ossificao podem ser reconhecidos, iniciando a formao dos

24 ossos exoccipitais (laterais ao formen magnum). Estes centros aparecem como um par de membranas sseas, prximas, porm no conectadas, ao basioccipital. O centro de ossificao do basioccipital tambm comea a se diferenciar, formando duas expanses em sua poro anterior (sobre o paraesfenide) e duas reentrncias em sua poro posterior.

Figura 9 Ps-larvas de Rhamdia quelen com 17 dias de desenvolvimento ps-ecloso, diafanizadas e coradas. (A) vista ventral; (B) Vista latero-ventral. bo centro de ossificao basioccipital; cb 1, 2, 3, 4 e 5 cartilagens ceratobranquiais 1, 2, 3, 4 e 5; ch cartilagem ceratoial; De dentrio; hb 1, 2 e 3 cartilagens hipobranquiais 1, 2 e 3; hh cartilagem hipoial; Mc cartilagem de Meckel; Op oprculo; pd placa drmica com dentes; pe placa etmoidal; Pesf centro de ossificao paraesfenide; Pm pr-maxilar; * basibranquial; centro de ossificao exoccipital. Escala: 0,5 mm.

Viscerocrnio Os trs primeiros pares de cartilagens hipobranquiais encontram-se bem formados neste estdio, bem como as duas cartilagens hipoiais, conectadas a extremidade mais larga das cartilagens ceratoiais. A cartilagem basibranquial I comea a ossificar anteriormente. Os pares de cartilagens ceratobranquiais e epibranquiais 3 e 4 comeam a ossificar pelo centro, enquanto o quinto par de cartilagens ceratobranquiais parece mais ossificado que os outros dois, sendo o nico com dentes cnicos voltados para a cavidade farngea. O quarto par de cartilagens epibranquiais tambm apresenta dentes, no entanto, como dito anteriormente, esses dentes parecem conectados a uma placa drmica localizada ventralmente s cartilagens, pois estas ainda esto fracamente ossificadas. (Fig. 9).

25 Dermatocrnio Poucas alteraes so observadas no pr-maxilar, dentrio e oprculos em formao. Um novo par de raios branquistegais visualizado, totalizando agora seis pares de finos raios ossificados.

4.11. Ps-larva 21 dias (Estdio 30) Neurocrnio A ponte epifisial finalmente formada, pela unio dos processos dorsais das trabculas marginais. (Fig. 10). O centro de ossificao basioccipital aumenta de tamanho e o paraesfenide avana pouco, mas parece mais ossificado.

Figura 10 Ps-larvas de Rhamdia quelen com 21 dias de desenvolvimento ps-ecloso, diafanizadas e coradas. (A) vista lateral; (B) vista ventral. An angular em formao; bbI, II e IV cartilagem basibranquial I, II e IV; bo centro de ossificao basioccipital; ch cartilagem ceratoial; De dentrio; lon lmina orbitonasal; Mc cartilagem de Meckel; Mx maxilar; Op oprculo; ot otlito; pd placa drmica com dentes; Pm pr-maxilar; rb raios branquiostegais; centro de ossificao exoccipital. Escala: 0,5 mm.

Viscerocrnio As cartilagens ceratoiais comeam a ossificar em suas pores anteriores e posteriores e a articulao entre a cartilagem ceratoial e o interial comea tambm a ossificar. As articulaes entre as cartilagens quadradas e as de Meckel encontramse ainda mais ossificadas e nesta ocasio a prpria cartilagem de Meckel que est ossificando em sua poro posterior, ao contrrio do que observado na poro anterior ou rostral, em que a cartilagem na verdade recoberta por ossos drmicos. Essa ossificao da cartilagem de Meckel dar origem ao osso angular. (Fig. 10).

26 Dermatocrnio Os ossos maxilares comeam a se formar, prximos aos barbilhes maxilares. Os ossos pr-maxilares e dentrios apresentam numerosos dentes cnicos e na poro rostral aparecem bem ossificados. Posterior as cpsulas ticas identificado um par de novas ossificaes. Pela posio, podem corresponder aos primrdios dos ossos pterticos. O oprculo est maior e mais ossificado e apresenta a forma de um grande tringulo (Fig. 10). As duas margens observadas primeiramente na formao deste osso formaram uma articulao tridimensional com o processo opercular da cartilagem hiomandibular. O osso interopercular tambm comea a ser formado, entre o angular (em formao) e o oprculo. 4.12. Ps-larva 23 dias (Estdio 30+) Neurocrnio Neste estdio, o centro de ossificao paraesfenide avana em direo a cartilagem etmoidal, unindo as duas bifurcaes na poro anterior e assumindo a forma de uma flecha. No entanto, continua sendo reconhecido como um osso muito fino. Os centros de ossificao exoccipitais se desenvolvem e comeam a curvar para a regio dorsal.

