Cadena de Polimerasas MONOGRAFIA

BIOLOGIA GENERAL. CELULAR Y MOLECULAR.
REACCION EN CADENAS DE POLIMERASAS.
NDICE:
Biografa de Kary mulls:..PAG:3 Definicin de pcr:...PAG:4 Como funciona la pcr ..PAG:5 Tipos de pcr::.PAG:6 Enzima que actan en el pcr:..PAG:7
Desnaturalizacin: ..............................................................PAG: 9
Alineamiento:..PAG:9 Evolucin de la tcnica.PAG: 11 Diagnstico de enfermedades hereditarias...PAG:13 de enfermedades oncolgica:.PAG: 13
Diagnstico
Diagnstico prenatal:......PAG: 14 infecciosas:.PAG: 14
Deteccin de enfermedades
Referencias bibliogrficas:.PAG: 18
E.A.P DE MEDICINA HUMANA.
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BIOGRAFA DE KARY MULLS:
Se crio en Columbia (Carolina del Sur) En 1966 se traslad a (California), para estudiar bioqumica, consiguiendo un doctorado en la especialidad bajo la direccin de J. B. Neilands en la Universidad de Berkeley. En 1972 se traslad a Kansas siguiendo a su esposa, y consigui empleo como investigador en cardiologa peditrica, adquiriendo formacin en biologa. Roto su matrimonio, volvi a California, trabajando un tiempo en la Universidad de San Francisco, como investigador en qumica farmacutica, en el campo de las endorfinas. En 1979 fue contratado por la compaa californiana Cetus Corporation, donde trabajaba con oligonucletidos(secuencias cortas de ADN o ARN). En 1985, mientras segua trabajando en Cetus, desarroll la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa, (PCR en sus siglas en ingls), una de las tcnicas centrales en biologa molecular, que permite la
amplificacin de una secuencia especfica de ADN usando nucleosidos trifosfatados y
una polimerasa de ADN. La idea de multiplicar una hebra de ADN millones de veces le vino en 1983 pero no convenci a sus colegas de la compaa, por lo que tuvo que demostrar por s mismo la aplicabilidad de la tcnica. La versin de la tcnica desarrollada inicialmente por Mulls, aunque efectiva, era poco eficiente, hasta que se le ocurri emplear polimerasas del ADN termoestables, extradas de microrganismos termoflicos, inicialmente la polimerasa llamada Taq, procedente de Thermus aquaticus. Por esta invencin, de gran valor en biotecnologa y como herramienta de investigacin cientfica y forense, en 1993 recibi el Premio Japn y el Premio
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Nobel de Qumica, compartido con el canadiense Michael Smith. Cetus, la compaa de Mulls, le dio una recompensa de 10.000 dlares por la invencin de la PCR y luego vendi la patente por 300.000.000 de dlares a Roche Molecular Systems, una seccin de la importante compaa farmacutica Hoffman-La Roche. En un orden de cosas ms anecdtico, sin la PCR no tendra sentido el argumento de la novela Parque Jursico de Michael Crichton, llevada al cine en 1993 bajo la direccin de Steven Spielberg, donde se reconstruye el genoma de animales extintos a partir de restos mnimos de su sangre conservada en mbar. DEFINICION DE PCR: La PCR es un mtodo in vitro de sntesis de ADN con el que un segmento particular de ste es especficamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a travs de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubacin en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. As se obtienen en cuestin de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN. La PCR es una tcnica de biologa molecular altamente especfica, rpida, sensible y verstil para detectar cantidades nfimas de un cierto ADN especfico, posibilitando su fcil identificacin y prescindiendo del uso de radioistopos, indispensables antes de su invencin. Al principio, su inventor enfrent dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo haba que aadir la enzima ADN polimerasa, ya que sta se inactivaba con las temperaturas tan altas demandadas para desnaturalizar el ADN y exponer las bases nitrogenadas de sus nucletidos. Otro inconveniente era que haba que hacerlo manualmente en tres balos os mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rpidamente la muestra de un bajo al otro y luego al ltimo, repitiendo esto varias decenas de veces.
El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas termales junto a geissers a 75C, la cual tiene una ADN polimerasa que funcionaba bien a altas temperaturas (72C) e incluso es estable a 94C, supuso un gran avance, Termociclador . A estos aparatos se les atribuye junto con las ADN polimerasas termoestables el permitir automatizar por completo la PCR. va activa durante todo el proceso. Esto, junto con el diseo de los termocicladores o aparatos que consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rpidamente en determinados tiempos, condujo a la automatizacin total del proceso UN CEVADOR: Un partidor, cebador, iniciador o primer, es una cadena de cido nucleico o de una molcula relacionada que sirve como punto de partida para la replicacin del ADN. Es una secuencia corta de cido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y acta como punto de inicio para la adicin de nucletidos con el fin de copiar la hebra molde. Se necesita un partidor porque la mayora de ADN polimerasas, enzimas que catalizan la replicacin del ADN, no pueden empezar a sintetizar una nueva cadena de ADN de la nada, sino que solo pueden aadir nuclotidos a una hebra preexistente. Se necesitan dos para la reaccin de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra. Son de aproximadamente 20 nucletidos, porque es la cantidad necesaria para que de manera probable se una a un sitio especfico de la cadena de ADN.
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COMO FUNCIONA LA PCR La reaccin consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos: el primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrogeno del ADN para desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocurre la hibridacin de las cadenas
desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN sinttico de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas
complementarias de ambas clases de ADN. Esta temperatura depende de la temperatura de fusin, pero
generalmente oscila entre 50 y 60C. El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la que la polimerasa extiende la longitud de los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos libres en el orden que le va dictando la secuencia de nucletidos de la cadena que acta como molde. TIPOS DE PCR:
PCR anidada Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificacin dentro del ampliacin inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificacin de un ampliacin obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los cebadores. La desventaja de sta tcnica es que no nos permite cuantificar la muestra. PCR IN SITU: La PCR in situ consiste en donde una los reaccin productos de PCR en
secciones histolgicas o clulas,
generados
pueden
visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondasde ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin.
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PCR MLTIPLEX: PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de base de datosPCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:

