UFSJ - Universidade Federal de So Joo Del-Rei Engenharia de Bioprocessos Bioqumica Bsica Experimental Professora: Sandra

Dosagem de Protenas

Ouro Branco, 27 de Abril de 2012

Introduo
As protenas so compostos orgnicos de alto peso molecular, formadas pela sequncia de aminocidos. Representam cerca de 50 a 80% do peso seco de uma clula, sendo o composto orgnico mais encontrado na matria viva. Existem muitas espcies

de protenas diferentes, cada uma possui uma funo biolgica diversa. A maior parte da informao gentica expressa pelas protenas. A BSA a protena mais abundante no plasma sanguneo e serve como depsito, assim como transporte de protena para numerosos componentes, como cadeia longa de cidos graxos ou bilirrubina, ligados por alta afinidade protena. A estrutura secundria da albumina bovina contm muitos resduos de cistina e estes so helicoidais em grande parte da cadeia. Apresenta fcil isolamento em grandes quantidades, favorecendo sua alta estabilidade e solubilidade. a principal protena que contribui para a presso coloidal osmtica do sangue e tambm para o transporte de protenas para numerosos compostos endgenos e exgenos [2]. O reagente de Folin uma soluo de ons complexos polimricos, formados a partir de heteropolicidos fosfomolibdicos e fosfotungsticos . Esse reagente oxida os fenolatos, reduzindo os cidos a um complexo azul [3]. O mtodo de Lowry a metodologia mais utilizada para a determinao de protenas. O princpio do mtodo baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com protenas, na presena do catalisador cobre (II), e produz um composto com absoro mxima em 750 nm. um mtodo muito sensvel. [4]

Objetivo
Determinao da quantidade de protenas em vrias amostras com composies diferentes, com o auxlio de determinados reagentes e por meio do aparelho de espectrofotometria.

Materiais e Mtodos
Reagente 1: Composto de: Cu(SO4)2 1%

Tartarato K/Na+ 2% 2% Na2CO3 e NaOH 0,1 M Reagente Follin Soluo de Albumina (soro de boi) 1 mg/mL Para curva padro

TABELA 1- Esquema para dosagem de protenas em diferentes amostras

Tubos 1A 1B 2 2B 3 3B 4 4B 5 5B 6A 6B 7 7B BSA --------------20L 20L 40L 40L 100L 100L 200L 200L --------------------------------gua 200L 200L 180L 180L 160L 160L 100L 100L --------------100L 100L ----------------Leite 1 % --------------------------------------------------------------100L 100L ----------------Leite 0,1% ----------------------------------------------------------------------------200L 200L Reagente 1 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL Reagente Follin 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L 200L

Realizou-se para o determinado experimento duas amostras para cada tipo de soluo (duplicata). No primeiro tubo A e B adicionou-se 200L de gua nos respectivos tubos. No segundo tubo A e B adicionou-se 20 L de BSA em cada um, juntamente com 180L de gua. No terceiro tubo A e B adicionou-se 40L de BSA em cada um, juntamente com 160L de gua. No quarto tubo A e B adicionou-se 100 L de BSA e de gua em cada um destes tubos. No quinto tubo A e B adicionou-se 200 L de BSA. No sexto tubo A e B adicionou-se 100L de gua e de Leite 1% em cada um dos tubos. E no stimo tubo adicionou-se 200mL de Leite 0,1%. Em todos os tubos listados acima adicionou-se 2mL de Reagente 1 em cada um deles e incubou-se estes tubos 10 min. em temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se em cada um destes tubos 200L de reagente Follin e colocouse os tubos dentro de um armrio escuro (que se encontrava dentro de laboratrio). E por ltimo liga-se o aparelho espectrofotmetro e zera o mesmo com o tubo branco. Fazer as leituras dos padres e das amostras com o filtro de 750nm. Anotar as leituras das absorbncias.

Resultados e discusses

Primeiramente para se calcular a concentrao de protenas presentes em cada amostra foi necessrio construir a curva padro de BSA (concentrao de BSA versus absorbncia). Tabela 2- Leitura das absorbncias encontradas no espectrofotmetro

Tubos 1 (Branco) 2 3 4 5 6 7

A 0,121 0,197 0,189 0,286 0,585 1,119 0,243

B 0,107 0,113 0,205 0,382 0,569 0,979 0,219

Tabela 3- Volume gasto de soluo de BSA e de H2O para o preparo dos tubos e mdia das absorbncia das solues:
Tubo Volume soluo Padro de BSA (2mg/mL) (L) Volume de H2O (L)

Mdia das Absorbncias a 750 nm (duplicata)

1 2 3 4 5 6 7

0 20 40 100 200

200 180 160 100 0 100 0

0,114 0,155 0,197 0,334 0,577 1,049 0,231

Concentrao de BSA nos tubos: 1- 0mg/mL 2- 0,1mg/mL 3- 0,2mg/mL 4- 0,5mg/mL 5- 1mg/mL

Com os dados obtidos, possvel construir a curva padro para BSA (Absorbncia versus Concentrao de BSA mg/mL):

Curva Padro de BSA com regresso linear

0.7 0.6 Absorbncia nm 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Concentrao de BSA em mg/mL Absorbancia Linear (Absorbancia) Linear (Absorbancia) y = 0.6145x R = 0.9131

Pelo Curva Padro acima Eixo X: Concentrao e Eixo Y: Absorbncia podemos concluir que: O grfico nos fornece uma concentrao que no caso a concentrao de BSA obtida por cada valor de absorbncia encontrado. A absorbncia varia de forma linear com a contrao da amostra, a medida que aumenta a concentrao da amostra, aumenta tambm a absorbncia encontrada. Concentrao do Leite 1%: Pela equao da reta: Y: 0,6145x 1,049: 0,6145x X:1,7mg/mL: 1,7x10-3g/mL 1,7x10-3g ____1mL X ___ 100mL X: 0,17g/mL Concentrao do Leite 0,1%: Y: 0,6145x 0,231: 0,6145x X: 0,376mg/mL: 3,76x10-4g/mL 3,76x10-4g ______1mL X: ______ 100mL X: 0,038g/mL

Teor do Leite g/mL

Referncias Bibliogrficas

[1]
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2004/constituintes_microor g/proteinas.htm, acessado em 22/04/2012

[2]
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-93322006000100014 acessado em 22/04/2012

[3]
https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:md2SVJMAKoJ:bjft.ital.sp.gov.br/artigos/especiais/especial_2009_2/v12ne_t0231.pdf+reagente+de+folinciocalteau&hl=ptBR&gl=br&pid=bl&srcid=ADGEEShvxuGWnjk6aSbcijvLAyfvtWqb_3SbUAIoeTlRMTj7rfeC3cR_3xr_HkjrrJVyZQOMZGG7xAkmK7jZT82bA_lJO1xu3JqFCCb8TOigOsrwCLFNoWefsa6ahCit1kahnySCCV&sig=AHIEtbQkQc4q80umJ6xpeF9Nyj A5xHMToQ

[4]
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40421998000600020 acessado em 22/04/2012