Viscerocrnio As cartilagens ceratoiais esto bem ossificadas em uma regio central, e nas suas extremidades, permanecem com uma ossificao inicial. A ossificao que acompanha a cartilagem basibranquial I comea a formar expanses que se assemelham com um V aberto para o sentido posterior. As cartilagens ceratobranquiais 1, 2, 3 e 4 ainda apresentam uma ossificao leve (corada fracamente), mas agora essa ossificao substitui quase toda a cartilagem, faltando apenas suas extremidades. O quinto par de cartilagens ceratobranquiais ainda o mais ossificado. As cartilagens epibranquiais 2, 3 e 4 tambm comearam a ossificar pela regio central.

Dermatocrnio O dermatocrnio apresenta poucas alteraes, salvo o aparecimento de um novo par de raios branquiostegais. As expanses laterais observadas na ossificao da cartilagem basibranquial I (viscerocrnio) so provavelmente ossos

27 intramembranosos, pois no esto substituindo cartilagens, e por sua forma e localizao e provvel que dem origem aos ossos pterigides do palatoprimrio. 4.13. Ps-larva 25 dias (Estdio 30++) Neurocrnio e dermatocrnio O neurocrnio e o dermatocrnio praticamente no apresentam alteraes em relao ao estdio anterior.

Figura 11 - Ps-larvas de Rhamdia quelen com 25 dias de desenvolvimento ps-ecloso, difanizadas e coradas. (A) vista lateral; (B) vista dorsal; (C) vista lateral - detalhe da regio opercular; (D) vista ventral. An angular em formao; bo centro de ossificao basioccipital; cb 1, 2, 3, 4 e 5 - cartilagens ceratobranquiais 1, 2, 3, 4 e 5; ch cartilagem ceratoial; De dentrio; eb 3 e 4 cartilagens epibranquiais 3 e 4; hh cartilagem hipoial; hm cartilagem hiomandibular; Mc cartilagem de Meckel; Mx maxilar; Op oprculo; ot otlito; pcor processo coronide da cartilagem de Meckel; pd placa drmica com dentes; pe placa etmoidal; Pesf centro de ossificao paraesfenide; Pm pr-maxilar; pop processo opercular da cartilagem hiomandibular; pp processo pterigide da cartilagem quadrada; ppe ponte epifisial; Qu quadrado em formao (ossificao da cartilagem quadrada); rb raios branquiostegais; * basibranquial; centro de ossificao exoccipital. Escala: 0,5 mm.

28 Viscerocrnio O processo opercular da cartilagem hiomandibular comea a ossificar e as demais pores desta cartilagem esto fracamente coradas em todos os exemplares, como se estivessem sendo reduzidas. Neste estdio, o primeiro par de cartilagens epibranquiais tambm comea a ossificar, da mesma forma que os demais, por sua regio central. (Fig. 11).