1er paso: retro transcripcin a partir del ARN. 2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin . Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas.
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En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromos (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termocicladores apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo ( forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados. ENZIMA QUE ACTAN EN EL PCR:
Solo pueden utilizarse polimerasas que sean capaces de actuar a las altas temperaturas empleadas en la reaccin. En la actualidad la mayora de las polimerasas que se suministran comercialmente son versiones recombinantes e incluso mejoradas por ingeniera gentica. Dos enzimas de uso muy extendido son la ADN polimerasa taq, proveniente de la bacteria Termo filical Thermus aquaticus. y la Venta de la bacteria Thermococcus litoralis. Sus temperaturas Optimas de catlisis oscilan alrededor de los 72C, temperatura a la cual incorporan aproximadamente 100 nucletidos por segundo, siendo estables a altas temperaturas, incluso por encima de 92C. De las dos enzimas sealadas, la popularidad alcanzada por la Taq rebasa por mucho y en diferentes aspectos a otras polimerasas. Esta enzima es una protena que consta de una
sola cadena poli peptdica con un peso molecular de aproximadamente 95 kDa., cuenta con actividad de exonucleasa. Y su fidelidad de replicacin depende de la concentracin del ion Mg+2 y de los dNTPs, as como del que exista o no balance en la concentracin de estos ltimos
DESNATURALIZACIN
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de simple cadena que acta como molde para la sntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un calentamiento a 94C, el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen.
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Fig. 6. Desnaturalizacin del ADN. Los puentes se rompen dejando al ADN en forma de cadena sencilla, permitiendo as exponer las diferentes bases nitrogenadas para la hibridacin con los oligonucletidos cebadores.
sta es una etapa crtica, ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente, lo que se consigue a temperaturas de 94C, durante por lo menos un minuto. Si la muestra tiene alto contenido de G+C, se recomienda aumentar de preferencia el tiempo.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rpida a partir de los 95C (vida media a 92.5C =2h, a 95C = 40 min. y a 97.5C = 5 min.), por lo que a estas temperaturas o superiores es aconseja- ble disminuir el tiempo de incubacin. En la prctica se suele empezar con un perodo de desnaturalizacin prolongado (cinco minutos a
94C), para asegurarse que la desnaturalizacin se lleve a cabo a lo largo de toda la molcula del ADN.
ALINEAMIENTO:
La enzima, como todas las ADN polimerasas, necesita del grupo OH- libre en el extremo 3 del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificacin, a partir de donde iniciar la sntesis. Este punto constituye el sitio de crecimiento de la cadena complementaria al molde.
Mientras que un cebador (referido como el 5 o sentido) es complementario a la secuencia del extremo 5 de la regin del ADN molde a amplificar, el otro
es al extremo 3 de la misma, pero en la cadena opuesta.
Fig. 7. Inicio de la reaccin de la PCR. Los cebadores complementarios que flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de hidrgeno. De esta manera la polimerasa puede comenzar a extenderlos para copiar
ambas hebras molde.
El alineamiento especfico de ambos cebadores se produce a una temperatura determinada por composicin de bases y oscila entre 40 y 72C. Ambas para
cadenas originales del ADN sirven simultneamente como moldes sintetizar sus respectivas cadenas complementarias nuevas.
Un aumento de temperatura favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con sitios apcrifos del ADN molde.
EXTENSIN
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los
iniciadores se aparean, la polimerasa
empieza
a copiar
la hebra,
incorporando desoxirribonuclesidos mono fosfatos en direccin 5 3 (figura 8). Esta etapa debe realizarse a una temperatura coincide con alta, que es la que
la mxima actividad de la polimerasa (72C) para evitar
alineamientos inespecficos de los iniciadores. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin, debiendo estimar 1 min. para alargar 1000 nucletidos. Es comn que al finalizar to-
Fig. 8. Progreso de la reaccin de la PCR. A la temperatura ptima de la ADN Polimerasa Taq (72C), la enzima agrega los dNTPs a partir del 5 hacia el extremo 3.
Dos los ciclos se realice un ltimo alargamiento por 5 min. a 72C, para asegurarse que todos los productos de amplificacin estn completamente ter- minados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud.
NATURALEZA
EXPONENCIAL
DE LOS CICLOS:
Al final del primer ciclo, ambas hebras de una molcula bicatenaria de ADN a las que se les hayan apareado
los iniciadores
han sido copiadas
para
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generar dos nuevas cadenas bicatenaria.
Cuando
se repite por segunda
ocasin
el ciclo de tres pasos, las dos
molculas del primer ciclo se copian para producir ahora cuatro molculas. El tercer ciclo genera ocho molculas. En teora, 20 ciclos producirn aproximadamente un milln de copias de la molcula molde de ADN, y 30 ciclos generarn alrededor de mil millones de copias de sta.
Pero en la prctica, el proceso no es tan eficiente. El nmero de ciclos que se utiliza adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR. Este nmero depende de la cantidad de ADN que existe en
Fig. 9. Conclusin de la PCR. Tericamente entre ms ciclos de reaccin integren el programa de amplificacin, ms productos idnticos se generarn. Pero al aumentar los ciclos tambin se aumenta proporcionalmente posibilidad de agregar errores en las nuevas secuencias. la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera emprica). la
Es importante evitar un nmero alto de ciclos, ya que pueden dar lugar a la

