QuantiFERON-CMV

Ensayo del interfern-gamma en sangre entera para detectar la respuesta a antgenos peptdicos del citomegalovirus humano FOLLETO ILUSTRATIVO

rganos slidos y de pacientes infectados por VIH. QuantiFERON CMV est destinado para el monitoreo en serie del nivel de inmunidad anti CMV en personas expuestas al riesgo de desarrollar la enfermedad CMV, ya que la prdida de esta funcin inmunitaria puede 2 estar asociada al desarrollo de la enfermedad CMV. Principios del ensayo El ensayo QuantiFERON -CMV se divide en dos estadios. Primero, se recoge sangre entera en cada uno de los tubos del QuantiFERON CMV que incluyen un tubo de medicin de nulo de control, un tubo para antgenos CMV y un tubo para la muestra activada por mitgeno. El tubo del mitgeno se usa en el ensayo QuantiFERON -CMV como control positivo. Esto puede resultar muy til en los casos en los que existan dudas sobre el estado inmunolgico del individuo. Los tubos se colocarn en el incubador a 37C lo antes posible y en las 16 horas siguientes a la toma de la sangre. Tras 16 - 24 horas de incubacin, los tubos se centrifugan, se extrae el plasma y se mide la cantidad de IFN-y (UI/ml) con el QuantiFERON ELISA. La cantidad de IFN- en las muestras de plasma procedentes de los tubos de antgeno CMV y de mitgeno podran superar a menudo el umbral mximo de la mayora de los lectores ELISA, incluso en el caso de individuos ligeramente inmunosuprimidos. Para obtener resultados cualitativos, usar los datos calculados para el plasma sin diluir. Para obtener resultados cuantitativos donde se requieran valores UI/ml efectivos, las muestras de plasma se deberan diluir en Diluyente Verde en una relacin de 1/10 y ensayar con mtodo ELISA junto con plasma sin diluir. Nota: Para muestras que se encuentran dentro de los mrgenes del QuantiFERON ELISA (es decir, hasta 10 UI/ml), se debera usar el resultado obtenido con el plasma sin diluir. Para estas concentraciones de IFN-, los valores obtenidos si se usara la diluicin 1/10 de las muestras de plasma podran resultar inexactos. Se considera que el resultado del test es reactivo si el valor de IFN- detectado en el tubo de antgenos CMV es claramente superior al valor del IFN- del nulo (en UI/ml). La muestra de plasma estimulada con mitgeno sirve como control positivo de IFN-. Una respuesta baja al mitgeno (<0,5 UI/ml) indica un resultado indeterminado si la muestra de sangre tiene tambin una respuesta no reactiva ante los antgenos CMV. Este resultado puede ser debido a linfocitos insuficientes, reducida actividad de los mismos debido a la preparacin incorrecta de las muestras, a un llenado/mezclado incorrecto del tubo de mitgeno o porque los linfocitos del paciente sean incapaces de generar IFN- como ocurre con pacientes recin transplantados. La muestra de control nulo sirve como referencia para determinar el ruido de fondo o para excluir el IFN- no especfico presente en las muestras de sangre. El nivel de IFN- en el tubo de muestra de control nulo se substrae de la cantidad de IFN- medida en el tubo de antgenos CMV y en el tubo del mitgeno. Tiempo necesario para realizar el ensayo A continuacin se indica el tiempo necesario para llevar a cabo el ensayo QuantiFERON-CMV, as como el tiempo necesario para probar una serie de muestras (si vienen en lotes): Incubacin de los tubos a 37C: 16-24 horas ELISA: Aprox. 3 horas para una placa de ELISA Menos de 1 hora de trabajo Aadir de 10-15 minutos para cada placa extra REACTIVOS Y ALMACENAMIENTO Tubos de recogida de sangre para antgenos CMV y de control (Kit para un paciente nico, nmero de catlogo: 0192 0301) 1. Muestra de control nulo (tapa gris) 2. Antgeno CMV (tapa azul) 3. Muestra de control de mitgeno (tapa morada) 1 tubo 1 tubo 1 tubo