29 5. DISCUSSO

No momento da ecloso, apenas um dos exemplares analisados apresentava cartilagens paracordais no incio de sua formao. Os demais no apresentavam nenhuma marcao de componente esqueltico neste estdio, indicando que o desenvolvimento do crnio em Rhamdia quelen possivelmente inicia-se logo aps a ecloso. A forma como o condrocrnio comea a ser formado entre os telesteos dita similar (KENT, 2001), mas o momento em que este desenvolvimento iniciado pode variar bastante. Em Salmo fario (Clupeiformes), por exemplo, as primeiras cartilagens formadoras do neurocrnio podem aparecer at seis dias antes da ecloso (de BEER, 1937), enquanto em Sander lucioperca (Perciformes), nenhum componente esqueltico visualizado quando as larvas eclodem (LFFLER et al., 2008). Dentre os siluriformes, encontram-se espcies como Galeichthys feliceps (Ariidae), onde as larvas j eclodem com o crnio ossificado (TILNEY; HECHT, 1993) e Corydoras aeneus (Callichthyidae), em que no momento da ecloso as larvas apresentam apenas um neurocrnio rudimentar articulado com alguns elementos do viscerocrnio (HUYSENTRUYT et al., 2008). No entanto, existem outras espcies deste grupo, como Heterobranchus longifilis (Clariidae) e Chrysichthys auratus (Claroteidae) em que nenhum primrdio do condrocrnio registrado em larvas recm-eclodidas (VANDEWALLE et al., 1997 e 1999). Normalmente, as espcies de Siluriformes apresentam um limitado grau de complexidade do condrocrnio no momento da ecloso, quando comparadas com outras espcies de telesteos (HUYSENTRUYT et al., 2008). A simples comparao temporal do desenvolvimento em peixes complicada, uma vez que diversos fatores abiticos podem alterar a velocidade de desenvolvimento das espcies, normalmente em propores diferentes. No entanto, o momento da ecloso, independente do tempo necessrio para que ocorra, um momento crtico, pois logo as larvas esgotaro seu estoque de vitelo e precisaro se alimentar de forma exgena. Dessa maneira, esperado que ao menos o mnimo do aparato bucal necessrio para a captura de alimento seja formado o mais rpido possvel nas larvas recm-eclodidas (FAUSTINO; POWER, 2001). Isso poderia justificar o rpido desenvolvimento do condrocrnio observado em Rhamdia quelen, entre a ecloso e o segundo dia de desenvolvimento ps-ecloso, coincidindo

30 inclusive com o momento em que as larvas incubadas foram alimentadas pela primeira vez. A esse respeito, seria esperado um maior desenvolvimento do processo pterigide da cartilagem quadrada nos primeiros estdios de ps-larva, a fim de auxiliar na alimentao exgena. Na espcie R. quelen a sustentao da arcada superior parece embasar-se durante boa parte do desenvolvimento inicial do condrocrnio nas cartilagens trabeculares do neurocrnio. Isso observado em muitas espcies de peixes e um dos principais argumentos que defendem uma origem visceral para as trabculas cranii, como componentes do arco mandibular (de BEER, 1937). A primeira ossificao observada no estdio ps larval com 7 dias de desenvolvimento pode ser tambm relacionada alimentao exgena das larvas. Verificou-se que em R. quelen os primeiros sinais de ossificao aparecem como o centro de ossificao basioccipital e placas drmicas com dentes localizadas prximas as cartilagens epibranquiais, seguidos das ossificaes dos oprculos, dentrios e pr-maxilares. Geralmente, os primeiros ossos drmicos a serem formados em gnatostomados so aqueles associados alimentao e respirao (SCHULTZE, 1993; FAUSTINO; POWER, 2001), como verificado na espcie estudada. Assim como na maioria dos telesteos, o incio do desenvolvimento do viscerocrnio e neurocrnio foi simultneo em R. quelen. O neurocrnio de R. quelen desenvolve-se de forma similar ao padro encontrado em outros siluriformes. Por serem espcies normalmente bentnicas e noturnas, comum apresentarem olhos reduzidos e outras estruturas sensoriais como narinas e botes gustativos mais desenvolvidos (BRITSKI et al., 1999), alm de apresentarem boca normalmente ventral. Essas caractersticas levaram a algumas modificaes no crnio destes peixes, que passou a ser mais largo e achatado dorso-ventralmente, facilitando a vida destes organismos no fundo e diminuindo a resistncia contra correntes (GOMES et al., 2000). Esse tipo de crnio dito platibsico, em oposio ao crnio dito tropibsico da maioria dos telesteos (DAGET, 19644 apud ADRIAENS; VERRAES, 1997). Assim como os demais siluriformes, o peixe jundi apresenta certas particularidades no desenvolvimento craniano em funo desta morfologia tpica da ordem.
4

DAGET, J. (1964). Le crane des Tlostens. Mmoires du Muse National dHistoire Naturelle Serie A 31: 163-341.