amplificacin inespecficas.
de productos no deseados
originados
por hibridaciones
Hay que tener en cuenta que la enzima sufre el efecto meseta que describe la atenuacin en la tasa de la acumulacin del producto, reflejndose esto en que despus de un nmero determinado de ciclos la amplificacin deja de comportarse de manera exponencial, volvindose aritmtica, y finalmente llega a una fase estacionaria. Afortunadamente, cuando el efecto meseta se
presenta, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilizacin.
EVOLUCIN DE LA TCNICA:
La tecnologa de la PCR est experimentando continuas mejoras. Por ejemplo, y como ya se hizo referencia arriba, ahora es posible utilizar
eficientemente el ARN como substrato, ya que la ADN polimerasa rTth tambin posee actividad de retro- transcriptasa, y, por ende, convierte el ARN a ADNc, y acto seguido lo amplifica.
Como se ha mencionado anteriormente, el ADN blanco que se va a amplificar suele tener una longitud mxima a las 3000 bases. Pues bien, ya es comn emplear la tcnica de PCR larga, capaz de amplificar secuencias de hasta 40,000 bases de longitud, lo cual facilita genmicos. el desarrollo de proyectos
Otro claro ejemplo
de la sofisticacin
de esta reaccin es su versin en
tiempo real, que permite cuantificar con una alta confiabilidad la concentracin de hasta mltiples substratos presentes de una reaccin, en virtud de que cada cadena copiada genera una seal fluorescente de longitud de onda
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distinta que es medida al instante por el mismo termocicladores de tiempo real.
APLICACIONES
Las aplicaciones de la PCR son mltiples, abarcando desde la evolucin hasta la clnica, pasando por la gentica, la biologa molecular y la biotecnologa; amn de aplicaciones en la agricultura y la ganadera.
La
PCR
es
especialmente
til
en
la
deteccin
de
enfermedades genticas tales como la fibrosis qustica, la hemofilia clsica y las distrofias mus culares
Dchenme/Becker.
Esta tcnica ha tenido un impacto maysculo en la medicina forense, campo en el que se est utilizando en investigacin criminal como parte de la
tecnologa de la huella digital del ADN. Gracias a su aplicacin, es posible excluir o incriminar a sos- pechosos utilizando muestras extremadamente pequeas de material biolgico encontrado en la escena del crimen.
En
microbiologa,
la
PCR
permite
identificar
al
agente
infeccioso
independientemente de su respuesta serolgica, lo que representa una gran ventaja en casos donde los anticuerpos aparecen luego de un largo perodo de infeccin y a veces en forma impredecible. Tambin en aquellos
numerosos casos donde se quiere distinguir si la presencia de anticuerpos es seal de infeccin antigua o activa, como ocurre ante el hallazgo de
anticuerpos contra el virus de la hepatitis C, y la necesidad de precisar si el virus est presente o no.
Tambin es de gran utilidad en el diagnstico de enfermedades
virales
neonatales, donde el diagnstico serolgico de la infeccin es generalmente enmascarado por la presencia de anticuerpos mater- nos circulantes.
Otra
de sus aplicaciones
es en el estudio
del complejo
mayor
de
histocompatibilidad que determina los antgenos conocidos como molculas HLA de clase II, que son las que establecen la compatibilidad en trasplante de rganos. La PCR permite estudiar no slo organismos vivos, sino tambin sus restos fsiles, congelados o momificados. Incluso se puede partir de ADN de
especies diferentes, y mediante el empleo de iniciadores consenso lograr la amplificacin de secuencias gnicas de una especie cuya secuencia del gen de inters es an desconocida.
Tambin puede servir para medir la expresin de un determinado gen. Para ello se extrae ARN mensajero, se le practica una retro transcripcin con la que se obtiene un ADNc, y ste se utiliza como material de partida para la amplificacin. Al partir de ARNm en vez de ADN genmico, se est estimando la expresin de un determinado gen que incluso pude llegar a realizarse de una manera semicuantitativa.
DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS
Un fragmento obtenido por PCR puede ser utilizado directamente clonacin, para ser secuenciado, o para ser utilizado hibridaciones en filtro tipos Southern o Northern.
para
como sonda en
Tambin mediante una simple electroforesis en gen se puede estudiar, a nivel

