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UNIVERSIDAD BIBLIOTECA DE ALEJANDRIA INSTRUCTIVO DE OPERACIÓN, CALIBRACIÓN, VERIFICACIÓN Y AJUSTE DEL

UNIVERSIDAD BIBLIOTECA DE ALEJANDRIA

INSTRUCTIVO DE OPERACIÓN, CALIBRACIÓN, VERIFICACIÓN Y AJUSTE DEL ESPECTROFOTÓMETRO

UV-VIS AGILENT 8453E

Año 53 A. C

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ACT:

1

INSTRUCTIVO DE OPERACIÓN, CALIBRACIÓN, VERIFICACIÓN Y AJUSTE DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS AGILENT 8453E

Elaboró: Hefestión

Revisó: Balacro

Aprobó: Alejandro Magno

Fecha

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1. OBJETO

Este instructivo describe las acciones a desarrollar para la operación, calibración, verificación y

ajuste del equipo Espectrofotómetro UV-VIS Modelo 8453E, marca Agilent.

2.

ALCANCE

Es aplicable al Espectrofómetro UV-VIS Modelo 8453E Marga Agilent, empleado en la

determinación del contenido de Naftalenos del Turbocombustible.

3.

GLOSARIO DE TÉRMINOS

3.1

Espectrofotómetro.

Uno de los instrumentos principales del laboratorio es el espectrofotómetro. Este instrumento tiene

la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite

realizar dos funciones:

a) Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo

midiendo la absorbancia (Abs) a distintas longitudes de onda ( ) y graficar estos valores en función

de la longitud de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades

espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia

tenga características únicas. Al ser expuestos a la luz del especrofotómetro, algunos electrones de

los átomos que forman las moléculas absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es emitida en forma de fotones. Esa emisión de

fotones es distinta para cada sustancia, generando un patrón particular, que varía con la longitud de onda usada. Dependiendo de la longitud de onda, será la cantidad de energía absorbida por

una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar la Absorbancia vrs la .

b) Nos dice cuánta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La

concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley de Beer-Lambert: “a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus

electrones”. De ahí que: Abs = K C L

Donde:

Abs: absorbancia

K: coeficiente de extinción molar

C: concentración L: distancia que viaja la luz a través de la muestra. (Normalmente es de 1 cm)

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La celda promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (L). La ecuación describe una línea recta, donde el origen es cero. Si L es constante (1.0 cm) y se conoce

el valor de K, podemos calcular C con base en la Abs: Abs / K L = C

El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible (190 a 1100 nm). La longitud de onda se determinada por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo con la longitud de onda escogida. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje de trasmitancia (%T).

Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente ecuación:

%T = - Log Abs.

El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la vez, ahorrando la necesidad de hacer los cálculos. (Traxmitancia = cantidad de luz que atraviesa la mezcla).

Una característica del instrumento es la necesidad de “hacer un blanco” en el equipo antes de cada lectura. Esto se hace colocando una celda con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que puedan presentar los demás componentes de la reacción a esa longitud de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a una longitud de onda de luz específica para cada tipo de sustancia.

3.2 Celdas Las celdas son unos viales de plástico transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Las mejores celdas para trabajos de investigación son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es mínima. Son más costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables. Las de plástico vienen con distintas características. Por lo general son desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de celda plástica a usar depende del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz visible, que son las más económicas, y otras para el rango de visible a ultravioleta. Estas son más versátiles.

Ambos tipos de celdas deben manejarse con cuidado para evitar rayar su superficie por donde pasa la luz. Si la celda está rayada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no pasan

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por la muestra, por lo que puede dar lecturas de absorbancia erróneas. Esto es especialmente crítico cuando queremos determinar concentración en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que la celda no tenga rayas ni esté sucia. Si se ven marcas de polvo u otro tipo de sucio la celda debe limpiarse con papel tipo Klenees. Si la celda se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel Klenees para evitar pegarle los aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningún otro tipo de papel para limpiar las celdas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran caer en la muestra o rayar su superficie.

Las celdas viene en distintos volúmenes, desde 1 mL hasta 4 mL El volumen a escoger depende de la cantidad de muestra disponible. Si la muestra disponible es poca o difícil de conseguir, lo mejor es usar una celda de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la muestra. Por lo general, la muestra utilizada para hacer la lectura se pierde, sobre todo si es una sustancia bien sensitiva.

