FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULAR BIO035 GUA DE TRABAJO PRCTICO N 1

INSTRUMENTACIN Y PREPARACIN DE SOLUCIONES SOLUCIONES

I TRODUCCI
El laboratorio no es un lugar peligroso, siempre y cuando se acte en l de manera responsable y cuidadosa. Para esto, es importante tener en cuenta ciertas medidas de orden que se aplican en todos los laboratorios y por sobre todo un buen uso del sentido comn. De esta forma, es necesario recordar algunos principios bsicos generales: 1. El mesn de trabajo debe estar siempre libre de efectos personales tales como abrigos, carteras, libros, etc. que entorpezcan el trabajo y que adems puedan daarse por el contacto con reactivos qumicos, agua o calor. 2. Los reactivos qumicos a utilizar deben ser manipulados con precaucin, de acuerdo a sus caractersticas. Esta estrictamente prohibido pipetear directamente con la boca soluciones altamente alcalinas, cidos concentrados o material biolgico de riesgo. Si la va de desecho de estas soluciones es el desage del laboratorio (previa indicacin del profesor responsable del trabajo prctico), hacer correr abundante agua de manera simultanea para reducir el dao que estas soluciones fuertes pudieran ocasionar a las tuberas. Tener en cuenta que hay soluciones tales como el H2SO4 que reaccionan violentamente con el agua, por lo tanto se debe proceder con sumo cuidado. 3. Si Ud. esta manipulando sustancias inflamables, asegrese antes de destapar el frasco que no existan llamas abiertas ni material incandescente en las proximidades de su lugar de trabajo. 4. Si Ud. calienta una sustancia en un tubo de ensayo, no apunte la boca del tubo en direccin de alguna persona. Una ebullicin violenta de la solucin podra quemar a dicha persona. 5. Cuando trabaje con sustancias txicas voltiles debe hacerlo bajo una campana de extraccin. Recuerde que un gas o vapor nocivo no siempre es perceptible por el olor. 6. Los materiales de desecho no solubles (papel filtro usado, fsforos, corchos deteriorados, etc.) deben tirarse al basurero o recipiente destinado para esta funcin, jams dentro del desage del laboratorio. 7. Al trmino de cada sesin experimental, el mesn de trabajo y sus alrededores deben quedar limpios y secos. Todos los reactivos e implementos utilizados deben ser guardados en sus sitios respectivos. Asegrese siempre que las llaves de gas y agua estn correctamente cerradas.

MATERIALES DE LABORATORIO
Material Volumtrico. Durante el trabajo de laboratorio, en muchas oportunidades es necesario medir con exactitud volmenes de lquidos para la correcta ejecucin del paso experimental. Para ello, existen diversos tipos de materiales volumtricos. Por lo tanto, es necesario conocer los diferentes tipos de materiales y tener claro cual utilizar en cada ocasin. Cabe sealar que la precisin de la medida con estos materiales puede verse alterada. Considerando que la mayora de los materiales volumtricos que se usan en el laboratorio estn hechos en vidrio, y teniendo en cuenta que este material puede dilatarse o contraerse segn la temperatura a la que esta expuesto, se ha establecido un estndar convencional de 20C para material de laboratorio destinado a medir volmenes. La graduacin de los utensilios considera dos tipos de posibilidades: Aforo para contener Aforo para entregar volmenes determinados El nivel de los lquidos se estima por el aforo, que se define como la tangente horizontal al menisco inferior del lquido. Para realizar la medida, el nivel del lquido debe encontrarse frente al ojo del observador en posicin vertical. Mientras ms estrecho sea el dimetro donde se realiza el aforo este ser ms exacto.

Fig. 1: posicin del ojo para aforar de manera correcta una solucin

A continuacin se describen los elementos ms usados en la medicin de volmenes en el laboratorio: 1. PROBETAS Son cilindros verticales graduados, provistos de una base hexagonal. Sus capacidades normalmente son de 25, 50, 100, 250, 1000 y 2000 ml. El aforo esta previsto para entregar volmenes. Debido a que su dimetro interior es amplio, las probetas sirven slo para mediciones aproximadas de volmenes. La graduacin de una probeta est en relacin a su capacidad, as la ms grande tiene una graduacin de 5 a 10 ml por cada divisin, en cambio las ms pequeas pueden tener hasta 1/10 de ml.

2. MATRACES AFORADOS Son botellas redondas de fondo plano, con cuello largo y estrecho y estn confeccionados en vidrio no apto para resistir cambios de temperatura. Los matraces aforados estn previstos para contener volmenes con bastante exactitud, por lo que son usados para preparar soluciones en que es importante conocer la concentracin exacta de ellas. Estas soluciones pueden ser preparadas por dilucin de una cantidad conocida o medida de lquido, agregando agua (u otro solvente) hasta completar el volumen. Tambin los matraces aforados se emplean para preparar soluciones de una concentracin muy exacta por disolucin de una cantidad precisa de sustancia previamente pesada, completando finalmente el volumen hasta el aforo con agua u otro solvente segn sea el caso. Hay matraces aforados con capacidad para contener a 20C y con bastante exactitud 25, 50, 100, 250, 300, 1000 y 2000 ml de lquido o solucin.

3. PIPETAS Se emplean para medir y entregar con precisin volmenes menores de lquidos y soluciones. Dado que las pipetas son tubos de seccin estrecha se logra una buena exactitud en la entrega de volmenes por este tipo de material. La abertura del tubo en el extremo superior (bucal) de la pipeta, es de borde muy parejo, ya que habitualmente se hace succin con la boca y se obstruye hermticamente la salida del lquido con ayuda de la yema del dedo ndice. El lquido succionado se mantiene dentro de la pipeta, en tanto no se permite la entrada de aire. Quitando parcialmente o totalmente el dedo de la abertura superior, se consigue el vaciado paulatino o rpido del contenido de la pipeta. La succin de lquidos corrosivos, txicos o de riesgo biolgico debe siempre realizarse con la ayuda de peras de goma o jeringas adaptables a la boca de la pipeta (llamadas propipetas) para evitar la posibilidad que estos materiales lleguen a la boca del usuario. El extremo aguzado permite la entrega del lquido gota a gota. Sin embargo, el orificio estrecho del extremo inferior est pensado de manera que no entre aire con facilidad mientras se transporta el lquido de un recipiente a otro. Existen pipetas de diferentes capacidades: 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 25 ml. Y generalmente estn diferenciadas por un color en la graduacin. Ellas son capaces de entregar volmenes totales o parciales.

4. PIPETAS VOLUMETRICAS Se reconocen por presentar su parte central ms dilatada. Estas pipetas estn diseadas para entregar un volumen bien determinado, el cual est indicado en el cuerpo de ella. Este volumen puede estar delimitado por uno o dos aforos. Si son dos las marcas, el volumen indicado escurre cuando el menisco del lquido se mueve desde la marca superior a la marca inferior. Si es una sola marca (en el tubo superior), el volumen queda comprendido aquella marca y el extremo inferior de la pipeta. Al trmino del vaciamiento deben esperarse 15 segundos para que escurra todo el lquido que queda mojando las paredes de la pipeta.

5. BURETA Puede ser definida como una pipeta graduada y dotada de un mecanismo regulable para vaciarla. En el extremo inferior lleva intercalada una llave de vidrio o plstico inerte (tefln). Las graduaciones ms comunes de una bureta son 25 y 50 ml., existiendo tambin microburetas de 1.5 y 10 ml.

6. MATRACES ERLENMEYER Son usados comnmente para efectuar titulaciones, reacciones y para calentar soluciones, ya que su forma cnica evita en gran parte la evaporacin. Tambin posee graduaciones, pero las medidas que se realizan con ellas son slo aproximadas. Existen matraces Erlenmeyer de 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 ml.

7. VASO DE PRECIPITADO Se usa comnmente para preparar soluciones o efectuar reacciones. Estos vasos poseen graduaciones de 5, 10, 50,125, 250,.2000 ml., sin embargo hay que tener en cuenta que esta graduacin es slo aproximada y permite estimar volmenes, por lo tanto no son aptos para preparar soluciones en las cuales se desee un cierto grado de exactitud.

EQUIPAMIE TO BSICO DE LABORATORIO. En la actualidad el equipamiento de los laboratorios se ha ampliado de manera considerable con la invencin de nuevas tecnologas. No obstante, a continuacin se describirn instrumentos de uso general y bsico de un laboratorio comn. 1. BALANZA DE LABORATORIO La unidad internacionalmente reconocida como patrn de peso es el kilogramo (kg). Sin embargo, comnmente en el laboratorio la unidad de peso ms usada es el gramo (g), as como el miligramo (mg) y el microgramo (g) que son submltiplos del gramo. La balanza es un instrumento que sirve para medir la masa de los cuerpos por el peso, es decir para determinar las veces que ellos contienen la unidad de masa llamada gramo.

a) Balanza de precisin: Se caracteriza por un sistema oscilante de una barra o cruz apoyada sobre una columna. Actualmente a este tipo de balanza se le ha adicionado un sistema electrnico que registra la pesada. La capacidad de carga de las balanzas de precisin es generalmente hasta 500g y ms comnmente hasta 200g, con una exactitud de pesada al centsimo de gramo.

b) Balanza analtica: Es un instrumento de alta precisin empleada en la pesada de reactivos livianos (del orden de los miligramos). A pesar de que las balanzas analticas pueden presentar un variado tipo de diseos y aspectos exteriores, todas ellas se construyen basadas en los mismos principios. La base es de gran solidez y confiere estabilidad al instrumento evitando al mximo la posibilidad de vibraciones. La columna es un tubo por el cual se conduce el mando de arresto o bloqueo del sistema oscilante. La cruz esta hecha de una aleacin especial de aluminio u otro metal estable que no permita deformaciones por el peso variable que debe soportar.

APLICACIN DE CALOR

Un recurso habitualmente usado en el laboratorio es la aplicacin de calor sobre muestras en orden a acelerar reacciones qumicas, esterilizar, secar, calcinar, etc. Con este fin se emplean materiales resistentes al calor tales como tubos de ensayo, matraces erlenmeyer, crisoles, vasos de precipitado, balones matraces de fondo redondo. A menudo, la principal fuente de calor utilizada en el laboratorio es el mechero Bunsen. No obstante tambin se pueden utilizar baos termorregulados para cuando la temperatura de calentamiento que se desea aplicar no sobrepase los 90C. Estos en general funcionan con agua pero existen otros que emplean sustancias oleosas para alcanzar temperaturas superiores al punto de ebullicin del agua. El uso de resistencias elctricas en la generacin de calor es otro de los procedimientos comnmente usados en el laboratorio. Estos estn presentes en instrumentos tales como hornos, autoclaves, mantas, baos secos, etc. La principal ventaja que presentan los baos termorregulados y aquellos instrumentos que utilizan como fuente de calor resistencias elctricas es que son cmodos de trabajar, poseen exactitud en la regulacin trmica y son seguros en su manejo.

APLICACIN DE FRO En ciertas ocasiones durante el trabajo de laboratorio es necesario la aplicacin de fro sobre ciertas muestras. Ello ayuda por ejemplo en la caracterizacin de sustancias puras por su punto de fusin, en la regulacin de reacciones qumicas y procesos enzimticos, solubilizacin o liquefaccin de gases, condensacin o retencin de vapores, cristalizacin y precipitacin, estabilizacin de material biolgico, liofilizacin, etc. Probablemente en algunas secciones de este curso prctico Ud. trabajar con material biolgico (tejidos, estructuras celulares, etc.), los cuales debern ser mantenidos en hielo. Esto tiene como objetivo la preservacin funcional de dichos materiales biolgicos. Hay que tener en cuenta que a temperaturas ms elevadas (temperatura ambiente o mayor) una gran variedad de funciones biolgicas se deterioran irreversiblemente.

PREPARACI DE SOLUCIO ES - CLCULO DE CO CE TRACIO ES

SOLUCIO ES ACUOSAS En una solucin acuosa se pueden distinguir 2 componentes: el soluto y el solvente. Solvente es el componente que se encuentra en mayor proporcin y el soluto en menor proporcin. Para identificar una solucin no basta con indicar sus componentes, sino tambin es fundamental conocer la proporcin de stos en la solucin. SOLUTO + SOLVENTE = SOLUCION

EXPRESIO ES DE CO CE TRACIO Concentraciones basadas en el volumen y, en la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen son las ms ampliamente utilizadas en el trabajo de laboratorio. Las expresiones ms usadas son: MOLARIDAD (M): Se define como el nmero de moles de soluto por litro de solucin. Para calcular M (molaridad) se necesita conocer el peso del soluto y su peso molecular (PM):

Una solucin 1M: contiene 1 mol de soluto por litro de solucin; contiene el nmero de Avogadro de molculas de soluto por litro de solucin. *Nmero de Avogadro: nmero de molculas por gramo-mol; nmero de tomos por gramo/tomo; nmero de iones por gramo-in; su valor numrico es 6,023 x 1023.

Una vez preparada una solucin, esta se puede mantener como solucin stock concentrada y a partir de ella se pueden prepara diluciones necesarias, debido a que el nmero de moles no se altera al diluir una muestra, por lo tanto se establece que:

Ci x Vi = Cf x Vf

Donde la concentracin inicial (Ci) debe tener la misma unidad que la concentracin final (Cf) y el volumen inicial (Vi) debe tener la misma unidad que el volumen final (Vf). Soluciones ms diluidas en general se expresan en trminos de milimolaridad (mM), micromolaridad (M), u otras, donde: 1 mmol = 10-3 moles 1 mol = 10-6 moles 1 nmol = 0,001 mol = 10-9 moles 1 pmol = 0,001 nmol = 10-12 moles De esta manera: 1 mM = 10-3 M =1 mmol/litro =1 mol/ml 1M =10-6 M =1mol/litro =1nmol/ml 1nM =10-9 M =1nmol/litro =1pmol/ml
Tabla 1: conversin de unidades de masa

ORMALIDAD ( ) Se define como el nmero de equivalente de soluto por litro de solucin. Para calcular N se necesita conocer el peso del soluto disuelto y su peso equivalente (PE). (N) equivalentes = n de equivalentes de soluto litros disolucin n equivalentes = masa de soluto (g) Peso equivalente Peso equivalente = Peso molecular n*

Donde n es: n*: nmero de H+ o OH- reemplazables por molcula para cidos o bases respectivamente o n*: nmero de electrones perdidos o ganados por molcula para agentes oxidantes y reductores. Si Ud. reemplaza la ecuacin de PE en la ecuacin de n eq, y seguidamente reemplaza lo obtenido anteriormente en la ecuacin de normalidad puede deducir que: N = M x n*

PESO/VOLUME (%p/v) Se refiere al peso en gramos de un soluto en 100 ml de solucin. Depende slo del peso de la sustancia y del volumen en que esta disuelta. Para soluciones diluidas se puede expresar como:

% p/v = peso del soluto en miligramos por 100 ml de solucin. o tambin como una frmula numrica:

PESO/PESO (%p/p) Se refiere al peso en gramos de un soluto por 100 gramos de solucin. La concentracin de la mayora de los cidos comerciales vienen dadas en %p/p. Con el fin de transformar esta expresin de concentracin en M (o N) se debe conocer la densidad () de la solucin.