de ADN genmico, la existencia determinado.
de delaciones
e inserciones
en un gen
Enfermedades cuya base es una mutacin puntual pueden ser diagnosticadas por PCR, si luego se trata con una enzima de restriccin cuyo sitio se ve afectado por dicho cambio puntual en la secuencia nucleotdica. Incluso,
puede estudiarse a los descendientes del paciente en cuestin que an no han desarrollado la enfermedad, para ver si han heredado la mutacin
responsable (portadores) de la enfermedad. Aunque controversial por no disponer de cura, ya es posible estudiar tambin si un determinado gen causante de una enfermedad de la madurez est la
latente desde la niez, como en el caso de la corea de Huntington, enfermedad de Alzheimer, etc.
DIAGNSTICO
DE ENFERMEDADES ONCOLGICAS
La PCR permite estudiar alteraciones genticas en protooncogenes genes supresores de tumores que estn involucrados neoplasias. El seguimiento
y en
en el origen de las
de los resultados obtenidos con un tratamiento
puede ser monitoreado mediante la deteccin por PCR de clulas malignas; es posible llegar a detectar hasta una clula cancergena en 106 clulas normales, siendo la sensibilidad alcanzada ms que la de cualquier otra tcnica. Esto es ampliamente aplicado en malignidades hematopoyticas para la deteccin de enfermedad mnima residual.
DIAGNSTICO PRENATAL
De una pequea cantidad de sangre extrada al feto o de una biopsia de tejido