31 A presena de trabculas cranii bem afastadas observada no

desenvolvimento de R. quelen, portanto, comum para espcies de Siluriformes, umas vez que, por possurem olhos reduzidos, a regio do neurocrnio apresenta mais espao livre, no havendo necessidade dessas trabculas se unirem mais do que sua extremidade anterior (ADRIAENS; VERRAES, 1997). Isso produz uma placa etmoidal bastante reduzida, estreita na direo antero-posterior, porm larga de lado a lado e, conseqentemente, uma fenestra hipofisial muito maior do que o padro para outras espcies de telesteos. As trabculas marginais do neurocrnio, normalmente aparecem como cartilagens isoladas em telesteos, dorsais s trabculas cranii e que se desenvolvem no sentido anterior e posterior (de BEER, 1937). No entanto, em R. quelen, essas cartilagens aparecem pela primeira vez claramente conectadas ento aos processos anteriores nos das cpsulas seguintes. ticas, Esse

desenvolvendo-se

anteriormente

estdios

desenvolvimento foi verificado tambm em Clarias gariepinus (Clariidae) (ARIAENS; VERRAES, 1997) e em Corydoras aeneus (Callichthyidae) (HUYSENTRUYT et al., 2008), podendo ser um padro no desenvolvimento dessas estruturas em Siluriformes. O aparecimento dos otlitos foi curiosamente registrado apenas em pslarvas com 11 dias de desenvolvimento. Trabalhos de estadiamento anteriores desta espcie feitos por nosso grupo de pesquisa relacionam o aparecimento dessas estruturas ao final do perodo de segmentao, muito antes da ecloso (RODRIGUES-GALDINO, 2006; RODRIGUES-GALDINO et al., in press). importante ressaltar que nos estudos mencionados os otlitos foram observados em embries vivos e sem nenhum procedimento para evidenciao. possvel que esta defasagem seja conseqncia de alteraes na composio dessas estruturas ao longo do desenvolvimento, sendo ento formadas anteriormente, mas alterando sua composio em estdios ps-larvais, quando ento passariam a ser coradas. De qualquer forma, os otlitos no so de fato componentes sseos. So estruturas importantes para a orientao e locomoo dos peixes, sendo por isso formados ainda nos estdios embrionrios da maioria dos telesteos (POUGH et al., 2003). Inicialmente aparecem como membranas que recobrem a mcula sensorial e gradualmente calcificam-se em formas concntricas, formando estruturas bem mineralizadas (BONE et al., 1995).

32 Com relao morfologia do esqueleto visceral, observou-se em R. quelen, que a poro rostral do processo pterigide da cartilagem quadrada parece no fusionar-se em momento algum com a parte posterior. Essa cartilagem, equivalente a poro rostral do processo pterigide, recebe diferentes nomes na literatura5, podendo no existir em muitos telesteos, fusionar-se ao processo pterigide da cartilagem quadrada em outros, ou ficar livre (de BEER, 1937), como observada neste estudo. Segundo Adriaens e Verraes (1997), a descontinuidade desta cartilagem com o processo pterigide uma caracterstica sinapomrfica dos siluriformes, podendo este ser o resultado de um novo arranjo que permite uma articulao com os barbilhes maxilares. A respeito dos arcos branquiais, o desenvolvimento de R. quelen tambm pode ser considerado similar ao padro encontrado em Siluriformes, iniciando o desenvolvimento dos arcos do mais anterior para o posterior e sempre primeiramente com o aparecimento das cartilagens ceratobranquiais. No entanto, normalmente, o aparecimento das cartilagens ceratobranquiais seguido da formao de cartilagens hipobranquiais, basibranquiais e s ento (quando presentes) as epibranquiais e faringobranquiais (VANDEWALLE et al.,1997; ADRIAENS; VERRAES, 1997). Em R. quelen, o aparecimento de cartilagens hipobranquiais s foi verificado no estdio ps-larval com 14 dias de

desenvolvimento ps-ecloso, muito aps a formao das cartilagens epibranquiais. Talvez essa variao ocorra em decorrncia de possuir um desenvolvimento relativamente mais lento, sendo necessria a formao dos segmentos que suportam de fato as brnquias (cartilagens ceratobranquiais e epibranquiais) antes dos demais. A presena de cartilagens faringobranquiais e o nmero exato de cartilagens basibranquais para a espcie R. quelen permanece incerto, pois verificou-se claramente que o desenvolvimento do esqueleto ceflico desta espcie no acaba nos estdios ps-larvais. muito provvel que novas estruturas ainda sejam formadas em estdios posteriores, quando a espcie j considerada juvenil. Quanto quinta epibrnquia, tambm no registrada no desenvolvimento de R. quelen, possvel que no seja formada, mesmo posteriormente, uma vez que essa

Cartilagem palatina (ADRIAENS; VERRAES, 1997), rostral (HUYSENTRUYT et al., 2008).