MOLALIDAD (m) Se define como el nmero de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Por lo tanto: M = n moles kg disolv.

Esta expresin de concentracin es usada en ciertos clculos fsico-qumicos La concentracin expresada de esta manera se hace independiente de la temperatura. Dado que la temperatura afecta el volumen de una solucin, la concentracin de sta se ver afectada cuando la expresin de concentracin usada est basada en el volumen. Para soluciones diluidas, la situacin es similar a lo descrito anteriormente en el caso de la expresin de molaridad.

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Problemas 1) Para 500 mL de una solucin 0,2 M de cido sulfrico, calcule: a) los gramos de cido sulfrico que contiene b) el nmero de molcula de cido sulfrico que contiene c) la concentracin N de dicha solucin 2) Cuntos gramos de hidrxido de sodio slido se requieren para preparar 500 ml de una solucin 0.04 M. 3) Exprese las concentraciones de la soluciones anteriores en: a) N b) g/l c) % p/v 4) Para el hidroxido de bario, calcule: a) los gramos contenidos en 1 mol b) las molculas contenidas en 1 g c) los gramos necesarios para preparar una solucin 0,1 M d) los gramos necesarios para preparar una solucin 0,5 N e) los gramos necesarios para preparar una solucin 5% p/v 5) Calcule cuntos mL de cido sulfurico 5M se requieren para preparar: a) 1500 mL de una solucin 0,002 M b) 1 L de una solucin 2 M c) 0,05 L de una solucin 1M d) 20 mL de una solucin 1 N e) 0,2 mL de una solucin 0,1 % p/v 6) Para las sig. soluciones 2 M: Cuarzo (SiO2), azcar de mesa (C12H22O11), calcita (CaCO3) determine: a) PM de cada molcula b) Los gramos contenidos en 1 mol c) Molculas contenidas en 1 g 7) Calcule cada una de las siguientes cantidades: a) la masa de 2,6 x 1020 molculas de cido clorhdrico b) la masa de 0,5 mol de cido fosfrico c) el nmero de moles en 60 g de cloruro de sodio 8) Si Ud. dispone de varias soluciones concentradas: cloruro de sodio 3 M, cloruro de potasio 1 M, cloruro de magnesio 1 M. A partir de estas, indique cuantos mL de cada una de ellas son necesarios para preparar 0,5 L de soluciones a las siguientes concentraciones: a) cloruro de sodio 2 N b) cloruro de potasio 2% p/v c) cloruro de magnesio 0,02 mM

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9) Calcule la cantidad de soluto necesario para preparar las soluciones que se indican a) 1000 mL de hidroxido de sodio 2M b) 500 mL de cloruro de litio 0,5 M c) 10 mL de cloruro de calcio 5 % p/v d) 100 mL de cloruro de sodio 1 N 10) Qu cantidad de moles de glucosa existen en los siguientes volmenes de solucin 0.012 M a) 150 mL b) 1 L c) 104 mL d) 0,2 mL e) 300 L 11) Calcule la molaridad y % p/v si Ud. disuelve 170 mg de sacarosa en los siguientes volmenes: a) 700 l b) 80 mL c) 105 L d) 3x105 mL e) 1x103 L 12) Calcule la normalidad si ud. disuelve 2 mg de cido fosfrico en los siguientes volmenes: a) 200 mL b) 0,2 mL c) 2000 L d) 3 L e) 20 L

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Actividad Prctica Actividad N1: Reconocimiento del material de trabajo a) Ud. dispondr de una cierta cantidad de material de vidrio, el que usar durante su trabajo prctico. Cudelo y evite un tratamiento drstico o golpearlo. Su instructor le mostrar los distintos materiales de laboratorio y sus caractersticas. Adems Ud. recibir instrucciones de cmo trabajar con dicho material: pipetas, tubos de ensayo, matraces, etc. Actividad N2: Preparacin de soluciones a) Preparacin de una solucin NaCl 3,5 M. Pese la cantidad necesaria y transfirala a un vaso de precipitado. Adicione 2/3 del volumen final de agua destilada. Con la ayuda de una bagueta (barra de vidrio) acelere la disolucin de la sacarosa en el agua. Tambin puede recurrir a la aplicacin de calor. En este caso deber esperar hasta que la solucin llegue a temperatura ambiente (20C) antes de llevar la solucin a su volumen final. Enrase la solucin a su volumen final en un matraz aforado. b) A partir de la solucin antes preparada Ud. deber confeccionar tres diluciones de tal manera que queden a 15%, 1% y 0.15 M respectivamente. Vace la solucin concentrada en un vaso pp. limpio y seco. Tome las alcuotas respectivas con una pipeta volumtrica y vace en matraces aforados. Complete el volumen con agua hasta el aforo. Actividad N3: Informe n1 en clases. Ud. recibir una Informe n1 el cual debe ser completado en clase y entregado al final de la misma. Asi mismo, TODOS los clculos de las actividades anteriores deben ser anotadas en esta gua, de manera clara y ordenada. MATERIALES LABORATORIO 4 Matraces de aforo 100 ml. 1 esptula metlica. 1 embudo. 1 matraz Erlenmeyer 250 ml. 2 vasos de precipitado de 100 ml. 1 vaso de precipitado de 50 ml. 1 pizeta. 1 pipeta graduada de 1, 5 y 10 ml. 1 pipeta aforada d2 2 ml. 1 probeta de 100 ml. 1 pprpipeta de 2ml y 10 ml. 1 marcador. 1 baqueta de vidrio. Material para el grupo curso. 2 balanzas. NaCl.

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Tabla 1: conversiones de medida universal

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FACULTAD DE CIE CIAS BIOLGICAS DEPARTAME TO DE CIE CIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULAR BIO035 GUA DE TRABAJO PRCTICO N 2 MTODO CIENTFICO

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I TRODUCCI

El objetivo de toda ciencia radica en brindar explicaciones para los fenmenos observados y establecer principios generales que permitan predecir las relaciones entre stos y otros fenmenos. Estas explicaciones y generalizaciones se logran por un sentido comn organizado al que se le denomina mtodo cientfico. La base radical del mtodo cientfico es la observacin cuidadosa, libre de variables que le puedan afectar, los testigos adecuados y lo ms cuantitativamente posible. Objetivo General del laboratorio: El objetivo de este trabajo prctico es que el estudiante se familiarice y reconozca cada una de las etapas del mtodo cientfico y su aplicacin en diferentes contextos investigativos. 1. Mtodos y Planes El concepto de mtodo: Es el camino para llegar a un fin. En consecuencia, los mtodos de investigacin sern los procedimientos que se apliquen para lograr los objetivos que los investigadores se proponen. Los mtodos de investigacin son ms generales que las tcnicas, las cuales se utilizan como medios de apoyo. Las tcnicas son especficas y tienen un carcter instrumental. Por ejemplo: tcnicas de muestreo, de cuestionarios, de entrevistas, de observacin, etc. Una investigacin elige un mtodo y puede aplicar diversas tcnicas.

2. Pasos en el plan de la investigacin Delimitacin Fuentes documentales Formulacin de hiptesis Definicin de variables Seleccin de tcnicas Elaboracin y validacin de instrumentos. Eleccin de la muestra Trabajo de campo Planillas de registro Clculos estadsticos Tablas y grficos Interpretacin de resultados. Conclusiones Redaccin de informe

1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2 OBTENCIN DE LOS DATOS

3 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN 4 ANLISIS DE LO DATOS

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Etapa1 : Planteamiento del Problema. Lo primero que tiene que hacer el investigador es clarificar y delimitar bien su problema de investigacin. Esto ha sido precisado en el Mdulo N2, junto con las Hiptesis y Variables. Ahora, nos referiremos a las fuentes documentales relacionadas con el problema. Hay tres razones fundamentales para que los investigadores busquen informacin pertinente desde un principio: Justificar la originalidad del problema. Se indaga en revistas especializadas, tesis, centros de documentacin, etc. si existen investigaciones relacionadas con nuestro problema. Recopilar antecedentes tericos para conformar un marco terico actualizado que sirva de base para proponer una Hiptesis coherente con cierta lgica cientfica. Rastrear metodologas y tcnicas aplicadas por otros investigadores del sector que nos preocupa, que pueden servir de modelos para seguir o modificar. Etapa 2 : Obtencin de los datos. La seleccin de las tcnicas que se requieren depende de la naturaleza del problema y la metodologa de trabajo. Cuando la muestra, es pequea y accesible, lo ms recomendable es observar a todos los componentes de la investigacin. Cuando la muestra es muy grande y a veces de un tamao indeterminado, en este caso se procede a la eleccin de una porcin representativa. Etapa 3 : Procesamiento de la informacin. Cada sujeto integrante de la muestra genera cierta cantidad de informacin, que es conveniente acumularlos en planillas de datos o planillas electrnicas. Para mayor facilidad del manejo de los datos acumulados, estos se codifican con nmeros, signos o letras. Por ejemplo: los datos personales (edad, el sexo, curso, etc.) y las preguntas formuladas generan otras tantas columnas en la planilla. Las respuestas u observaciones registradas para cada sujeto, se distribuyen en tantas filas como sujetos tenga la muestra. Un aspecto importante en la confeccin de los instrumentos de investigacin es pensar en forma anticipada de qu manera esta informacin se organizar en una planilla de datos. Cuando finalmente, los datos estn ordenados en la planilla, se proceder a realizar los clculos y pruebas estadsticas necesarias, de acuerdo con los objetivos que se persiguen. El siguiente paso ser resumir la informacin y presentarla en tablas y grficos, que muestren con claridad las relaciones de las variables que interesaban descubrir.

Etapa 4 : Anlisis de los datos y pruebas. La interpretacin de los resultados se debe desprender con claridad del anlisis de cada tabla o grfico que se haya previsto. Las conclusiones se apoyan en los resultados presentados. El principal resultado ser demostrar si la hiptesis es aceptada o fue falseada (recuerde el paradigma de la verdad). Recuerde que un trabajo de investigacin slo termina cuando se

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ha elaborado el informe de investigacin. 3. Los Diseos Experimentales En estos diseos, el elemento eje es el planteamiento de una Hiptesis causal, que establezca relaciones de CAUSA/EFECTO en el desarrollo de ciertos acontecimientos. El experimento viene a tener el carcter de medio de prueba, que se planea en forma deductiva para reunir evidencias que permitan inferir el valor de la hiptesis, de acuerdo al modelo clsico del Mtodo Cientfico. Simbologa usada en los diseos experimentales Variable independiente: X Y Experimentador :O S Pretest : T1 T2 Media :M Grupo experimental : E Puntaje medio x Variable dependiente : Sujeto : Postest Muestra aleatoria Grupo control : :R :C

Requisitos necesarios para inferir relaciones causales en un diseo experimental. Cuando a una variable (X) se le atribuye la causa de otra (Y), se debe presentar tres clases de ante- cedentes. Que X anteceda a Y en el tiempo Que Y no est siendo afectado por otras variables Que se demuestre una relacin estadstica significativa entre X e Y

4. El control de variables Para poder establecer relaciones causales de una variable independiente (X) sobre otra dependiente (Y), el investigador deber manipular deliberadamente la primera variable para observar el efecto que estos cambios producen sobre la variable dependiente. Para que los resultados tengan validez, es indispensable realizar un control estricto de las condiciones de experimentacin a fin de evitar la contaminacin del experimento por variables intervinientes que interfieran sobre los resultados. Factores que afectan la validez interna de los datos: Historia contempornea. Corresponde a cualquier tipo de acontecimientos que afecte a los S y pueda afectar a la variable Y, por ejemplo una epidemia de gripe puede disminuir el rendimiento esperado en un grupo de estudiantes. Maduracin. Cuando el experimento se prolonga durante meses o ms tiempo, los participantes S estn desarrollando transformaciones biolgicas y sicolgicas que afectan su rendimiento

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intelectual y fsico y pueden afectar las mediciones finales. Administracin de test. La administracin de T1 puede servir de experiencia de aprendizaje, y los S aumentarn sus respuestas en T2, aunque no intervenga X. Instrumentacin. Cambios que se realicen en los instrumentos en las nuevas mediciones o en los observadores, que pueden producir variaciones en los registros de los nuevos datos. Regresin estadstica. Opera cuando se escoge a los S por sus puntajes extremos, sean muy altos o muy bajos. Al escoger a muy buenos alumnos para un programa o especial o los de bajo rendimiento para un plan de recuperacin pedaggica. La media x de cualquiera de esos grupos diferenciales se desplazar hacia la x media de la poblacin original, est o no presente la variable X. Sesgos. Al escoger en forma arbitraria o casual grupos o cursos sin aplicar procedimientos aleatorios, se corre el riesgo que los grupos de comparacin tengan habilidades o capacidades diferentes en relacin a X antes de iniciar el tratamiento. Por ejemplo, elegir voluntarios o los estudiantes que siempre asisten a clases. Mortalidad experimental. Es la prdida o retiro de integrantes de E o C una vez que se ha iniciado el experimento. Prdidas mayores a un 5% se consideran graves. Interaccin entre seleccin y maduracin y otras condiciones. Corresponde a la suma de diferentes factores. La validez externa: Corresponde a la representatividad de los resultados de un experimento o su poder de generalizacin. Normalmente el experimento se lleva a cabo con una muestra de cierta poblacin. Cabe preguntarse A qu sujetos, grupos o poblacin pueden aplicarse estos resultados? Bajo qu condiciones o ambientes y variables de aplicacin y de medicin?