3.3 Absorbancia: Medida de la cantidad de radiación ultravioleta o visible que es absorbida por

una muestra.

3.4 Ruido: Señales aleatorias producidas por un número de componentes en el espectrofotómetro,

incluido el detector y los componentes electrónicos que procesan la señal.

3.5 Fluctuación: Rango de oscilación de la línea base, excluyendo los picos de ruido.

3.6 Tolerancia: Valores extremos de un error permitido por las especificaciones, las regulaciones,

etc., para un instrumento de medición dado.

4. DOCUMENTOS APLICABLES

Formato para resultados de calibración y verificación del Espectrofotómetro Agilent 8453E.

Formato de reporte de resultados de la determinación de Naftalenos en el Turbocombustible.

Método de ensayo estándar para determinar Naftalenos en Turbocombustibles de aviación Jet por Ultravioleta-Visible, norma ASTM D1840.

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5. CONDICIONES GENERALES

o

El espectrofotómetro consta de dos (2) tipos de lámparas: Deuterio y Tungsteno, las cuales deben encenderse al menos 15 minutos antes de la lectura de muestras para cualquiera de los analisis. En el lado frontal del equipo se observa un led indicador de luz Amarilla-verdosa cuando las lámparas están encendidas que se torna de color Amarillo- anaranjado cuando están apagadas. Las lámparas se deben apagar luego de culminar un analisis. Lo anterior con el fin de prolongar la vida útil de las mismas.

o

Este equipo no debe apagarse, excepto cuando sea absolutamente necesario.

o

El equipo debe mantenerse protegido de los cambios de voltaje a través de una conexión permanente a una UPS

6. DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO

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6.1 El espectrofotómetro de arreglo de diodos consta de un área abierta para el portacelda,

cavidad con instrumentación óptica y de diodos, lámparas de deuterio y tungsteno, pantalla y teclado. Su diseño permite obtener simultáneamente todos los valores de absorbancia desde 190 hasta 1100 nm. Vea la figura 1.

Celda para la muestra (tamaño ampliado)
Celda para la muestra
(tamaño ampliado)

FIGURA1. Espectrofotómetro UV-VIS AGILENT

6.2 Celda patrón sellada de Cloruro de Holmio, N° C 005-0403 de Perkin-Elmer, empleada para

efectos de calibración/verificación del espectrofómetro.

6.3 Descripción de las tareas (Tasks) básicas de operación:

6.3.1 Longitud de Onda Simple: Permite leer a una sola longitud de onda preestablecida.

6.3.2 Longitud de Onda Múltiple: Permite leer a varias longitudes de onda, para una misma muestra y al mismo tiempo. En este modo se pueden configurar correcciones con background.

6.3.3 Ecuación: Permite obtener datos de concentración en solución, previa obtención de los coeficientes de la curva en la tarea de Cuantificación.

6.3.4 Cuantificación: A través de esta tarea se logra elaborar las curvas de calibración para obtener los coeficientes que se ingresan en la tarea de Ecuación.

7.

DESARROLLO

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7.1 OPERACIÓN

El Analista del Laboratorio

a. Estando en la pantalla de EQUATION, oprime F3 (File/Print).

b. Se desplaza hasta la opción METHOD, con la flecha , y oprime ENTER.

c. Oprime F1 (Instrument).

d. Desplazándose con las teclas ≠≠≠≠, se posiciona en el método que desea trabajar, y oprime ENTER.

Nota

1: EN ESTE MOMENTO SE OBSERVA EL MENSAJE DE QUE SE ESTA CARGANDO EL METODO, AL FINALIZAR SE OBSERVA EN LA PARTE SUPERIOR DE LA PANTALLA EL NOMBRE DEL METODO CARGADO.

e. Oprime dos veces la tecla ESC (Escape).

f. Oprime la tecla m , y se desplaza con la flecha ENTER

hasta la opción LAMPS ON/OFF, y oprime

g. Se desplaza con la flecha

hasta la opción UV LAMP ON y oprime ENTER (la lámpara UV

estará encendida si el recuadro está oscuro )

h. Se desplaza con la flecha hasta la opción VIS LAMP ON y oprime ENTER (la lámpara

VIS estará encendida si el recuadro está oscuro )