33 caracterstica igualmente registrada em outras espcies de Siluriformes descritas (ADRIAENS; VERRAES, 1997). O desenvolvimento do dermatocrnio em R. quelen parece se dar prioritariamente nos estdios juvenis, uma vez que o acompanhamento da ontogenia do esqueleto ceflico durante os estdios larvais e ps-larvais contou com o aparecimento de algumas estruturas drmicas iniciais e nenhuma chegou a ossificar completamente. A denominao juvenil normalmente utilizada para definir o momento em que o espcime j apresenta as caractersticas morfolgicas tpicas do adulto. Por meio da anlise dos resultados nota-se que o esqueleto ceflico no termina seu desenvolvimento nos estdios ps-larvais. No entanto, importante lembrar que os indivduos utilizados neste estudo foram incubados sob condies laboratoriais, sem esconderijos e com a alimentao oferecida de duas a trs vezes por dia. Em seus ambientes naturais, esses organismos poderiam alimentar-se constantemente e procurar reas mais lodosas e profundas (escuras), onde seu crescimento fosse o mais facilitado possvel. provvel que em ambientes naturais e at mesmo em centros de piscicultura adequados, essa espcie alcance um tamanho muito maior no perodo de 25 dias. As primeiras ossificaes do dermatocrnio identificadas neste estudo (placas drmicas com dentes associadas aos arcos branquiais, dentrios, prmaxilares, oprculos e raios branquiostegais) tiveram boa parte de seu desenvolvimento acompanhado e por isso sua identificao foi relativamente fcil. As ltimas estruturas do dermatocrnio a serem formadas no perodo estudado (maxilares, interoperculares e pterticos) ainda estavam iniciando seu

desenvolvimento nos ltimos estdios estudados no presente trabalho. Sua identificao foi feita com base na localizao e comparaes feitas com trabalhos de desenvolvimento e descries osteolgicas de indivduos adultos da ordem Siluriformes. O estudo do desenvolvimento do crnio em estdios posteriores da espcie R. quelen, no abordados neste momento, seria til para uma identificao mais segura desses elementos. As descries do dermatocrnio, tanto relacionadas ao desenvolvimento, quanto em indivduos adultos so complicadas, uma vez que seus componentes so identificados em geral topograficamente. No existem evidncias de um exocrnio comum a todos os gnatostomados e a nomenclatura utilizada para os ossos do dermatocrnio foi criada para tetrpodes, mais especificamente para humanos e

34 posteriormente aplicada a peixes (SCHULTZE, 1993). A presena de um nmero muito maior de elementos drmicos em peixes torna a identificao de homologias ainda mais complexa. De modo geral, o desenvolvimento inicial do crnio de R. quelen pode ser considerado similar ao observado nas demais espcies de telesteos, apresentando caractersticas comuns s espcies de Siluriformes.

35 6. CONCLUSES

O desenvolvimento inicial do esqueleto ceflico da espcie Rhamdia quelen foi descrito com base em 13 estdios, do momento da ecloso ao fim do perodo ps-larval, permitindo-se concluir que:

No momento da ecloso as larvas no apresentam nenhum componente esqueltico na regio ceflica. O incio do desenvolvimento do neurocrnio e viscerocrnio simultneo e d-se nos estdios de larvas com at 24 horas de desenvolvimento psecloso, para indivduos incubados a 26C. As primeiras ossificaes so observadas em ps-larvas com 7 dias de desenvolvimento ps-ecloso, correspondendo a ossificaes do neurocrnio e dermatocrnio. Aps o aparecimento das primeiras ossificaes, aquelas relacionadas alimentao e respirao crescem mais rapidamente. O dermatocrnio apresentou-se pouco desenvolvido at o estdio de 25 dias de desenvolvimento ps-ecloso, sendo possvel que grande parte de sua formao se d nos estdios juvenis (a partir de 30 dias de desenvolvimento). A ordem de formao dos segmentos dos arcos branquiais da espcie R. quelen no segue a ordem normalmente descrita para outras espcies de Siluriformes, em que primeiro formam-se os segmentos mais ventrais para depois serem formados segmentos dorsais. Os primeiros elementos dos arcos branquiais a serem formados nesta espcie correspondem s cartilagens que suportam as brnquias de fato (cartilagens ceratobranquiais e epibranquiais). A espcie R. quelen apresenta um desenvolvimento do esqueleto ceflico esperado para espcies da Ordem Siluriformes, acerca da formao dos arcos branquiais. com pequena variao

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