El significado del grupo de control : Aqu reside el mayor grado de similitud con los criterios de comparabilidad exigidos por las ciencias naturales. Para este efecto, al grupo experimental se le administra el tratamiento X. El grupo de control no es sometido a X, permitiendo al O verificar por comparacin, que la variable independiente es el nico elemento que afectan los cambios registrados en la variable dependiente.

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ACTIVIDADES PRCTICAS A) Un problema para ser analizado mediante la observacin cientfica: Qu factores hacen que una sustancia difunda en otra con diferente rapidez? Ponga 5mL de agua destilada en 5 tubos de ensayo, enumerados del 1 al 5. Calintelos a bao de Mara, de modo que los respectivos tubos alcancen una temperatura de 20, 25, 40, 55 y 70 C. Una vez alcanzadas las temperaturas para cada tubo, agregue a stos 1, 2, 3, 4 y 5 gotas, respectivamente, de azul de metileno. Mida el intervalo de tiempo transcurrido (tiempo de difusin) entre el tiempo cero (momento en que se agrega el colorante) y el tiempo final (momento en que la distribucin del colorante en el tubo es uniforme). Resultados TUBOS Volumen de agua (mL) Temperatura (C) Concentracin (gotas) Tiempo (seg) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

1. Cules son las variables de este experimento y cmo deben situarse en los ejes de las coordenadas de un grfico?. Responda y realice el grfico en el envs de esta hoja. 2. Qu efecto tiene la concentracin sobre la velocidad de difusin? 3. Qu efecto tiene la temperatura sobre la velocidad de difusin? 4. Con estos datos elabore una hiptesis respecto al (los) factor (es) que afecta (n) la velocidad de difusin del orgnico utilizado.

B) Una hiptesis para ser analizada mediante experimentacin: Confirmacin o rechazo? Para verificar las posibles explicaciones, es indispensable ponerlas a prueba a fin de encontrar la verdadera. Por cuanto es preciso que disee un experimento, el que a travs de los resultados que proporciona, podr confirmar o rechazar las inferencias hechas; esto le permitir determinar cul o cules de las hiptesis son correctas.

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Modelo experimental (diseo). Resultados TUBOS Volumen de agua (mL) Temperatura (C) Concentracin (gotas) Tiempo (seg) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

TUBOS Volumen de agua (mL) Temperatura (C) Concentracin (gotas) Tiempo (seg)

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

1. Cules son las conclusiones? 2. Con los datos obtenidos del modelo experimental, es posible determinar la hiptesis correcta respecto al o los factores que afectan la velocidad de difusin del azul de metileno? Si es as, formlelo. 3. Cree usted que la hiptesis es vlida para otro tipo de sustancias? 4. Qu deber hacer para generalizar la hiptesis?

BIBLIOGRAFA Labarca A. C. Los Mtodos de Investigacin Aplicados a las Ciencias de la Conducta. Facultad de Filosofa y Educacin Departamento de Formacin Pedaggica. U.M.C.E. www.umce.cl/publicaciones/mie/mie_modulo4.pdf

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Materiales de laboratorio. Mtodo Cientfico Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) 2 pipetas de 5ml 2 gradillas 15 tubos de ensayo 2 picetas con agua destilada 1 termmetro de lquidos 1 vaso pp de 500ml 1 vaso pp de 250 ml 1 pinza de madera para tubos de ensayo 1 cronmetro 1 rejilla 1 trpode 1 gotario 1 matraz con 20 ml de azul de metileno al 50%. 1 lpiz rotulador

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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULAR BIO035 GUA DE TRABAJO PRCTICO N 3

MICROSCOPA MICROSCOPA

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Introduccin El trmino clula fue usado por primera vez cuando Robert Hooke observ un trozo de corcho en un microscopio de luz en 1665. Luego, Antony van Leeuwenhoek observ en 1670 varios tipos de clulas y finalmente, fue en 1838 cuando Matthias Scleiden y Theodro Schwan propusieron a partir de sus observaciones microscpicas de diversos tejidos la teora celular Todos los organismos estn compuestos de clulas y, todas las clulas provienen de la divisin de otras clulas preexistentes. Estos descubrimientos dieron as origen al nacimiento de la biologa celular contempornea. Las clulas son muy pequeas y adems son traslcidas lo que hace imposible su observacin por ojo humano desnudo. Es por eso que el microscopio ha sido y, es una de las herramientas ms utilizadas en biologa. El progreso en la construccin de nuevos microscopios, as como el desarrollo y uso de nuevos mtodos de fijacin, corte y tincin han permitido una serie de descubrimientos en los campos de la histologa, citologa y bacteriologa, permitindonos entender cada vez con ms claridad la estructura de la clula y su organizacin, lo que es una importante ayuda para la comprensin de su funcionamiento.

FIGURA 1: Relacin entre el tamao de diferentes clulas y sus componentes.

Objetivo del trabajo Prctico El objetivo principal de este laboratorio consiste en que el estudiante comprenda el funcionamiento de un instrumento ptico como el microscopio y observe diferentes tipos celulares realizando comparaciones entre ellas.

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El microscopio ptico y sus partes En trminos generales, el microscopio es un sistema de lentes montados en un tubo. La distancia desde el tubo al objeto que se quiere observar puede regularse por medio de dos botones de ajuste y, todo el conjunto est dispuesto sobre un robusto soporte en el que tambin se apoya la platina sobre la cual se coloca la preparacin a observar y, una fuentes de luz que se dirige a travs del objeto en estudio. Las diferentes partes de un microscopio pueden agruparse en 3 sistemas fundamentales:

FIGURA 2. Esquema de un microscopio ptico en el cual se indican sus partes

El sistema mecnico se compone del pie en el cual se sustenta el instrumento y, la columna, que se encuentra fijada al pie y sostiene las otras partes del microscopio; el tubo que sostiene los oculares, el revolver portaobjetivos, la platina y el sistema de enfoque, tanto macromtrico (aproximado) como micromtrico (preciso). El sistema ptico se compone de 2 sistemas diferentes de lentes. Los oculares son 2 lentes separados por un diafragma fijo, tienen la funcin de aumentar la imagen proyectada por los objetivos. Los objetivos son 3 4 lentes ubicados en el revlver, son los que aumentan la imagen y pueden ser secos (entre ellos y la muestra hay una capa de aire) o de inmersin (entre ellos y la muestra se coloca una sustancia especial que permite lograr un aumento mayor). Finalmente, el sistema de iluminacin se compone de una fuente luminosa, que es generalmente una lmpara ubicada en el pie o en la base de la columna del microscopio. Si la fuente luminosa es independiente del microscopio, adems se necesita de un espejo que refleje la luz y la desve hacia el condensador y de un condensador, que a travs de un sistema de lentes concentra la luz que llega al condensador se regula por medio de un diafragma ubicado en su parte inferior. Adicionalmente se puede colocar un filtro, generalmente azul, para obtener una luz homognea y parecida a la luz natural. Formacin de la Imagen La luz posee una naturaleza dual y, puede ser entendida al mismo tiempo como una partcula y como una onda. La comprensin de este comportamiento, as como de algunas caractersticas de la luz, es importante para entender el proceso de formacin de la imagen en un microscopio y, cmo manejando ciertos parmetros fsicos podemos obtener imgenes ms ntidas y de mayores aumentos.

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La luz posee una determinada longitud de onda y viaja en el espacio con una determinada velocidad. Cuando la luz llega a una superficie que separa dos medios transparentes una parte de ella se refleja volviendo por el mismo medio en que se propagaba y, otra parte en cambio es refractada, penetra en el segundo medio y cambia su direccin y velocidad. Esto ocurre cuando la luz llega por ejemplo a una lente. Si sta es convergente, los rayos se juntan en un punto, el que corresponde al foco, la distancia entre ese punto y el centro de la lente es la llamada distancia focal. Como ya vimos, la velocidad de la luz es diferente en el vaco que en otros medios. Esta diferencia de velocidad puede compararse mediante el ndice de refraccin, que corresponde al cuociente entre la velocidad de la luz en el vaco y la velocidad de la luz en un medio determinado en el que sta incide. Mientras ms se acerca un objeto al ojo, ms detalles de l pueden ser distinguidos, pero hay una distancia lmite a la que se pueden acercar los objetos y, sobre esa distancia y,a no se distinguen los objetos con claridad y, se hace necesario el uso de lentes o lupas para aumentar el objeto en estudio. El aumento de una lente est dado por el lmite de cercana a la que pueden llevar los objetos en el ojo humano y por su distancia focal. Si se quiere aumentar an ms una imagen, se pueden colocar dos lentes en serie (objetivo y ocular en el caso del microscopio compuesto) y, el aumento final logrado ser entonces el producto del aumento de cada uno de ellos. Si tiene en un microscopio un objeto a observar, los rayos de luz reflejados o emitidos por el objeto que se sita fuera de la distancia focal de un lente (objetivo) al pasar por el objeto son refractados y enfocados en un plano que se ubica ms all de la cara opuesta de la lente obtenindose una imagen real que es invertida y de tamao distinto (mayor) al del objeto original. A medida que el objeto se acerca al foco la imagen obtenida es ms grande.

FIGURA 3. Esquema de la formacin de una imagen con un lente simple

La segunda lente (ocular) aumenta la primera imagen obtenida. La imagen final es una imagen virtual y aumentada.

FIGURA 4. Esquema de la formacin de una imagen en un sistema de lentes

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El poder de resolucin de un microscopio depende tambin de la apertura numrica, capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen. Esta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con ndice de refraccin mayor del aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersin. As, al aumentar la apertura numrica se obtienen mayores aumentos. Este tipo de aceites se usan solamente con objetivos especiales que se llaman lentes de inmersin. Poderes del Microscopio El microscopio posee varias caractersticas o poderes que determinan en forma importante su utilidad como herramienta de estudio. Estos son: * Poder de aumento: Es la razn entre el tamao de la imagen que produce el microscopio y el tamao original del objeto en observacin. Este aumento se logra a travs del ocular y de los objetivos y, ya que cada uno es capaz de amplificar la imagen, el aumento total logrado se obtiene al multiplicar estos dos valores de aumento. * Poder de definicin: Es la capacidad del microscopio para formar imgenes ntidas y de bordes definidos. * Poder de penetracin: Es la capacidad para visualizar los diferentes planos de una preparacin y est dado por el ajuste de precisin que se logra con el tornillo micromtrico. * Poder de resolucin: Permite distinguir como objetos separados dos puntos que se encuentran muy cercanos entre s.

Uso del Microscopio

Para un buen uso del microscopio sea cuidadoso y siga atentamente las siguientes instrucciones: 1. Asegrese de que el microscopio se encuentre en una posicin cmoda para usted, tomndolo siempre de la columna. 2. Encienda la lamparilla. 3. Coloque el objetivo de menor aumento. 4. Coloque su preparacin en la platina asegurndose de que sta se encuentre con el cubreobjeto hacia arriba. 5. Abra totalmente el diafragma iris y suba el condensador casi hasta el tope. 6. Si su microscopio tiene espejo, cntrelo para que la preparacin reciba el mximo posible la luz. 7. Enfoque la preparacin bajando el tubo o subiendo la platina. Existe un tope que impide que los objetivos de menor aumento topen la preparacin. 8. Mire a travs del ocular y usando el tornillo macromtrico aleje lentamente el objetivo de la preparacin, hasta lograr una imagen ms o menos ntida. Termine de enfocar usando el tornillo micromtrico. 9. Una vez enfocada su preparacin, regule la cantidad de luz que recibe su muestra cerrando para ello el diafragma. 10. Si despus de realizar todos los pasos anteriores no logra observar su preparacin en forma ntida, verifique que la preparacin est ubicada dentro del campo visual y que el cubreobjetos se encuentre mirando hacia arriba. Revise tambin la limpieza de la preparacin, oculares, objetivos, condensador,

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espejo y, por ltimo, verifique que la iluminacin sea la adecuada y que el objetivo se encuentre en su posicin correcta. 11. Para cambiar de objetivo, gire el revolver hasta el objetivo del aumento que desea utilizar y, vuelva a enfocar su preparacin utilizando para ello el tornillo micromtrico, y si fuera necesario, el macromtrico. 12. Para usar el objetivo de inmersin coloque sobre su preparacin una gota de aceite de inmersin y, luego enfoque su preparacin con el objetivo inmerso en el aceite. Una vez finalizada la observacin, limpie cuidadosamente el objetivo eliminando el aceite de inmersin. Para ello utilice Xilol y una hoja de papel para lentes, especialmente dispuesto para ello, pues las pelusas del papel comn permanecen en el objetivo y pueden interferir en observaciones posteriores. 13. Al terminar su trabajo limpie el resto del microscopio con un pao suave, apague la lamparilla, situ el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, baje la platina y, cubra el microscopio.

Preparacin del Material a ser Observado en un Microscopio Existen dos tipos de preparaciones microscpicas, stas corresponden a las preparaciones permanentes y a las preparaciones temporales. Ambas deben ser lo ms delgadas posible para dejar pasar la luz a travs de l y as lograr una buena observacin. Las preparaciones permanentes son aquellas que se han sometido a un proceso largo de preparacin, el que permite que se mantengan en buenas condiciones para su observacin por periodos prolongados de tiempo. La preparacin de estas muestras incluye etapas de fijacin del material, deshidratacin, inclusin en parafina, corte de la muestra en capas muy finas con un micrtomo, colocacin de estas capas que contienen la muestra en un portaobjetos, disolucin de la parafina, tincin de la muestra para contrastar las diferentes estructuras celulares y colocacin de un cubre objetos para proteger la preparacin. Las preparaciones temporales corresponden a cortes frescos del material a observar, los que se realizan en el momento y tienen una corta duracin. Una vez realizados los cortes, se coloca una gota de agua en un portaobjetos y, en ella se ubica un trozo del material a observar, el que debe quedar completamente cubierto por el agua. Sobre esta preparacin se coloca cuidadosamente un cubreobjeto, evitando la formacin de burbujas que interfieren en la observacin microscpica. Finalmente, se elimina exceso de agua y, la preparacin puede teirse para ser observada. Existen numerosas tinciones que se utilizan en microscopa y permiten una mejor observacin de las estructuras celulares al contrastar en forma selectiva molculas determinadas. Generalmente se usan diferentes colorantes, algunos ejemplos de ellos son el lugol que tie los granos de almidn de color azul-morado, la floroglucina que tie de rojo violeta las paredes celulares lignificadas, el azul de metileno que tie el protoplasma y las paredes celulares celulsicas, etc.