placentario (vellosidades corinicas) es posible obtener ADN sobre el cual se pueden practicar estudios como los arriba descritos. En efecto, desde hace ms de una dcada se ha venido analizando el ADN de embriones incipientes (productos de fertilizacin in vitro), regularmente en la etapa de mrula, para el sexado de stos y la seleccin de aquellos que no porten mutaciones de enfermedades que se sabe frecuentemente en la
pareja en cuestin. Este anlisis puede ser de gran vala para el caso de trastornos heredados ligados al cromosoma X, donde en los embriones o fetos del sexo femenino se descarta la enfermedad o en el peor de los casos se confirma la condicin de portadora; mientras que en los del sexo masculino se precisa si sern sanos o afectados.
Actualmente, este tipo de estudios se puede realizar tambin buscando clulas o ADN del feto en la sangre perifrica intervenir al feto. Sin embargo, estas aplicaciones prenatales han resultado polmicas por los posibles riesgos ticos y de discriminacin. de la madre, sin la necesidad de
DETECCIN DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS
Mediante PCR es posible monitorear
infecciones bacterianas y virales. Los
procedimientos convencionales de deteccin se basan en la posibilidad de crecer los microrganismos en cultivo o en detectar su presencia en el paciente mediante anticuerpos. La desventaja de estos mtodos es que pueden tardar semanas. La PCR detecta directamente difciles de cultivar, tales como los patgenos tradicionalmente trachomatis, Legionella
Chlamidia
pneumophila y Mycoplasma pneumoniae. As como a aquellos que requieren de largos perodos para su cultivo concentracin
y que se encuentran
en muy baja
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en los lquidos biolgicos, como el caso del Mycobaterium
tuberculosis,enfermedad en la que muchas veces el tratamiento emprico tiene que iniciarse antes del
diagnstico
definitivo, apoyndose en el
hasta hace poco nicamente cuadro clnico.
Mediante amplificar
el
PCR
es
posible
secuencias al virus o a la
correspondientes
bacteria de una manera especfica y muy sensible, pudiendo llegar a detectar un microbio entre 106 clulas infectadas con agentes infecciosos como el del SIDA, hepatitis B, tuberculosis, herpes,
brucelosis, malaria, etc. Dentro del campo del SIDA se est utilizando para el diagnstico prenatal, y para cuantificar la carga y la actividad viral mediante la obtencin de ADNc y amplificacin de secuencias especficas del virus. Esto ltimo se utiliza para dar seguimiento del xito de los tratamientos.
ESTUDIOS DE EVOLUCIN MOLECULAR
La PCR ha sido utilizada para generar secuencias de genes a lo largo de la evolucin y establecer el grado de relacin entre especies y poder construir as rboles filogenticos.66,67 La homologa se mide comparando cambios
nucleotdicos en el mismo gen entre diferentes especies o por comparacin de genes mitocondriales que no se recombinan durante la meiosis y tienen un alto porcentaje de puntos de mutacin. Incluso se pueden estudiar especies ex- tintas o fsiles (se ha logrado amplificar ADN de
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Estudios de evolucin. Los fsiles encontrados se convierten en fuentes de material gentico confiables para realizar estudios evolutivos a manera molecular.
Tambin se han realizado estudios de evolucin entre poblaciones humanas, llegando a la conclusin del origen africano de nuestra especie, gracias al
estudio del ADN mitocondrial.
Recomendaciones
Hasta aqu todo parece un camino sin obstculo alguno, en el que la PCR ha podido sustituir a muchas tcnicas dando mayor especificidad y sensibilidad. Pero precisamente esto ltimo es su principal problema. Su gran sensibilidad se ha vuelto en su contra, pues, por pequea que sea la menor contaminacin de la muestra inicial, puede tener serias consecuencias. Si el ADN de partida se contamina, se amplificarn tambin estas contaminaciones. Una fuente de contaminacin importante puede ser el ADN del propio operario o el
disperso en el ambiente. As, se han dado casos en ensayos de anlisis de sexo en que el propio operario varn ha contaminado la muestra o en anlisis de fsiles donde ha aparecido ADN
humano; lo mismo en anlisis forenses donde la muestra se ha contaminado. Pero la principal fuente de contaminacin son los propios productos amplificado de
reacciones anteriores: cualquier fragmento
puede contaminar
nuevas muestras y ser de nuevo amplificado. Para intentar evitar estos falsos positivos, siempre deben tenerse en cuenta las siguientes normas: deben
separarse en el espacio y en el tiempo las etapas de pre amplificacin y amplificacin; siempre deben utilizarse testigos negativos, donde en lugar de poner ADN se substituya su volumen por agua. Adems, las muestras deben