1,2

Slo para uso in vitro en laboratorio

USO PREVISTO El QuantiFERON -CMV es un ensayo in vitro que emplea una mezcla de pptidos que simulan las protenas del citomegalovirus humano (CMVH) con el fin de estimular las clulas presentes en la sangre entera heparinizada. La deteccin de interfern-gamma (IFN-) mediante un ensayo de inmunoabsorcin enzimtica (ELISA) sirve para el anlisis cuantitativo de las respuestas in vitro ante estos antgenos peptdicos; estas respuestas estn asociadas a la vigilancia inmunitaria de la infeccin por CMV. La prdida de esta respuesta inmunitaria puede ser un indicio de que el individuo est desarrollando la enfermedad CMV. El uso previsto de QuantiFERON -CMV es pues el monitoreo del nivel de inmunidad anti CMV en sujetos expuestos al riesgo de desarrollar la enfermedad. El QuantiFERON -CMV no es un ensayo para detectar la infeccin por CMV ni se debera utilizar para descartarla. INTRODUCCIN El CMV es un virus de tipo herptico con el que estn infectados entre el 50% y el 85% de la poblacin humana adulta. Cuando se desarrolla la enfermedad, se trata frecuentemente de una complicacin de la inmunosupresin (en particular despus de un transplante), y puede contribuir significativamente a la morbilidad y a la mortalidad de los receptores de transplantes. Las terapias inmunosupresivas que se emplean actualmente para la prevencin del rechazo de un rgano transplantado tienen efectos negativos en la respuesta inmunitaria de los linfocitos T y en la respuesta inmunitaria mediada por clulas (CMI), aumentando la susceptibilidad a las infecciones virales post transplante. La importancia del papel de las clulas T en la supresin de la replicacin CMV se confirma tambin por el hecho de que los linfocitos T CD8+ citotxicos especficos CMV (CLT) protejan de la patognesis asociada al virus. El conteo de los CTLs especficos CMV (CD8+) en pacientes inmunosuprimidos y la evaluacin de la produccin de IFN- pueden dislucidar el riesgo de desarrollar la enfermedad CMV. La produccin de IFN- puede sustituir la identificacin de CTL especficos CMV. El QuantiFERON-CMV es un ensayo que detecta la respuesta CMI ante los antgenos peptdicos que simulan protenas CMV. Los pptidos CMV estn diseados para detectar las clulas T CD8+, incluyendo los haplotipos HLA de clase I A1, A2, A3, A11, A23, A24, A26, B7, B8, B27, B35, B40, B41, B44, B51, B52, B57, B58, B60 y Cw6 (A30, B13), es decir, cubriendo ms del 98% de la poblacin. Los individuos infectados por CMV suelen tener linfocitos CD8+ en la sangre que reconocen estos antgenos. Este proceso de reconocimiento comprende la produccin y secrecin de citoquina, es decir, de interfern gamma (IFN-). Este ensayo se basa en la deteccin y posterior cuantificacin de las varias formas de IFN-y. Existen estudios que han demostrado que el nivel de concordancia entre las respuestas de IFN-y ante los pptidos CMV, segn y cmo se midan por el QuantiFERON -CMV, y la informacin serolgica anti CMV es del 97% en individuos sanos. Todos los individuos seronegativos resultaron ser no reactivos en el ensayo QuantiFERON -CMV y 16/17 (94%) de individuos seropositivos 1 resultaron ser reactivos en el QuantiFERON -CMV. Se obtuvieron resultados similares con muestras procedentes de transplantes de

Componentes QuantiFERON ELISA (Nmero de catlogo: 0350 0201) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Tiras de microplaca 24 x 8 pocillos Estndar IFN- humano (liofilizado) 1 vial Diluyente Verde 1 x 30 ml Conjugado concentrado 100X (liofilizado) 1 x 0,3 ml Concentrado 20x de tampn de lavado 1 x 100 ml Solucin enzimtica de sustrato 1 x 30 ml Solucin enzimtica de paro 1 x 15 ml

Material necesario (no se incluye en el suministro) Horno incubador a 37C. no se requiere CO2. Pipetas calibradas para pipetear volmenes variables entre 10 l y 1000 l, con puntas desechables. Pipeta multicanal calibrada para pipetear 50 l y 100 l, con puntas desechables. Agitador de microplacas. Agua desionizada o destilada (2 litros). Lavador de microplacas (se recomienda lavador automtico). Lector de microplacas equipado con un filtro de 450 nm y otro de referencia de 620 a 650nm.

No atenerse a las instrucciones del folleto ilustrativo puede dar lugar a resultados errneos. Rogamos lea atentamente las instrucciones antes del uso. No utilizar el kit si algn frasco de reactivo muestra signos de estar daado o de perder lquido antes del uso. No mezclar ni utilizar reactivos de ELISA de otros lotes de QuantiFERON ELISA. Desechar los reactivos no usados y las muestras biolgicas actuando en cumplimiento con la normativa local, regional y nacional pertinente. No utilizar los tubos de recogida de sangre de QuantiFERON CMV ni el kit QuantiFERON ELISA despus de la fecha de caducidad.