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Otros tipos de Microscopios El avance tecnolgico ha permitido en los ltimos aos el desarrollo de una serie de microscopios que con pequeas modificaciones de los principios bsicos del microscopio de luz permiten un mejor estudio de la clula. Algunos ejemplos son los siguientes:

FIGURA 5: dibujos de diferentes tipos de microscopios

Microscopio de contraste de fases: El mayor problema de la observacin microscpica de muestras biolgicas es el poco contraste que stas poseen. Las partes invisibles de una preparacin son atravesadas por la luz, sin que cambie su amplitud, pero produciendo un cambio en su fase. En este tipo de microscopio los cambios de fase de la luz se traducen en cambios de amplitud, este microscopio permite examinar objetos vivos, as como el seguimiento en ellos de procesos celulares como la mitosis. Microscopio de fluorescencia: Algunas molculas emiten parte de la luz que absorben a longitudes de onda mayores a las que reciben. Este proceso es llamo fluorescencia y se presenta en forma natural, por ejemplo, en las clorofilas. Existen numerosos fluorocromos (molculas capaces de emitir fluorescencia), los cuales pueden utilizarse para teir muestras biolgicas, cuyas estructuras se ven despus por la fluorescencia de las molculas unidas a ellas. En este tipo de microscopios la luz utilizada es de longitud de onda corta y, se logra por el uso de lmparas de mercurio. Esta luz incide en la muestra y, lo que se observa es la fluorescencia que proviene de ella. Si la unin de estos compuestos fluorescentes se hace especfica se pueden observar estructuras celulares definidas, como por ejemplo, protenas marcadoras de diferentes organelos. Microscopio electrnico: La luz se reemplaza por un haz de electrones que se obtienen al calentar un filamento en un tubo al vaco. Estos electrones son desviados en un campo electromagntico que cumple la funcin de condensador. Al pasar a travs del objeto, los electrones son parcialmente deflectados; el grado de defleccin de ellos depende de la densidad electrnica de la muestra. Debido a la baja densidad electrnica de las muestras biolgicas, para aumentar el contraste de las muestras se

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usan metales pesados que aumentan la interaccin de sta con los electrones incidentes. Despus de pasar por la muestra, los electrones se colectan en un objetivo donde se forma la imagen, sta se ve finalmente sobre una pantalla fluorescente, o en una placa fotogrfica. Las imgenes logradas en este tipo de microscopio son siempre en blanco y negro y, las zonas ms oscuras corresponden a zonas de mayor densidad electrnica en la muestra. Su poder de resolucin es del orden de 4 A y, permite lograr aumentos de hasta 1.000.000 de veces. Sin embargo, una desventaja es que se necesitan cortes extremadamente finos y las muestras deben someterse a procesos de preparacin (deshidratacin) antes de ser colocadas al vaco para ser observadas.

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Actividad Prctica OBJETIVOS: Describir y analizar los principios bsicos de la microscopa. Aprender el manejo de algunas tcnicas bsicas de microscopa, como el montaje de preparaciones en portaobjeto y tincin de muestras. Aprender a realizar observaciones microscpicas con el objeto de esquematizar, describir e interpretar adecuadamente lo observado.

ACTIVIDAD 1: Clculo del aumento y lmite de resolucin del microscopio. OBJETIVOS: Conocer los componentes principales de un microscopio. Comprender la funcin de los lentes oculares y objetivos. Calcular el aumento final de los objetos observados y el lmite de resolucin del microscopio.

La funcin principal del microscopio es aumentar la resolucin, la cual nos permite observar detalles de los objetos que no es posible ver con el ojo humano. Al aumentar la magnificacin, el tamao observado del objeto, tambin debe aumentar la resolucin; de otro modo, veramos slo una imagen de gran tamao pero sin nitidez. El poder de resolucin de un microscopio se define como la capacidad que permite hacer perceptible por separado, dos puntos situados muy prximos entre s en el objeto. Esta capacidad est determinada por la apertura numrica (NA) de la lente, siendo directamente proporcional a sta, e inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz utilizada (). Poder de resolucin = NA 0,61 x El recproco del poder de resolucin corresponde al lmite de resolucin, la distancia mnima que debe existir entre dos puntos para poder distinguirlos por separado. Lmite de resolucin = 0,61 x NA Teniendo claros estos conceptos, podemos comenzar el estudio de los componentes del microscopio, para llegar a calcular el aumento de las imgenes y la distancia mnima que podemos llegar a distinguir al realizar una observacin en un microscopio compuesto. IMPORTA TE: Recuerde que el microscopio es un instrumento ptico de gran precisin, por lo que debe ser manejado siempre en forma cuidadosa. Cualquier maltrato o golpe puede desajustar el instrumento y daarlo gravemente. Trate de no tocar las piezas cuya funcin no conoce. Ante cualquier duda o problema, solicite siempre la ayuda de sus profesores ayudantes. Observe cuidadosamente los distintos componentes del microscopio que le ha sido asignado. Comprelos con el esquema que fue entregado en la gua y, asegrese de comprender la funcin precisa de cada uno de ellos antes de comenzar cualquier observacin microscpica.

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Anote en la siguiente tabla el poder de aumento y apertura numrica de los lentes objetivos. Estos valores se encuentran en la parte cilndrica o can de los lentes. APERTURA NUMERICA

AUMENTO

Anote el aumento y la apertura numrica de l o los lentes oculares. AUMENTO APERTURA NUMERICA

Anote ahora la apertura numrica del condensador: APERTURA NUMERICA (NA)

La resolucin mxima de su microscopio depende de la apertura numrica efectiva mxima que posea. Este valor mximo corresponde normalmente al lente 100x o lente de inmersin. Observe ahora los siguientes valores: Apertura del lente 100x Apertura numrica del condensador Apertura numrica de la interfase de aire ___________________________ ___________________________ 1,0

Apertura numrica de la interfase de aceite 1,3 - 1,5 La apertura numrica efectiva mxima es el valor ms bajo de los anteriores. Utilizando este valor menor de apertura numrica de trabajo, calcule el lmite de resolucin y la resolucin de su microscopio asumiendo un = 400 nm, correspondiente a la luz visible. Lmite de resolucin: Resolucin: ____________________ ____________________

Qu conclusin puede obtener de estos resultados?

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ACTIVIDAD 2. Manejo del Microscopio observacion de preparacion de letra e impresa OBJETIVOS: Aprender a utilizar correctamente un microscopio, relacionando cada uno de sus componentes con su funcin especfica. Entender el principio de formacin de la imagen, comparando el tamao y la posicin de los objetivos observados a travs de las lentes.

1) Utilizando el lente objetivo 10x observe la preparacin con una letra e impresa con tinta sobre papel que le ser entregada. Tenga presentes las instrucciones para el manejo correcto del microscopio que se encuentran en la Introduccin de la presente gua. 2) Compare la orientacin de la letra e en su portaobjetos (preparacin) y en su campo visual (lo que observa a travs del ocular del microscopio). A qu se debe la diferencia observada? 3) Rote el revlver portaobjetivo hasta llegar al lente 40x y colquelo en posicin. Centre y enfoque la preparacin con la letra e. Hay algn cambio en la orientacin de la letra e? 4) Dibuje a lpiz mina la imagen observada de la letra e con el objetivo 10x:

ACTIVIDAD 3: Determinacin del dimetro del campo visual. Procedimientos y observaciones Tomar un cm2 de papel milimetrado, colocarlo en un portaobjeto, mojarlo con agua destilada y ponerle el cubreobjeto. Con el lente lupa (4X) enfocar y lograr observar. Calcule el dimetro del campo visual contando mayor cantidad de cuadros observados. Recuerde que 1 cuadro corresponde a 1 cm2. Transforme la medida obtenida a unidades micromtricas. Calcule el dimetro del campo visual del resto de los lentes objetivos (10x, 40x, 100x), empleando la siguiente frmula:

DCV obj.x = DCV obj.4X * aumento obj.4X aumento obj. X

Siendo DCV = dimetro del campo visual del lente objetivo del que se est averiguando, aumento obj. X del lente con el que se est trabajando. Agrupe sus clculos en una tabla, de manera clara y ordenada.

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ACTIVIDAD 3: Observacin de preparaciones biolgicas permanentes. OBJETIVO: Conocer aspectos generales de las tcnicas de fijacin Realizar observaciones microscpicas de preparaciones biolgicas con el objeto de aprender a esquematizar, descubrir e interpretar adecuadamente lo observado.

La fijacin es un mtodo que se utiliza para preservar la morfologa y la composicin qumica de las clulas que componen una preparacin microscpica. Consiste en agregar agentes fijadores a la muestra como acetona, formaldehdo o glutaraldehdo, los cuales mantienen las interacciones entre las molculas (protenas, cidos nucleicos, etc.) y permiten que las preparaciones duren en buen estado durante meses o aos. Uno de los mtodos ms utilizados para realizar preparaciones permanentes consiste en fijar el material de inters en una solucin FAA (formaldehdo-alcohol-cido actico), concentracin (entre 50 y 100%) y finalmente embeberlo en parafina para obtener bloques que puedan ser cortados en secciones muy finas utilizando un micrmetro. Estas secciones que contienen material fijado y desecado se colocan cuidadosamente en un portaobjetos y, se disuelve la parafina con un solvente orgnico como xilol. Una vez hecho esto, la muestra se tie para contrarrestar las distintas estructuras celulares y se protege con un cubreobjeto montado sobre una sustancia sellante. 1) Tome las preparaciones biolgicas asignadas por su profesor y que se encuentran en su bandeja de trabajo 2) Observe al microscopio cada una de las preparaciones escogidas y realice un dibujo de las clulas observadas en el espacio asignado para tal fin en su informe. 3) Al hacer su dibujo tenga presentes las siguientes recomendaciones: Los dibujos deben realizarse siempre a lpiz mina, evitando borrones y colores oscuros. La utilizacin de lpices de colores es opcional, pero el colorear su dibujo le puede ayudar a diferenciar con mayor claridad las estructuras observadas. Realice un dibujo simple o esquemtico, pero lo suficientemente grande como para mostrar todos los detalles importantes. Trate de mantener una escala apropiada al tamao de las estructuras observadas. Acompae su dibujo de notas explicativas, escritas en forma ordenada, clara y breve. Si lo desea, anote los nombres de las estructuras identificadas en su observacin. Indique siempre el aumento con que est observando su preparacin. Ej: [40x].

ACTIVIDAD 4. Observacin de una preparacin fresca (muestra real). OBJETIVO: Realizar la preparacin y observacin microscpica de una muestra real lquida. 1) Coloque una gota de la muestra real lquida en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur con gotario. 2) Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colquelo en un ngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en contacto con la gota de agua y djelo

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caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de aire pues interferirn con su observacin. 3) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. 4) Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo 10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. 5) Realice un dibujo de los organismos que observe. Descrbalos en forma clara y breve.

ACTIVIDAD 5: Determinacin del tamao celular (TC). Una vez calculado el DCV de cada uno de los lentes objetivos, se puede estimar el tamao celular (TC) utilizando la siguiente formula: TC = (DCV obj. X) / n de clulas Donde: DCV obj. X: corresponde al DCV del lente objetivo que estoy ocupando en mirar las clulas; n de clulas: el nmero de clulas que se observan (contabilizan) a travs del dimetro de dicho campo visual.

Determine este el valor de TC de la preparacin de frotis anteriormente dibujada

ACTIVIDAD 6 : Observacin de muestras frescas Aprender a realizar preparaciones de tejidos temporales Observacin de Elodea sp. Sobre un portaobjetos deposite unas hojas de Elodea sp, cubra con un cubreobjeto y observe al microscopio. Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. Qu estructura logra distinguir?. Esquematice. Observacin de Protozoos. Coloque una gota de la muestra real lquida en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur con gotario. Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colquelo en un ngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en contacto con la gota de agua y djelo caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de aire pues interferirn con su observacin. Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo 10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. Realice un dibujo de los organismos que observe. Descrbalos en forma clara y breve.

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ACTIVIDAD cebolla). OBJETIVO:

7: Observacin de tejidos vegetales frescos sin y con tincin (Catfilo de

Aprender a realizar preparaciones de tejidos temporales con tincin.

La mayora de los colorantes de clulas o tinciones son de naturaleza orgnica y aromtica. Existen dos tipos generales de colorantes: bsicos y cidos. En los bsicos, el grupo cromforo (que da el color) es bsico o catinico, por ejemplo el grupo azo (N=N). Los colorantes cidos poseen generalmente grupos nitrilo (NO2) o aromticos. Ejemplos de colorantes cidos son eosina y azul de anilina. De colorantes bsicos, azul de metileno, cristal violeta y azul de toluidina. El mecanismo de accin de la mayora de los colorantes se basa en la propiedad de protenas, ciertos polisacridos y cidos nucleicos de ionizarse como cidos o como bsicos, lo que les permite reaccionar con los grupos cromforos de las tinciones. La carga neta de las molculas es la que determina con que tipo de colorante reacciona y, es lo que permite realizar tinciones especficas para distintos tipos de molculas y estructuras celulares. 1) Tome el trozo de cebolla que le ha sido entregado y, con una hoja de gillete limpia realice un pequeo corte en forma transversal al tejido. Levante cuidadosamente el epitelio de la cebolla y tire de l hasta obtener un trozo adecuado de tejido que le permita realizar una buena observacin microscpica. Si el trozo que usted cort es demasiado grande, crtelo para darle un tamao adecuado. 2) Coloque una gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur con gotario o una pizeta. 3) Sobre la gota ubique un trozo de catfilo de cebolla de tamao adecuado para que pueda ser cubierto posteriormente por el cubreobjetos. Su muestra debe quedar completamente cubierta por el agua. 4) Ponga una gota de la tincin a utilizar a un lado de su muestra e incline el portaobjetos de tal modo que el colorante baje por capilaridad hasta atravesar el tejido. Limpie el exceso de colorante con un papel absorbente. 5) Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colquelo en un ngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en contacto con la muestra de catfilo de cebolla y djelo caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de aire pues interferirn con su observacin. 6) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. 7) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. 8) Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. 9) Realice en su informe un dibujo esquemtico del tejido de la cebolla antes y despus de la tincin, describiendo brevemente lo observado.