Nota 2: LAS DOS (2) LAMPARAS DEBEN ENCENDERSE AL MENOS 15 MINUTOS ANTES DE LA LECTURA DE MUESTRAS PARA CUALQUIERA DE LOS ANALISIS. EN EL LADO FRONTAL DEL EQUIPO SE OBSERVA UNA LUZ AMARILLA-VERDOSA CUANDO LAS LÁMPARAS ESTÁN ENCENDIDAS Y UN COLOR AMARILLO-ANARANJADO CUANDO ESTÁN APAGADAS. LAS LÁMPARAS SE DEBEN APAGAR LUEGO DE CULMINAR UN ANALISIS. EL EQUIPO NO DEBE APAGARSE, EXCEPTO CUANDO SEA ABSOLUTAMNTE NECESARIO.

i. Oprime F6 ( DONE, para grabar los cambios realizados en las lámparas).

j. Coloca la celda de cuarzo de 1 cm con el blanco en el portacelda. Purgando muy bien previamente.

k. Oprime F8 (Blank). Espera unos segundos hasta que aparezca el mensaje de BLANK DONE.

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l. Coloca la misma celda de cuarzo con la muestra. Purgando unas dos veces con la solución a cuantificar.

m. Oprime F7 (Sample). Espera unos segundos hasta que aparezca el resultado en la tercera columna de la pantalla (Res).

n. Para apagar las lámparas, repite los pasos del f al i, en este caso, los recuadros de las dos

Nota

lámparas deben quedar vacios .

3: ES MUY IMPORTANTE APAGAR LAS LÁMPARAS YA QUE EL TIEMPO DE VIDA ÚTIL DE ESTAS ES BAJO.

7.2 CALIBRACION

7.2.1 Pruebas de Diagnóstico y Mantenimiento.

Nota

4: LAS LAMPARAS DEBEN ESTAR ENCENDIDAS AL MENOS 15 MINUTOS ANTES DE REALIZAR LA CALIBRACIÓN. PROCEDIMIENTO DE OPERACIÓN PARA ENCENDERLAS, EN EL NUMERAL 7.1.

El Analista y/o Metrólogo del laboratorio

REVISE EL

a. Oprime la tecla F5 (System), Selecciona F3 (Tests), y con la flecha se posiciona en

DIAGNOSTIC AND MAINTENANCE y oprime ENTER.

b. Verifica que el portacelda esté vacío. Oprime F1 (Dark Current Spectrum).

c. Espera y registra los valores mínimos y máximos de los conteos y los compara con los valores permitidos en el formato de calibración para este instrumento.

d. Oprime la tecla ESC.

e. Oprime F2 (Intensity) y ENTER.

f. Espera unos segundos y verifica moviéndose con la flecha que los valores de conteos

sean superiores a los indicados en la Tabla 1. Registra en el formato de calibración correspondiente los valores mínimos observados.

TABLA 1. Valores Recomendados para la Prueba de Intensidad

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RANGO DE LONGITUD DE ONDA, nm

NUMERO DE CONTEOS

220

– 350

> 5000

350

– 500

> 2000

500

– 950

> 4000

g. Oprime la tecla ESC.

h. Oprime F3 (Stablility) y ENTER.

i. Espera unos segundos y verifica si el valor de la variación de conteos en 340 nm es inferior a

100. Registra un valor aproximado al observado.

j. Oprime la tecla ESC dos veces.

Nota 5: LAS LAMPARAS DEBEN ESTAR ENCENDIDAS AL MENOS 45 MINUTOS ANTES DE REALIZAR LAS SIGUIENTES PRUEBAS.

7.2.2 Pruebas de Desempeño.

a. Selecciona F3 (Tests).

b. Oprime ENTER y F1 (Procedures).

c. Con la flecha se desplaza hasta la opción WAVELENGHT ACCURACY, y oprime ENTER

d.

Con la flecha

se desplaza hasta el espacio FILTER ID y coloca el valor 5096

e. Oprime F6 (Done)

f. Verifica que el portacelda esté vacío y oprime ENTER para obtener el blanco.

g. Coloca el patrón de cloruro de Holmio líquido (NIST 2034) y oprime ENTER.

h. Espera a que lea todos los picos, y con la flecha se desplaza y observa si cumplió las

tolerancias (ver certificado), en dado caso se colocará que pasó en el formato de calibración. Si no cumplió con alguno de los picos, se dejará registrado en observaciones tanto el pico y su desviación.

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i.

Oprime la tecla F1. Retira la celda del portaceldas

j.

Con la flecha se desplaza hasta la opción PHOTOMETRIC NOISE

k.

Oprime ENTER y espera un minuto.

l.

Registra en el formato de calibración el valor medido y lo compara con el permitido.

m.