ser analizadas por lo menos por duplicado. Jams deben almacenarse productos de PCRs con muestras biolgicas que servirn de substratos o de reactivos. Igualmente, se recomienda no usar un alto nmero de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al nmero de stos. Los anteriores riesgos y limitaciones son el verdadero problema que ha impedido que la PCR se haya popularizado an ms, despus de todos estos aos, como la tcnica nica para muchas pruebas de diagnstico. Hoy por hoy existe la alta posibilidad de falsos positivos. Como se puede apreciar, las aplicaciones de esta Novedosa tcnica parecen no tener lmites, pues en esencia el proceso permite, como se ha dicho, encontra una aguja en un pajar, al generar un segundo pajar lleno de copias de dicha aguja
Medicina En medicina, de diagnosis :
la
PCR
se
emplea
fundamentalmente
como
herramienta
La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante.
El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus
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correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.
Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la medicina y
antropologa forense se han visto enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biolgicos que ms informacin puede proporcionar es el ADN. La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos perodos si las condiciones son propicias. En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeas o estn deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades tiles para posteriores pasos de anlisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teora basta una sola molcula para que el proceso pueda tener lugar. Tambin debido a la naturaleza de la tcnica y su propsito de amplificacin de fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que este ADN pueda ser empleado como molde para una reaccin de PCR.
En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que an no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podra preservarse son la brea las cenizas, el mbar, hielos histricos polares o glaciares y ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales de apatita de restos de esqueleto,6 siendo posible de ese modo
caracterizar cadveres, fsiles u otros restos mediante genotpico por anlisis de micro satlites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN genmico del hombre
de Neanderthal. El propsito sera utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios filogenticos o etnogrficos o de poblaciones mediante la comparacin de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separacin evolutiva de dos especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mnimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos
Referencias
Barrera Saldaa HA.
Informacin gentica: estructura, funcin y
manipulacin. Conacyt, Co- leccin Ciencia Bsica. Mxico. 1992.
Barrera Saldaa HA, Ortiz Lpez R, Rojas Martnez A Resndez Prez D. Reaccin en cadena de la polimerasa: Una nueva poca dorada en la biologa molecular. Ciencia y Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60.
Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Am. 1990; 262 (4): 56-61,
Sci
Templeton NS. The polymerase chain reaction. History, methods, and applications. Diagn MolPathol. 1992; 1 (1): 5872.
Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring
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E.A.P DE MEDICINA HUMANA.

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secciones histolgicas o clulas,

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es al extremo 3 de la misma, pero en la cadena opuesta.

ambas hebras molde.

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iniciadores se aparean, la polimerasa

la mxima actividad de la polimerasa (72C) para evitar

han sido copiadas

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generar dos nuevas cadenas bicatenaria.

se repite por segunda

el ciclo de tres pasos, las dos

Es importante evitar un nmero alto de ciclos, ya que pueden dar lugar a la

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presenta, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilizacin.

Otro claro ejemplo

de esta reaccin es su versin en

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distinta que es medida al instante por el mismo termocicladores de tiempo real.

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Tambin es de gran utilidad en el diagnstico de enfermedades

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

Tambin mediante una simple electroforesis en gen se puede estudiar, a nivel

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de ADN genmico, la existencia determinado.

de los resultados obtenidos con un tratamiento

De una pequea cantidad de sangre extrada al feto o de una biopsia de tejido

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