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Bibliografa
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* Biologa Celular y Molecular, De Robertis y de Robertis, 11 ., 2 impresin, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires.
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Materiales de laboratorio. Microscopa Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) Microscopio por alumno. Porta objetos. Cubreobjetos. Letra impresa fijada en portaobjeto. Preparaciones histolgicas; Corte intestino delgado de rata, Tejido heptico y Frotis sanguneo. Porta objeto con papel milimetrado (1cm2) 1 Cebolla. Hojas de Elodea (frescas) Muestra de agua con Protozoos Alcohol. Bisturis. Picetas. Gotarios. Lugol.

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COMPONENTES QUMICOS DE LA CLULA

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Introduccin Las clulas son estructuras increblemente complejas y diversas, capaces de autorreplicarse y de realizar una amplia variedad de funciones especializadas en los organismos multicelulares. En trminos generales, las clulas se componen de agua, iones inorgnicos y molculas orgnicas que contienen carbono. Tanto el agua como los iones inorgnicos son muy importantes en el funcionamiento celular, sin embargo, son los compuestos orgnicos de la clula los que le dan caractersticas nicas. Hidratos de carbono, protenas, lpidos y cidos nucleicos son los cuatro tipos principales de molculas orgnicas que se encuentran en la clulay, cumplen en ella tanto roles estructurales como funcionales. Las clulas obedecen a las mismas leyes fsicas y qumicas que determinan el comportamiento de los sistemas no vivosy, su qumica bsica puede ser entendida en trminos de las estructuras y funciones de estas cuatro clases principales de molculas orgnicas. Los HIDRATOS DE CARBO O, como su nombre lo indica, se componen de carbono, hidrgeno y oxgeno. Los hidratos de carbono ms simples son los monosacridos. Todos ellos contienen grupos hidroxilo, as como aldehdo o ceto. Estos azcares simples se polimerizan a travs de reacciones de deshidratacin para formar oligosacridos (2-6 molculas de monosacrido) o polisacridos (cientos o miles de molculas de monosacridos). El enlace formado en esta reaccin se conoce como enlace glicosdico. Los polisacridos juegan papeles importantes como molculas de almacenamiento de energa, as como tambin son componentes estructurales de la superficie celular. Los oligosacridos se unen comnmente a protenas o lpidos dando origen a las glicoprotenas y glicolpidos. Estos son parte importante de las membranas y, participan as en los procesos de reconocimiento celular e interaccin entre clulas. Los monosacridos y algunos disacridos, en medio alcalino y en caliente, presentan una capacidad reductora que permite su reconocimiento en distintos tipos de muestras, entre ellas los lquidos biolgicos como la orina y la leche. La reaccin de Somogyi permite el anlisis rpido de azcares basada en la capacidad de los monosacridos para reducir algunas molculas, entre ellas los hidrxidos metlicos. Los componentes principales del reactivo de Somogyi son sulfato de cobre (CuSO4), hidrxido de sodio (NaOH), que reaccionan para formar hidrxido de cobre (Cu(OH)2). La precipitacin de este hidrxido se evita agregando a la solucin tartrato doble de sodio y potasio (C4H4KNaO64H2O), obtenindose una solucin de color azul intenso. Calentando el reactivo de Somogyi en presencia de un hidrato de carbono reductor como la glucosa, aparece un precipitado rojo ladrillo correspondiente a xido cuproso (Cu2O). A su vez, el reactivo Lugol est formado por una mezcla de yoduro de potasio (KI) con una solucin de yodo (I2) y, posee una coloracin marrn-rojiza muy caracterstica. La prueba del Lugol permite la identificacin de polisacridos como el almidn en muestras de distinto origen: soluciones, slidos y muestras de origen vegetal como semillas y tubrculos. Al interactuar el I2 con el almidn se produce una coloracin azul-violeta caracterstica que se explica por que el yodo queda atrapado entre los dos tipos distintos de cadenas que conforman la estructura qumica del almidn: las cadenas de amilosa, sin ramificaciones, que producen el color azul intenso y las cadenas ramificadas de amilopectina, que al unirse al yodo produce la coloracin violeta. Los productos de hidrlisis del almidn producen una coloracin marrn-rojiza y, si son de muy bajo peso molecular no forman productos coloreados.

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Los LIPIDOS son molculas insolubles o escasamente solubles en agua, debido a que una gran parte de ellos es hidrofbica. Esta parte hidrofbica slo contiene carbono e hidrgeno. Los lpidos proveen una importante forma de almacenamiento de energa, son los principales constituyentes de las membranas y, son importantes en los procesos de sealizacin celular, tanto como hormonas esteroidales como molculas mensajeras. Las PROTE AS estn formadas por monmeros llamados aminocidos, que se unen entre si por medio del enlace peptdico. Este enlace covalente a travs del cual los aminocidos polimerizan se
+

forma entre el grupo carboxilo (COO) de un aminocido y el grupo amino (NH3 ) del siguiente por la eliminacin de una molcula de agua. Las interacciones hidrofbicas y covalentes, como los puentes de azufre (S-S), que se establecen entre los aminocidos que forman una protena determinan en ella diferentes niveles de estructura, los cuales contribuyen a su plegamiento y a que adopten su conformacin final caracterstica. As la prdida de esta conformacin puede llevar a la prdida de la funcin que una protena realiza.

En la clula, las protenas tienen una serie de importantes funciones; catalizan una gran cantidad de reacciones qumicas, proveen rigidez estructural, controlan la permeabilidad de las membranas, regulan las concentraciones de los metabolitos, reconocen y se unen a otras biomolculas en forma covalente, participan en el movimiento celular y, controlan el funcionamiento de la expresin gnica. Las protenas son macromolculas formadas por polmeros de aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos. Esta caracterstica estructural permite su identificacin en solucin mediante distintos mtodos, entre los que destaca la utilizacin del reactivo de Biuret. Este se utiliza para realizar anlisis cuantitativo mediante mediciones de espectrofometra. El reactivo de Biuret esta formado por sulfato de cobre (CuSO4) y tartrato doble de sodio y potasio (C4H4KNaO64H2O) en medio
+2

alcalino. El Cu reacciona con los grupos amino (>NH) del enlace peptdico de las protenas, formando un enlace coordinado con 4 tomos de nitrgeno. Este enlace coordinado es responsable de la coloracin azul intensa caracterstica del mtodo al reaccionar las protenas con el reactivo. Las protenas pueden ser precipitadas con facilidad modificando su solubilidad. Esto se logra agregando a la solucin

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sustancias con cargas opuestas a las que poseen las protenas, se produce la neutralizacin de las cargas de su superficie y una disminucin brusca de la solubilidad en solventes acuosos. Otra estrategia utilizada para la precipitacin de las protenas en solucin es la adicin de sales neutras como sulfato de amonio ((NH4)2SO4), las que por su gran solubilidad compiten con las protenas por el agua que constituyen su capa de solvatacin. Los CIDOS NUCLEICOS poseen dos tipos principales de macromolculas, el cido ribonucleico o RNA (por el nombre en ingls Ribonucleic Acid) y el cido desoxirribonucleico o DNA (Deoxyribonucleic acid). Ambos tipos estn formados por polmeros de nucletidos (ribonucletidos en el caso de RNA y 3 desoxirribonucletidos en DNA) unidos por enlaces fosfodiester (ver anexo). Ambos tipos se diferencian en el azcar que contienen en sus nucletidos (ribosa en el RNA y 3`desoxirribosa en el DNA) y, en que el RNA se presenta como una molcula de una sola hebra mientras que el DNA es de doble hebra. La funcin general de los cidos nucleicos es permitir el flujo de la informacin gentica contenida por una clula a otra clula hija y utilizar esta informacin para la expresin gnica. La molcula de DNA se conoce como la molcula de la herencia y almacena la informacin gentica en los genes que codificaran para protenas y RNA. El RNA participa principalmente en transformar la informacin contenida en el DNA a molculas funcionales como lo son las protenas. El RNA se presenta principalmente en tres formas que cumplen distintas funciones: El RNA mensajero que transporta la informacin contenida en un gen hasta el citoplasma; el RNA ribosomal que forma parte estructural y cataltica de los ribosomas en los cuales se produce la traduccin de la informacin contenida en los RNA mensajeros a protenas; el RNA de transferencia participa como molcula adaptadora para transformar la informacin desde el RNA mensajero a protena. Las SALES MINERALES son molculas inorgnicas que se encuentran formando parte de los seres vivos y, aunque se encuentran en pequeas cantidades en comparacin a las biomolculas, tienen funciones muy importantes en las reacciones metablicas, en la regulacin de stas o como constituyentes celulares. Las sales ms abundantes en los seres vivos son los cloruros, los fosfatos y los carbonatos de calcio, sodio, potasio y magnesio. La funcin que las sales minerales desempean en el organismo depende del estado fsico en que se encuentren, ya sea como sales precipitadas, donde forman parte de endoesqueletos de vertebrados (fosfatos y carbonatos), de conchas de moluscos y dientes (carbonatos) y de estructuras de sostn en plantas como las gramneas (slice); o como sales disueltas, formando parte de todos los plasmas intra e intercelulares disociadas en forma de iones como los cloruros (Cl-), fosfatos (PO-33), etc. Las sales disueltas tienen numerosas funciones, pero la ms importante es la funcin homeosttica o el mantenimiento constante del medio celular interno. Tambin participan en la regulacin de la presin osmtica determinando la concentracin de la disolucin.

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ACTIVIDAD PRCTICA ACTIVIDAD 1: HIDRATOS DE CARBO O OBJETIVOS Describir a mono y polisacridos mediante caractersticas qumicas generales. Relacionar estructura de mono y polisacridos con algunas de sus propiedades qumicas.

A) Identificacin de monosacridos mediante la reaccin de Somogyi: Para comparar la capacidad reductora de distintas muestras conteniendo mono y polisacridos, se realizar la reaccin de Somogyi en distintas soluciones. Esto permitir identificar la presencia y el tipo de hidrato de carbono que se encuentra en las distintas soluciones que se entregarn en el laboratorio. Segn las siguientes instrucciones realice un esquema de trabajo que le permita seguir claramente las acciones a realizar. Repita este proceso en cada uno de los experimentos siguientes. Prepare 6 tubos de ensayo colocndolos en una gradilla. Rotule cada uno de los tubos de tal modo que pueda recordar claramente con cual muestra est trabajando. Agregue a cada uno de los tubos 5 mL del reactivo de Somogyi ya preparado y 8-10 gotas de cada una de las siguientes soluciones segn el siguiente esquema: N Tubo 1 2 3 4 5 6 Muestra Agua destilada Solucin glucosa 1% Solucin almidn 1% Solucin almidn 1% tratada con cido en caliente Solucin NaCl 1% A entregar en el prctico

Agitar bien cada uno de los tubos y, colocarlos en un vaso de precipitado a bao Mara hirviendo durante 3 minutos. Deje enfriar y observe si aparece algn precipitado en la solucin, anote cul es el color y la cantidad relativa del precipitado en cada uno de los tubos. Interprete cada uno de los resultados obtenidos.

B) Identificacin de polisacridos mediante la prueba del Lugol: De manera similar al experimento anterior, organice los tubos y compararemos la capacidad de distintas muestras representativas de mono y polisacridos para reaccionar con el Lugol. Prepare 6 tubos de ensayo con cada una de las muestras segn el mismo esquema del experimento anterior. Agregue a cada uno de los tubos 2 gotas de solucin de Lugol diluida y agite. Observe el color producido en cada uno de los tubos. Interprete los resultados obtenidos segn su conocimiento de la estructura de mono y polisacridos.

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ACTIVIDAD 2: PROTE AS OBJETIVOS Reconocer la presencia de protenas en solucin mediante reacciones qumicas generales. Relacionar la estructura qumica de las protenas con su solubilidad en distintos medios.

A) Reaccin de Biuret para la identificacin de protenas: Rotular 5 tubos de ensayo y colocar en cada uno de ellos 2 ml de cada una de las siguientes muestras: Tubo 1 2 3 4 5 Muestra Agua destilada Solucin glicina 1% Clara de huevo (Ovoalbmina) A entregar en el prctico Solucin NaCl 1%

Agregar a cada tubo 1 ml de reactivo de Biuret y agitar. Observar la variacin de color en los tubos. Cmo explica la diferencia de intensidades en los tubos que presentaron una reaccin positiva?

ACTIVIDAD 3: RECO OCIMIE TO DE LPIDOS A) Reconocimiento de muestras ricas en lpidos mediante su solubilidad: Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se forman pequesimas gotas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sita sobre la capa de agua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes orgnicos, como el ter, benceno, xilol, cloroformo, etc. Procedimientos y Observaciones Tomar dos tubos de ensayo y poner en uno de ellos 3 ml de agua y en el otro tubo 3 ml de ter. Aadir a cada tubo 1ml de aceite y agitar fuertemente. Observar la formacin de gotitas o micelas y dejar en reposo en la gradilla. Observe la reaccin. Tubo 1 2 3 Muestra Agua destilada + aceite Agua destilada + ter Aceite + ter

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ACTIVIDAD 4: RECO OCIMIE TO DE SALES MI ERALES Procedimientos y Observaciones Preparar una gradilla con dos tubos de ensayo. En cada tubo agregar 3 ml de suero de leche., numerar los tubos. A) Identificacin de cloruros Al tubo 1 aadir 1 ml de solucin de nitrato de plata. Observar un precipitado blanco de aspecto lechoso. Tubo 1 2 Muestra Agua destilada + AgNO3 Leche + AgNO3

B) Identificacin de calcio Al tubo 2 aadir 10 gotas de solucin de oxalato de amonio al 1%. Observar un precipitado blanco cristalino Tubo 1 2 Muestra Agua destilada + C2H8N2O-4 Leche + C2H8N2O-4

ACTIVIDAD 5: RECO OCIMIE TO DE E ZIMAS Determinacin de la presencia de Catalasa, una enzima muy importante Cal es la funcin de la catalasa en el organismo humano? Cul es la ubicacin elular de la Catalsa? La reaccin de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente: 2H2O2 Procedimientos y Observaciones: A) Activacin de la enzima Colocar en un tubo de ensayo unos trozos de hgado. Aadir 5ml de Agua Oxigenada. Observar y registrar resultados. B) Inactivacin de la enzima Colocar un en tubo de ensayo dos trozos de hgado. Aadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. Despus de este tiempo retirar el agua sobrenadante. Aadir Agua Oxigenada. Observar y registrar resultados. 2H2O + O2

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BIBLIOGRAFIA

Molecular Cell Biology, James Darbell, Harvy Lodisch, David Baltimore, 1986, Cientific American Books, New York, U.S.A. Parte 1, The molecules in Cells. The Cell: a molecular approach, Geoffrey M., Cooper, 1997, ASM Press., Washington, U.S.A. Parte 1, The chemistry of Cells.