Oprime la tecla F1.

n.

Con la flecha se desplaza hasta la opción BASELINE FLATNESS

o.

Oprime ENTER dos veces

p.

Registra en el formato de calibración el valor medido y lo compara con el permitido.

q.

Oprime ESC y se desplaza hasta la opción NO con la flecha

, y oprime ENTER.

r.

Oprime F5 (Equation).

s.

Realiza el procedimiento de apagado de las lámparas descritas en el capítulo 7.1.

t.

Coloca el rótulo de calibración diligenciado en el equipo.

u.

Archiva el formato diligenciado en la hoja de vida del equipo

7.3

VERIFICACION

El Metrólogo y/o Analista del Laboratorio

a.

Realiza las actividades descritas en el numeral 7.1 empleando el patrón de trabajo que se prepara de acuerdo con el Anexo 3.

b.

Registra el resultado obtenido en el correspondiente formato.

c.

Archiva el formato diligenciado en la hoja de vida correspondiente.

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7.4. AJUSTE

7.4.1 Recalibración de la Escala de Longitud de Onda

Nota

6: ESTA OPERACIÓN SOLO SE REALIZA CUANDO SE CAMBIAN LAS LÁMPARAS, O EL EQUIPO HA SUFRIDO ALGUN GOLPE.

El Metrólogo del Laboratorio

a. Presiona F5 (System).

b. Presiona F3 (Tests), selecciona Diagnostics and Maintenance y presiona ENTER

c. Oprime F4 (Maintenance) , selecciona WAVELENGHT RECALIBRATION con ENTER

d. Presiona F8 (Execute) para realizar la acción.

e. Selecciona ADJUST oprimiendo ENTER para recalibrar.

f. Presiona F6 (Done) para dejar la pantalla.

g. Oprime ESC. y F5 (Equation)

7.4.2 Volviendo a Cero el Contador de las Lámparas

Nota 7: ESTA OPERACIÓN SOLO SE REALIZA CUANDO SE CAMBIAN LAS LÁMPARAS.

a. Presiona F5 (System).

b. Presiona F4 (Records),

c. Presiona F1 (EMF)

d. Selecciona Setup Limits y presiona ENTER

e.

Con la flecha

se desplaza a la posición de la lámpara que se desea reiniciar el contador.

f. Oprime F7 (Reset) y ENTER.

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g.

Oprime ESC. dos veces y luego F5 para quedar en el módulo de Ecuación.

8.

CONTINGENCIAS

No aplica

9. BIBLIOGRAFÍA

Método de ensayo estándar para la determinación de Naftaleno en turbocombustibles de

aviación, por Ultravioleta - VIsible . Norma ASTM D 1840-2003.

Manual de operación del equipo Espectrofotómetro UV-VIS Agilent Modelo 8453E.

10.

ANEXO(S)

ANEXO A1. Tabla de Parámetros del método. ANEXO A2. Preparación Patrón de Trabajo de Naftaleno

ANEXO A1.

TABLA DE PARÁMETROS DEL METODO

METODO

NAFTALENOS

LONGITUD ONDA, nm

285

ECUACIÓN

A

CORR. BACKGROUND

350 - 450

RESULTADO

Abs

ANEXO A2.

PREPARACION PATRON DE TRABAJO DE NAFTALENOS

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El Metrólogo del Laboratorio

a.

Pesa aproximadamente 1,4 g de naftaleno grado reactivo con aproximación a 0,001 g en un balón aforado de 250 mL.

b.

Completa a volumen (250 mL) con Isooctano grado reactivo.

c.

Tapa el balón y agita vigorosamente hasta disolver el naftaleno.

d.

Toma 5 mL de la solución anterior con una pipeta aforada y los deposita en un balón aforado de 100 mL.

e.

Completa el volumen (100 mL) con isooctano.

f.

Tapa el balón vigorosamente por 15 s.

g.

Con otra pipeta aforada toma de nuevo 5 mL y repite los pasos d, e y f empleando un nuevo balón aforado de 100 mL.

h.

Calcula la absorbancia utilizando la siguiente ecuación:

A= 0.285 * W

Donde:

W = Peso en gramos de naftaleno utilizado

i. Calcula la incertidumbre.

j. Identifica el patrón de trabajo preparado con la absorbancia obtenida, incertidumbre, fecha de preparación y vencimiento.

RELACIÓN DE NOVEDADES Y CAMBIOS

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Novedad

Página/Capitulo

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