MATERIALES DE LABORATORIO

Reactivos y Material Biolgico Somogyi = 10 ml Lugol = 15 ml (para todo el curso, con gotario) Glucosa 1% = 10 ml Almidn 1% = 30 ml NaCl 1% = 15 ml NaOH 20% = 15 ml CuSO4 1% = 5 ml Glicina 1% = 5 ml Nitrato de Plata 1% = 10 ml (para todo el curso, con gotario) Oxalato de Amonio 1% = 10 ml (para todo el curso, con gotario) Eter = 5 ml Acido Actico = 20 ml (para todo el curso, con gotario) Agua Oxigenada = 15 ml Alcohol 96 a 0C = 50 ml Agua destilada = 50 ml NaCl 2M = 50 ml SDS (detergente lquido) = 15 ml (para todo el curso) Aceite Vegetal = 3 ml Clara de Huevo = 5 ml Leche = 1 litro (para todo el curso) Hgado de Pollo fresco y trozado = 3 (para todo el curso) Arena = 10 gr Material de Vidrio por grupo 30 tubos de ensayo. 2 gradillas 1 mortero de cermica 1 trozo de gaza para filtrar 3 vasos pp de 100 ml 1 vaso pp 500 ml 1 embudo 1 probeta 100 ml 1 varilla de vidrio 3 gotarios 3 pipetas graduadas 1 ml 2 pipetas graduadas de 5 ml

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3 pipeta graduada de 10 ml 1 matraz Erlenmeyer 500 ml 1 matraz Erlenmeyer 250 ml 1 piceta con agua destilada 1 mechero (trpode y rejilla) 1 pinza madera para tubo 1 lpiz rotulador. 1 cooler con hielo por mesn de trabajo Nota: Las pipetas deben reciclarse, por tanto, deben ser lavadas con abundante agua destilada antes de volver a utilizar.

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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULAR BIO035 GUA DE TRABAJO PRCTICO N 4

ORGANIZACIN SUBCELULAR

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Introduccin Las clulas aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de aos, probablemente debido a la agregacin espontnea de molculas. Las primeras clulas eran relativamente simples y pequeas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Luego aparecieron las clulas eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja, que hoy forman parte de animales y plantas. Por definicin y, a diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material gentico en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la clula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metablicas. En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo endoplsmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones especficas dentro de la clula. El Ncleo es el organelo ms grande de la clula y est separado del citoplasma por una envoltura que consiste en dos capas de lpidos, la cul posee una serie de poros los cuales mantienen en constante comunicacin el ncleo con el citoplasma celular y sus organelos. Contiene todo el DNA cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su asociacin con protenas denominadas histonas.
Fig.1 : esquemas los dos tipos de clula eucariota: animal y vegetal

La Membrana Plasmtica es la envoltura externa de la clula. Corresponde a un bicapa continua de fosfolpidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran embebidas varias protenas. Algunas de estas protenas sirven como bombas y canales para el transporte de molculas especficas hacia el interior de la clula y, desde la clula al medio externo. La membrana celular es una estructura dinmica, en la cul todos los elementos embebidos tienen movimiento.
Fig 2: esquema de la bicapa lipidica con protenas en rojo

Las Mitocondrias son muy similares a las bacterias tanto en tamao como en forma. Contienen su propio DNA, sintetizan protenas y pueden reproducirse al dividirse en dos, por lo que se cree que provienen de la simbiosis de una clula eucarionte primitiva con un organismo procarionte, que correspondera a una mitocondria primitiva. Estos organelos son responsables de los procesos de respiracin celular y produccin de energa. Los Cloroplastos, al igual que las mitocondrias, tambin tendran un origen simbitico. Se encuentran slo en los organismos capaces de realizar la fotosntesis, como las algas verde-azules y las plantas. Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y, estn rodeados de una

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membrana doble. Adems, contienen un elaborado sistema de membranas en su interior en el cual se encuentra el aparato fotosinttico propiamente tal.

Fig 3: representacin grfica de un cloroplasto (A) y una mitocondria (B), donde se pueden observar sus diferencias, principalmente en la conformacin interna de ambos, en donde se pueden apreciar el apilamiento de tilacoides en el casao del cloroplasto y la formacin de las crestas mitocondriales en el caso de las mitocondrias.

El Retculo Endoplsmico (R.E.) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas que se extienden a travs del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la clula. La membrana del Retculo endoplsmico es una continuacin de la membrana nuclear. Se especializa en la sntesis de lpidos y protenas de membrana, as como tambin de materiales que estn destinados a ser exportados de la clula. El Retculo endoplsmico rugoso est asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se encargan de la sntesis de protenas. El Retculo endoplsmico liso no contienen ribosomas y se encarga del metabolismo de lpidos.
Fig 4 : Dibujo de los retculos endoplasmticos liso y rugoso

El Aparato de Golgi o tamin llamados Dictiosomas (que es el conjunto de sacos que apilados forman este organelo) tambin corresponde a un sistema de sacos membranosos. Se encarga de la modifica-cin, destinacin y, empaquetamiento otros organelos. Alrededor de l se encuentran numerosas vesculas pequeas que transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes compartimentos de la clula.
Fig 5: esquema representativo de los dictiosomas apilados para formar el aparato de Golgi, donde se puede apreciar el trafico vesicular que realiza.

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Los Lisosomas son vesculas membranosas que contienen enzimas hidrolticas requeridas para la digestin de molculas al interior de la clula. De este modo, estas enzimas se mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradacin de molculas como protenas y cidos nucleicos. Por otras parte los Peroxisomas tambin corresponden a vesculas. En ellas se produce perxido de hidrgeno (H2O2) durante la oxidacin por el oxgeno de varios tipos de molculas. Esta sustancia es peligrosa y gracias a la existencia de los peroxisomas se mantiene aislada al resto de los componentes de la clula.
Fig 6: organizacin de los lisosomas y vacuolas, funcin y va intracelular

Los Ribosomas son grandes complejos de RNA y protenas. Se componen de una subunidad grande y una subunidad pequea que se ensamblan para formar un complejo que se encarga de llevar a cabo el proceso de traduccin en la sntesis de protenas. Los ribosomas procariontes y eucariontes son muy similares y, pueden encontrarse tanto libres en el citoplasma como unidos a membranas formando parte del retculo endoplsmico rugoso. El Citoesqueleto corresponde a filamentos de protenas que forman un enrejado en el citoplasma. Esta red de filamentos est formada por los microtbulos, filamentos de actina y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da a la clula su forma y provee la base de sus movimientos. Generalmente se organiza desde una regin cercana al ncleo donde se encuentran los centrolos y desde ah se extiende al resto de la clula. Aunque tcnicas avanzadas como la Microscopa Electrnica permiten una visualizacin detallada de la estructura de la clula, esto no es suficiente para definir la funcin de sus componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la clula para realizar estudios bioqumicos que permitan determinar la funcin exacta de cada uno de ellos. Fraccionamiento Subcelular As como un tejido puede ser separado en las clulas que lo constituyen, con las tcnicas adecuadas la clula puede separarse en los diferentes organelos y macromolculas que la componen. Una de las tcnicas ms utilizadas para tal propsito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre 1940 1950 y, consiste en la separacin de los componentes de la clula en base a su tamao y densidad. El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenizacin de la muestra. Esto se logra a travs de diferentes procedimientos como sonicacin (exposicin a sonidos de alta frecuencia), schok osmtico o simplemente moliendo las clulas en homogenizadores mecnicos. En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la clula, incluyendo la membrana plasmtica y el retculo endoplsmico, las que quedan formando pequeos fragmentos o vesculas que dan origen a la fraccin microsomal. El resto del los componentes celulares (ncleo, mitocondrias,

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cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y perixosomas) permanecen intactos. Las partculas y vesculas as obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioqumicas originales y permiten el estudio de la funcin de cada organelo celular por separado. La suspensin de clulas rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u homogenizado y, es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se realiza a travs de una serie de etapas sucesivas de centrifugacin en las que los componentes de la clula se separan en un campo gravitacional. Si dos componentes de distinta masa e igual tamao y forma estn en un mismo medio, el cuerpo de mayor masa sedimentar (se ir al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentacin tambin aumentar. Para aumentar el campo gravitacional se usan las Centrfugas. Estos instrumentos consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad de rotacin. Al trmino de una centrifugacin se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del tubo se obtiene un sedimento o pellet y, sobre l una parte lquida llamada sobrenadante.

Fig. 8: esquema de una centrfuga tpica

Generalmente, la primera etapa de separacin consiste en una centrifugacin a baja velocidad a la cual sedimentan slo las clulas que permanecen enteras y las partculas subcelulares ms grandes, los ncleos. As, el primer pellet obtenido corresponde a una fraccin enriquecida en ncleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes celulares en suspensin. El sobrenadante se somete a una segunda centrifugacin que se realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevo sobrenadante se recentrifuga a alta velocidad obtenindose un pellet enriquecido en membrana plasmtica y retculo endoplsmico (fraccin microsomal). Una ltima centrifugacin del sobrenadante anterior a velocidades aun mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando el sobrenadante slo la porcin soluble del citoplasma, el citosol.

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Fig 9 : Esquema de un fraccionamiento subcelular tpico.

Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugacin en las que se utilizan medios de mayor densidad que se obtienen con soluciones de sacarosa, polmeros o protena permitiendo realizar el proceso de separacin en gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayores grados de pureza. Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evala mediante el anlisis de la forma en que se distribuyen algunos componentes celulares de localizacin subcelular conocida en las diferentes fracciones obtenida. Estas molculas son llamadas marcadores de cada una de las fracciones. Por ejemplo, el DNA es un marcador de la presencia de ncleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la cadena respiratoria son marcadores de mitocondrias y, el proceso de fotosntesis indica la presencia de cloroplastos. De este modo, el anlisis de la distribucin de los diferentes marcadores en todas las fracciones subcelulares obtenidas permite conocer la distribucin y pureza relativa de los distintos organelos y, el nivel y calidad de los componentes contaminantes de cada fraccin. La obtencin de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma relativamente especfica algunos procesos celulares que ocurren en compartimentos particulares, aislndolos de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo, se puede estudiar la sntesis de protenas en ribosomas aislados o asociados a membranas, el transporte de sustancias a travs de la membrana plasmtica, la fotosntesis en cloroplastos, el procesamiento de glicoprotenas en el aparato de Golgi, etc.

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A su vez cada organelo contiene enzimas o molculas que lo caracterizan, las que no se encuentran en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos. El DNA es la molcula marcadora de ncleos. Esta macromolcula puede ser identificada mediante colorantes bsicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el azul de tripn, azul de toluidina y azul B. Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato deshidrogenasa que cataliza la deshidrogenacin estereoespecfica de Succinato a Furamarato durante el ciclo de Krebs, segn la siguiente reaccin:
+ -

Succinato

Fumarato + 2 H + 2 e

Los protones y electrones liberados permiten seguir la reaccin a travs de la decoloracin del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin embargo, el azul de metileno reducido puede fcilmente ser oxidado por el oxgeno del aire y, recobrar su coloracin azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reaccin con aceite mineral o vaselina lquida, lo que permite realizar la reaccin en ausencia de oxgeno.

ACTIVIDA PRCTICA A.- Fraccionamiento subcelular de Hgado OBJETIVOS Conocer las tcnicas de homogeneizacin usadas en el fraccionamiento subcelular. Comprender los fundamentos de la tcnica de centrifugacin usada en el fraccionamiento subcelular. Comprender el concepto de molculas marcadoras y su utilidad en la evaluacin del fraccionamiento subcelular.

El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u homogeneizacin y, una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. El fraccionamiento o separacin de los distintos componentes celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un campo gravitacional dependiendo de su masa y tamao. Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que corresponde a la fraccin lquida que permanece sobre el material sedimentado. El pellet obtenido corresponde a los organelos que han sedimentado, stos se resuspenden y se guardan para el resto de los anlisis bioqumicos, mientras que el sobrenadante se vuelve a centrifugar. La etapa de ruptura y homogeneizacin de la muestra se realiza colocando el tejido fresco a fraccionar y una cantidad adecuada de solucin tampn, la que deja los organelos en suspensin y sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un homogeneizador. Todo el proceso se realiza adems en fro (4C) para evitar una posible degradacin de las estructuras celulares y as conservar intactas la mayor parte de las caractersticas funcionales originales del organelo que se pretende aislar.

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EXPERIME TO 1 Usted recibir un homogenizado filtrado, preparado por sus profesores, el cual se obtuvo de la siguiente manera: 1. Dejar en inanicin una rata una noche antes del experimento. 2. Matar un ratn adulto (cerca de 30 g) por dislocacin cervical y rpidamente extraer el hgado desde la cavidad peritoneal (descartar la vescula biliar). Dejar el hgado en 50 ml de Buffer IBc fro en un pequeo vaso. 3. Dejar el hgado libre de sangre usando IBc fro. (Usualmente entre 4 y 5 clarificaciones es suficiente) 4. Picar el hgado en pequeos pedazos utilizando tijeras. Esto podra ser realizado mientras se mantenga el vaso en una fuente con hielo. 5. Descartar el IBc usado durante picado y reemplazarlo con 5 ml de IBc fro fresco y transferir la suspensin al tubo de homogenizado (mortero) y operarlo a 1600 RPM mezclando de 3 a 4 veces. Recordar: A 4C se minimiza la activacin de dao generado por fosfolipasas y proteasas. El radio optimo entre el tejido y el buffer de aislamiento es de 1:5 a 1:10 (peso:volumen) Enfriar el tubo de homogenizado en hielo por 5 minutos antes de iniciar el procedimiento.

6. Trasferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 600 g (2500 RPM app.) por 10 minutos a 4C. 7. Transferir el sobrenadante a tubo de centrifugacin y centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20 min. a 4C. 8. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 5 ml de IBc fro. 9. Centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20 min. a 4C. 10. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet conteniendo mitocondrias en 1 ml de IBc. 11. Trasferir la suspensin mitocondrial en un tubo Falcon y guardar en hielo. Recordar: Minimizando la exposicin al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la porcin mitocondrial por largo tiempo. Es recomendable utilizar esta preparacin mitocondrial entre 1 a 3 horas post. aislamiento. 12. Medir la concentracin mitocondrial utilizando el mtodo de Biuret (o de Bradford, pero el lisado mitocondrial se diluye en order al punto de saturacin de la prueba). Recordar: La concentracin usual de mitocondrias en este tipo de preparacin es de cerca de 80 mg/ml y el volumen total es de 1 ml.

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EXPERIME TO 2 En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensin de ncleos P1 obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo. Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparacin al microscopio usando para ello el objeto de 40X. Agregue el azul de tripn y vuelva a observar su preparacin de ncleos. Qu observa?. Repita el proceso con la fraccin enriquecida en mitocondrias P2. Coloque una gota de la muestra en un portaobjetos, coloque sobre ella un cubreobjetos, realice la tincin con azul de tripn y observe al microscopio usando el objetivo de 40X. Qu ocurre?.

EXPERIME TO 3 Separe 4 tubos de ensayo, rotlelos en forma adecuada y colquelos en hielo de manera que estn fros. Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que correspondan segn el siguiente esquema: Succinato Azul de 0,1 M Metileno 1 mL 1 mL Agua destilada 1 mL Fraccin nuclear (P1) --Fraccin mitocondrial (P2) --Fraccin microsomal (S2) ---

Tubo

Blanco Fraccin nuclear Fraccin mitocondrial Fraccin microsomal

1mL

1 mL

1 mL

1 mL

---

---

1mL

1 mL

1 mL

---

1 mL

---

1 mL

1 mL

1 mL

---

---

1 mL

Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 2 mL de aceite mineral o vaselina lquida. Coloque los tubos en un bao termorregulado a 37 C y observe si ocurre decoloracin en algunos de los tubos. B.- Observacin de un corte de hgado de rata utilizando el objetivo de inmersin. OBJETIVO Aprender a utilizar correctamente el objetivo de inmersin y comparar una muestra fresca de una fijada El poder de resolucin de un microscopio depende tambin de la apertura numrica, capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen. Esta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con ndice de refraccin mayor del aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersin.

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EXPERIME TO 4 En base a sus conocimientos de microscopa, observe la muestra de hgado de rata utilizando los objetivos de 4, 10 y 40 X. Enfoque la zona que desea observar con el objetivo seco de aumento mayor (40 X). Sin bajar la platina ni cambiar la preparacin de posicin, gire el revlver portaobjetivos de modo que quede en una posicin intermedia entre el objetivo mayor seco y el de inmersin. El objetivo de inmersin corresponde al aumento de 100X y, tiene una inscripcin que dice oil. Deposite cuidadosamente sobre el cubreobjetos de su preparacin una gota de aceite de inmersin. Tenga cuidado de no manchar con aceite su microscopio. El aceite de inmersin NO deber ser utilizado en los otros objetivos, por lo tanto, una vez que se ha colocado el aceite NO deber cambiar de objetivo sin antes limpiar cuidadosamente el aceite usando para eso un trozo de papel absorbente especial embebido en xilol. Lleve el objetivo de inmersin al eje ptico y enfoque utilizando para ello el TORNILLO MICROMETRICO. El objetivo de inmersin DEBE quedar inmerso en el aceite. Una vez finalizado su trabajo retire la preparacin y limpie muy bien su microscopio con xilol de manera que no queden en l restos de aceite. Recuerde limpiar tambin su preparacin.

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Molecular Biology of de Cell, Alberts Bray, Lewis Raff, Roberts & Watson, 3 ., 1994, Garland Publishing Inc. , New York & London. The Cell: A Molecular Approach, Cooper G.M., 1997, ASM Press, Washington, U.S.A.

Materiales Laboratorio. Fraccionamiento Sub Celular 1. Para el homogenizado Ratn. Pinzas. Bistur. Tijeras. Homogenizador. Embudo. Gasa. Centrifuga.

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 Hielo. Buffer IBc 2. Para el laboratorio ( p/g = por grupo de 3 alumnos) 3 Microscopios. Corte de hgado de rata Porta objetos. Cubreobjetos. 1 Lpiz rotulador Centrifuga. Bao termorregulador. Hielo 2 gotarios. (p/g) 8 tubos de ensayo (p/g). Gradilla para tubos de ensayo. 3 pipetas 1 ml (p/g). 1 pipeta 5 ml (p/g). 1 baso precipitado de 50 ml (p/g). Azul de Metileno. Succinato 0.1 M. H2O destilada. (picetas). Azul de tripan. Aceite mineral o vaselina. Tubos para centrifuga (p/g) Piceta Buffer IBc: Buffer para el aislamiento de clulas y mitocondrias de hgado de ratn: Para 100 ml de IBc: 10 ml de Tris-MOPS 0,1 M 1 ml de EGTA/Tris 20 ml de sucrosa 1 M Aforar a 100 ml con agua destilada Ajustar pH a 7,4 Tris-MOPS 0,1 M: disolver 12.1 g de Tris en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 utilizando MOPS en polvo (4-Morpholinepropanesulfonic acid). Llevar la solucin a 1 litro y guardar a 4 C. EGTA/Tris 0,1 M: disolver 38,1 g de EGTA (Ethylene -bis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid) en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 utilizando Tris en polvo. Llevar la solucin a 1 litro y guardar a 4 C. Sucrosa 1 M: disolver 342,3 g de sucrosa en un litro de agua destilada, mezclar bien y almacenar a -20 C.

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULAR BIO035 GUA DE TRABAJO PRCTICO N 5

MITOSIS, MITOSIS, MEIOSIS Y FECUNDACIN

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I TRODUCCIO Tal como enuncia la Teora Celular Todos los organismos estn compuestos de clulas y, todas las clulas provienen de una clula preexistente. La capacidad de reproducirse es una propiedad fundamental de la clula y, est finamente regulada, de modo que la informacin gentica se conserve y se mantenga un equilibrio entre las clulas preexistentes y las clulas nuevas. As como los seres superiores cumplen con un ciclo de vida en el que nacen, crecen, se reproducen y mueren, las clulas en crecimiento pasan por el llamado Ciclo Celular. ste comprende dos etapas fundamentales, la interfase y la divisin propiamente tal, que ocurre por los procesos de mitosis o meiosis.

Fig 1 : esquema del ciclo celular en eucariontes mostrando cada una de sus fases.

La interfase es el periodo ms largo del ciclo celular y, corresponde al tiempo que toma una clula entre una divisin mittica y la siguiente, o sea que puede entenderse como un perodo en el cual la clula se prepara para dividirse. Durante este tiempo, la clula aumenta lentamente su tamao y duplica su material gentico en una secuencia ordenada de eventos que pueden subdividirse en tres etapas principales, G1, S y G2. Despus de una divisin celular, las clulas hijas resultantes comienzan la interfase de un nuevo ciclo celular en la etapa G1. Durante esta etapa la clula retoma su actividad biosinttica que durante la mitosis es muy baja, llevndola nuevamente a sus niveles normales. Luego pasa a la fase S. Esta es una etapa de sntesis, en la cual la clula sintetiza D A y termina cuando el contenido de DNA se ha duplicado y, los cromosomas han replicado. La etapa siguiente es G2, en ella se condensan los cromosomas ya duplicados en espera para la divisin celular. Despus de esta serie de etapas la clula se encuentra lista para una nueva divisin y, entra en la fase M o de mitosis.

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MITOSIS Durante la mitosis una clula se divide y da origen a dos clulas hijas genticamente iguales entre s. Lo que ocurre con el material gentico es una separacin equitativa de dos conjuntos cromosmicos iguales entre s y al de la clula original. Esto es posible gracias a que en la fase S de la interfase el material gentico y las protenas que constituyen la cromatina han sido duplicados. La mitosis completa de una clula demora aproximadamente una hora, durante la cual ocurren muchos eventos diferentes, los que se han agrupado en 4 etapas: 1) Profase Dentro del ncleo la cromatina se condensa para formar los cromosomas. Al principio stos se ven como filamentos largos y finos, pero al trmino de la profase son ms cortos y gruesos y, se ubican cerca de la envoltura nuclear. Los centrolos se han duplicado y, se encuentran en polos opuestos de la clula. Finalmente, la envoltura nuclear se rompe y la profase termina

2) Metafase Los cromosomas condensados al mximo se ubican en el centro o ecuador de la clula gracias a la ayuda del huso mittico que es un complejo conjunto de microtbulos que se orientan de polo a polo de la clula cerca de los centrolos. Los microtbulos se unen a los cromosomas al insertarse en el cinetocoro de cada centrmetro. Durante la metafase cada cromosoma est compuesto por dos cromtidas, cada una de las cuales posee un cinetocoro.
Fig 2 : esquema de un cromosoma metafsico.

3) Anafase La caracterstica principal de esta etapa es el movimiento de los cromosomas hacia los polos de la clula. Esto ocurre gracias al acortamiento de los microtbulos del huso mittico

4) Telofase y Citodiresis Sobre los cromosomas que estn en los polos de la clula se forma la envoltura nuclear. Los cromosomas se condensan y, el ncleo aumenta de tamao por hidratacin y descondensacin de la cromatina. El ncleo resultante es esfrico y, en l se puede observar el nuclolo. En clulas animales, la citodiresis ocurre por un estrangulamiento del sector del citoplasma que se encuentra entre los dos ncleos nuevos gracias a una gran concentracin local de microfilamentos con uso de energa. En clulas vegetales existe la pared celular y, esta etapa ocurre por la formacin de un tabique entre los dos ncleos nuevos. Este se forma por vesculas del sistema de Golgi y, finalmente se forman las dos membranas plasmticas a cada lado del tabique, quedando completa la divisin celular.

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Fig 3 : esquema de la mitosis en clulas animales, con todas sus fases.

MEIOSIS En todos los ciclos de reproduccin sexual la nueva generacin de individuos se origina por la fusin de dos clulas haploides que provienen de l o los organismos progenitores. Estas clulas son los gametos y, se obtienen mediante el proceso de meiosis, que ocurre en todos los organismos de reproduccin sexual e implica la produccin de clulas haploides, las que se mantienen como tales hasta el momento de la fecundacin en el que los gametos se fusionan y el nuevo organismo vuelve a su estado diploide. La meiosis ocurre solo en las clulas germinales de las gnadas y da como resultado a los gametos, tanto vulos como espermios. La meiosis implica una etapa de duplicacin del D A y, dos divisiones celulares sucesivas para formar as cuatro clulas haploides que contienen la mitad del material gentico original a partir de cada clula que entra en este proceso. Los eventos ms destacados de la meiosis son: duplicacin del DNA nuclear, apareamiento de los cromosomas homlogos, dos divisiones celulares sucesivas y finalmente, la formacin de las clulas hijas haploides. Durante este proceso hay una activa transcripcin y sntesis de protenas celulares y, se produce una gran variabilidad gentica que se obtiene gracias a los fenmenos de crossing-over y permutacin de los cromosomas que aseguran una muy baja posibilidad de obtener gametos genticamente iguales. Lo anterior es una ventaja al momento de adaptarse a un medio altamente cambiante y otorga la individualidad de los organismos ya que no existe ningn organismo que sea totalmente idntico a otro.

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Un ncleo diploide contiene dos versiones muy similares de cada cromosoma, cada una de las cuales proviene de uno de los padres. Estas dos versiones de cada cromosoma son los llamados cromosomas homlogos. Cuando los cromosomas se duplican por replicacin de DNA, las copias del cromosoma replicado en un principio permanecen fuertemente asociadas y se llaman cromtidas hermanas. En una divisin meitica en que las clulas que se forman son haploides cada clula hija debe contener solo un miembro de cada cromosoma homlogo, el de origen materno o el de origen paterno y as se obtiene slo la mitad del nmero original de cromosomas.

Despus de la replicacin del DNA cada par de cromosomas duplicados se empareja con su homlogo y forman una estructura llamada bivalente que posee cuatro cromtidas. Cuando la primera divisin celular ocurre, cada clula hija contiene dos copias de uno de los cromosomas homlogos. Estas clulas son haploides. En la segunda divisin celular, los cromosomas no se duplican; se ubican en el centro de la clula en el huso mittico y las cromtidas hermanas se dividen como en una mitosis normal. La meiosis se divide en varias etapas, stas se nombran de la misma forma que las etapas de la mitosis, pero se les agrega un nmero I II segn se trate de la primera o segunda divisin celular, as, la meiosis se divide en: 1) Profase I Esta es la primera etapa de la meiosis y, tambin es la etapa de mayor duracin. En ella ocurre el proceso de crossing-over en el que los cromosomas homlogos intercambian parte de su D A por un proceso denominado recombinacin gentica. Esto cambia el contenido del DNA de los gametos respecto al del organismo progenitor y, ocurre cuando los cromosomas homlogos se encuentran muy juntos. Los lugares en los que ocurre recombinacin se llaman quiasmas. Esta etapa a su vez est dividida en 5 etapas:

Fig 4: esquema de las 5 subdivisiones de la profase I de la meiosis, mostrando el estado y apariencia de los cromosomas en cada una de ellas.

a) Leptoteno: cada cromosoma se condensa y, est unido por sus extremos a la envoltura nuclear. Los cromosomas ya se han replicado y consisten en dos cromtidas hermanas que se encuentran muy juntas.

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b) Cigoteno: los cromosomas homlogos comienzan a aparearse por sus extremos en puntos muy cercanos a la envoltura nuclear. Luego como en una especie de cierre, los cromosomas continan aparendose para alinearse en toda su extensin, quedado los genes homlogos enfrentados. Esta estructura se llama complejo sinaptonmico y, los cromosomas homlogos as apareados son el bivalente en que realidad es una tdrada ya que cada uno de los dos cromosomas est duplicado.
Fig 5: esquema del complejo sinptonemico

c) Paquiteno: ocurren las recombinaciones en que se intercambia el material gentico de cada cromosoma con su homlogo. Aqu ocurre el crossing over.

Fig 6: intercambio de D A que ocurre entre los cromosomas homlogos, donde se muestra el quiasma y luego el segmento intercambiado.

d) Diploteno: los cromosomas homlogos se desaparean, el complejo sinaptonmico se deshace y, los cromosomas homlogos quedan separados aunque permanecen unidos a travs de los quiasmas. En esta etapa los cromosomas se descondensan y ocurre sntesis de RNA.

Fig 7: microfotografa de los quiasmas formados entre los cromosomas homlogos.

e) Diacinsis: la sntesis de RNA cesa, los cromosomas se condensan intensamente y se sueltan de la envoltura nuclear que comienza a desaparecer. Los cromosomas homlogos siguen unidos a travs de los quiasmas en los lugares donde ha ocurrido recombinacin

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Luego de este ltimo punto termina la Profase I y comienzan las etapas de divisin celular propiamente tal.

2) Metafase I En esta etapa desaparecen los quiasmas. Los centrolos se encuentran duplicados y se mueven hacia los polos de la clula. Se organiza el huso mittico y los cromosomas se ubican por pares homlogos en el centro de la clula, de modo que cada cromosoma de un par homlogo se orienta hacia un polo diferente de la clula, sin importar si es paterno o materno, lo que genera diferentes distribuciones posibles de cromosomas y aumenta la variabilidad gentica del proceso

3) Anafase I Los cromosomas migran hacia polos opuestos de la clula, segregndose los cromosomas homlogos en los extremos opuestos de ella, gracias a la depolimerizacin y polimerizacin de los microtbulos del huso mittico.

4) Telofase I Alrededor de los cromosomas en cada extremos de la clula se reconstituye la envoltura nuclear. La cromatina se descondensa y, casi simultneamente ocurre la divisin del citoplasma o citodiresis. Despus de la primera divisin cada clula resultante tiene la mitad del nmero de cromosomas original, pero cada cromosoma se encuentra duplicado y compuesto por dos cromtidas hermanas. Ahora comienza la segunda divisin celular, sin que se produzca una nueva duplicacin del D A. 5) Profase II La cromatina se condensa nuevamente en cromosomas y la envoltura nuclear desaparece.

6) Metafase II Los cromosomas se ubican en el centro de la clula y el huso mittico se une a ellos de modo que cada cromtida hermana se orienta hacia un polo distinto de la clula.

7) Anafase II Cada cromtida hermana migra hacia un polo distinto de la clula

8) Telofase II En cada polo celular, Alrededor de los cromosomas se reconstituye la envoltura nuclear, se descondensan los cromosomas y ocurre la divisin del citoplasma

Cada clula resultante despus de la segunda divisin meitica es haploide ya que tiene la mitad de los cromosomas originales de la especie y cada cromosoma tiene solo una cromtida.

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Fig 7: esquema de la meiosis

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FECU DACI En el proceso de fecundacin los gametos haploides se fusionan para dar origen a un nuevo organismo que es nuevamente diploide. Cuando esto ocurre, el vulo se activa para comenzar el desarrollo del nuevo individuo y, los ncleos de ambos gametos se fusionan para formar el genoma del nuevo organismo. La fecundacin es un proceso especie-especfico, lo que quiere decir que los espermios y vulos de cada especie se reconocen especficamente a travs de molculas especiales de adhesin, lo que impide que un espermio de una especie fertilice vulos de una especie diferente. Aunque muchos espermios ataquen a un mismo vulo, un vulo slo puede ser fecundado por un espermio. La poliespermia se encuentra bloqueada gracias a una depolarizacin rpida de la membrana del vulo, el cambio de las cargas a travs de la membrana impide que un segundo espermio pueda fusionarse. Esto es importante, porque si ms de un espermio inyecta su ncleo en un vulo se forma ms de un huso mittico y la segregacin de los cromosomas durante la divisin celular es anormal, resultando en embriones alterados o no viables.

Fig 8: esquema del proceso de fecundacin en eucariontes superiores, que ocurre con el encuentro entre un espermatozoide y un ovocito.

La fertilizacin comienza cuando la cabeza de un espermio contacta la cubierta gelatinosa de un vulo. Esto gatilla en el espermio la llamada reaccin del acrosoma, en la que el contenido de la vescula del acrosoma se libera al medio externo, esta contiene enzimas hidrolticas que ayudan al espermio a penetrar la cubierta del vulo y as llegar a la capa vitelina adems de protenas que ayudan a la unin del acrosoma a esa capa y, enzimas hidrolticas que ayudan a penetrar a travs de la capa vitelina para llegar a la membrana plasmtica. Cuando las dos membranas plasmticas entran en contacto se fusionan y, as se produce la entrada del ncleo del espermio hacia el interior del vulo. Una vez fertilizado el vulo pasa a llamarse cigoto. Una vez que los dos pro-ncleos se encuentran en el interior del vulo deben migrar para encontrarse y poder fusionarse. Este movimiento se realiza por medio del citoesqueleto. Los cromosomas se juntan cuando las envolturas nucleares desaparecen en preparacin a la primera divisin celular dando trmino al proceso de fecundacin y comenzando el desarrollo embrionario.

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ACTIVIDAD PRCTICA OBJETIVOS: Identificar las fases del ciclo celular y sus caractersticas principales. Describir las fases de la mitosis, meiosis y sus caractersticas principales. Aprender a identificar clulas en distintas etapas de la mitosis y meiosis mediante observacin microscpica de tejidos fijos. Conocer algunas generalidades del proceso de fecundacin mediante observacin microscpica de distintas preparaciones, frescas y permanentes.

A.- Observacin microscpica del proceso de fecundacin in vitro de molusco (Choromytilus chorus). OBJETIVOS: Realizar preparaciones frescas de gametos masculinos y femeninos de molusco (Choromytulus chorus) para su caracterizacin microscpica. Observar una fecundacin in vitro Los moluscos (Phyllum Mollusca) son organismos invertebrados, de cuerpo blando y que generalmente estn cubiertos por una concha calcrea. Poseen un manto que cubre el cuerpo y deja una cavidad donde se ubican las branquias, los sistemas reproductor, renal y digestivo. Debido a su gran capacidad adaptativa, los moluscos han llegado a ocupar los ambientes ms diversos, tanto marinos como aguas dulces y terrestres. Son el segundo grupo de seres vivos de mayor abundancia y diversidad ya que en la actualidad cuenta con ms de 50.000 especies vivientes. Algunos ejemplos de organismos pertenecientes al grupo de los moluscos son los choros, choritos, almejas, lapas, caracoles, pulpos y calamares. En el trabajo prctico vamos a utilizar ejemplares de un molusco perteneciente a la clase bivalvia o bivalvo, Choromytilus chorus (choro maltn). Los bivalvos presentan su cuerpo comprimido lateralmente y lo cubren dos valvas o conchas articuladas en la regin dorsal (charnela). Poseen un pie muscular que puede emerger a travs de las valvas pues est adaptado para excavar el fondo del mar en busca de alimentos. No poseen cabeza, slo una amplia lmina de tejido o manto que forma una cavidad donde se localizan las branquias. El manto est unido a la concha mediante fibras musculares.

Fig 9: esquema de un molusco bivalvo tpico

Su sistema respiratorio, digestivo, excretor y nervioso son bastante simples, presentando unas pocas estructuras especializadas. Los sistemas reproductivos de hembras y machos son estructuralmente similares, pues poseen un par de gnadas ramificadas que rodean el intestino y tienen

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conductos simples que se dirigen a un tubo acufero con salida al exterior. Descargan as sus gametos directamente al agua y, tanto la fertilizacin como el desarrollo embrionario son externos. Su estado larvario es del tipo veliger (larva que vive libre en un medio acutico), despus de lo cual comienza la secrecin calcrea que da lugar a la concha. Esto le permite secretar filamentos firmes producidos por una glndula especializada (biso), que se pegan firmemente a las rocas en las cuales habitan. Con el objeto de obtener especimenes de choro maltn adecuados para nuestro trabajo prctico, se contara con ejemplares vivos que han siso mantenidos en un acuario con agua de mar filtrada, suministrndoseles una adecuada oxigenacin del medio con una bomba de aire.

ACTIVIDAD PRCTICA 1: extraccin de gametos masculinos y femeninos de choro maltn

El color del manto de los choros es caracterstico de cada sexo, lo que nos permite seleccionar ejemplares adecuados para la extraccin de los gametos. Para observar el color del manto, es necesario levantar de forma cuidadosa una de las valvas tratando de no daar las estructuras internas del molusco. Junto con identificar su sexo, podemos observar sus principales caractersticas estructurales, mencionadas anteriormente en la gua (charnela, manto, pie, branquias, biso, sistemas de rganos). En los choritos las gnadas estn compuestas por conductos ciliados ramificados desde donde se abren numerosos sacos o folculos, se encuentran rodeando el intestino y estn muy prximas, siendo a veces muy difcil separarlas. Cuando las gnadas o el tejido gonadal han alcanzado la plena madurez, son fciles de ver y ocupan gran parte del cuerpo blando del animal. Los gonaductos que transportan los gametos hasta la cavidad corporal se desarrollan, aumentan de tamao y se pueden observar a simple vista. El color es la caracterstica que permite diferenciar a machos de hembras, siendo las gnadas de los primeros de color amarillo y en el caso de las hembras de color caf oscuro. Una vez identificados los aparatos reproductores, que se encuentran en posicin ventral, procederemos a tomar una muestra de gametos masculinos de los ejemplares de color anaranjado, aspirando con una pipeta Pasteur la solucin blanquecina que se encuentra sobre el manto y la gnada. Esta solucin corresponde a los espermatozoides maduros. Repetiremos el procedimiento con los ejemplares femeninos, con el manto de color negro, pero esta vez tomaremos una muestra de la solucin de color negro que se encuentra sobre el manto y la gnada que corresponde a los vulos maduros. Colocamos cuidadosamente ambas muestras en una placa de vidrio, rotulada en forma adecuada, agregando aproximadamente 2 mL de agua de mar filtrada a cada uno de los pocillos con el objeto de resuspender los gametos en la solucin. Proceda entonces a adicionar a un tercer pocillo de la placa una alcuota de aproximadamente 1 mL de cada una de las soluciones de gametos, agitando suavemente la mezcla con el objeto de que los gametos masculinos y femeninos entren en contacto. De esta forma, hemos realizado una fecundacin in vitro. Realice preparaciones frescas de la solucin de gametos masculinos, femeninos y de la muestra recin fecundada, colocando una gota de cada una de las soluciones en un portaobjetos limpio y adecuadamente rotulado. Coloque sobre la gota un cubreobjetos y proceda a observar sus preparaciones al microscopio. Aplique sus conocimientos de microscopa, observando la muestra con los objetivos 4, 10 y 40X antes de utilizar el objetivo de inmersin. Describa brevemente sus observaciones, caracterizando la estructura de los gametos y su comportamiento en cada una de las muestras.

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ACTIVIDAD PRCTICA 2: Observacin microscpica de preparaciones permanentes de tejidos en distintas etapas de la mitosis. OBJETIVO: Identificar y caracterizar clulas en distintas etapas de la mitosis en preparaciones permanentes de tejido vegetale Aplicando sus conocimientos de microscopa observe la preparacin de mitosis en clulas vegetales de Allium cepa (L.). Identifique en el tejido observado clulas que se encuentren en distintas etapas de la mitosis, indique sus caractersticas principales realizando un dibujo simple, esquemtico y claro.

ACTIVIDAD PRCTICA 3: Observacin microscpica de una preparaciones permanentes de tejidos en meiosis y gametos masculinos de mamfero. OBJETIVO: Identificar y caracterizar clulas en distintas etapas de la meiosis permanentes. en preparaciones

Aplicando sus conocimientos de microscopa y la utilizacin correcta del objetivo de inmersin, observe las siguiente preparaciones: oviductos y/o ovarios de rata, epiddimo y/o testculo de rata. Identifique en la preparacin observada clulas en distintas etapas de la meiosis, describiendo sus caractersticas principales en el espacio asignado para tal propsito en el informe. Observacin microscpica de preparaciones permanentes de gametos masculinos Aplicando sus conocimientos de microscopa y la utilizacin correcta del objetivo de inmersin, observe las siguientes preparaciones: espermatozoides de humano y/o toro. Observe detalladamente la organizacin de las clulas que componen los tejidos, e identifique en ellos la presencia de los gametos y sus estructuras caractersticas.

Bibliografa
ed da

Biologa Celular y Molecular, De Robertis y de Robertis, 11 , 2 impresin, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires. Elementos de Biologa Celular y Gentica. Parte 3. Transmisin de la Informacin y Reproduccin.
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Varios Autores. 1 d., 1985, Departamento de Biologa Celular y Gentica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

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Zoologa, Cockrum E.L. y Mc Cauley, W.J., 1 , 1967, Ed. Interamericana, Mxico.

Materiales Laboratorio. Mitosis, Meiosis y Fecundacin Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) 2 unidades de erizo negro o chorito malton. 3 microscopios. 1 Tijera. 1 pinza. 2 gotarios. 1 porta objeto escavado. Cubre objetos 2 vasos pp 50 ml Lpiz rotulador Por curso: Agua de mar filtrada. Preparaciones histolgicas: Mitosis (catafilo de cebolla), Corte de testculos, Corte de ovarios y Muestra de espermatozoides de toro y rata. Televisor con microscopio. 3 Aceite de inmersin. 3 Solucin limpiadora. Papel ptico.

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