RECOGIDA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS QuantiFERON -CMV utiliza los siguientes tubos de recogida de sangre: Muestra de control nulo (tapa gris) Antgeno CMV (tapa azul) Muestra de control del mitgeno (tapa morada)

Instrucciones de almacenamiento Tubos para recogida de sangre Almacenar los tubos de recogida de sangre a 4C - 25C.

Para su uso, los tubos deben encontrarse a temperatura ambiente (17C - 27C). Los antgenos liofilizados se han secado en la pared interna de los tubos de recogida de sangre, as que es fundamental mezclar bien el contenido de los tubos con la sangre. Los tubos se colocarn en el incubador a 37C lo antes posible, y siempre en las 16 horas siguientes a la recogida de la sangre. Para obtener ptimos resultados, seguir el siguiente procedimiento: 1. Recoger por cada individuo 1 ml de sangre por venopuncin directamente en cada uno de los tubos de recogida del QuantiFERON -CMV. Como los tubos de 1ml aspiran la sangre relativamente despacio, mantener el tubo pegado a la aguja durante 2 3 segundos una vez que parezca estar lleno del todo para asegurarse de haber extrado el volumen correcto.

Kit de reactivos ELISA Guardar el kit a una temperatura entre 2C y 8C. Proteger en todo momento la solucin enzimtica de sustrato de la luz directa del sol. Reactivos reconstituidos o sin utilizar Las instrucciones sobre la reconstitucin de los reactivos se encuentran en la pgina 2, Estadio 2, Procedimiento (pasos 3 y 5). El Estndar del kit una vez reconstituido se puede conservar 3 meses como mximo si se guarda a una temperatura de entre 2C y 8C. Apuntar la fecha de reconstitucin del Estndar del kit. El concentrado 100x del conjugado una vez reconstituido se puede conservar 3 meses como mximo si se guarda a una temperatura de entre 2C y 8C. Apuntar la fecha de reconstitucin del conjugado. El conjugado listo para el uso debe utilizarse en las 6 horas siguientes de haber sido preparado. El tampn de lavado preparado a la concentracin de uso puede guardarse a temperatura ambiente (17C - 27C) como mximo 2 semanas. MEDIDAS DE PRECAUCIN Slo para uso de laboratorio in vitro. Peligro: La solucin enzimtica de sustrato contiene 3,3',5,5'tetrametilbenzidina, que resulta nociva si se ingiere, inhala o si entra en contacto con la piel. Irrita la piel y los ojos. Mutgeno. Protegerse los ojos, llevar guantes y manejar con la misma cautela que se manejan productos potencialmente cancergenos. Peligro: La solucin enzimtica de paro contiene H2SO4, perjudicial si se ingiere, inhala o si hay contacto con la piel o los ojos. Protegerse los ojos, llevar guantes y ropa protectora habitual de laboratorio. Si la solucin de paro entra en contacto con la piel o los ojos, enjuagar con agua abundante y acudir a un mdico. Peligro: El Estndar IFN- y el concentrado 100X de conjugado pueden provocar molestias gstricas si se ingieren, o irritaciones cutneas. Llevar guantes y la indumentaria protectora habitual de laboratorio. Manipular la sangre humana considerndola siempre como si fuera potencialmente infecciosa. Atenerse a las normas relativas a la manipulacin de sangre. En algunos reactivos se usa timerosal como conservante. Puede resultar txico ingerido, inhalado o si entra en contacto con la piel. El Diluyente Verde contiene suero de ratn normal y casena que pueden provocar alergias; evitar el contacto con la piel.

La marca negra del lateral de los tubos indica el volumen de llenado de 1 ml. Los tubos de recogida de sangre QuantiFERON -CMV estn validados para admitir volmenes de entre 0,8 - 1,2 ml. Si el nivel de sangre en cualquiera de los tubos no est cerca de la marca, se recomienda extraer otra muestra de sangre. Los tubos de recogida de sangre QuantiFERON -CMV estn validados para aspirar volmenes entre 0,8 - 1,2 ml, a una altura sobre el nivel del mar de 810m (2650 pies). A una altitud superior, los usuarios debern comprobar que la cantidad de sangre aspirada en cada tubo se encuentra dentro de estos lmites. Si la cantidad de sangre aspirada resulta insuficiente, tambin se puede tomar la sangre con una jeringa transfiriendo luego 1 ml en cada uno de los 3 tubos. Por razones de seguridad, la mejor forma de realizar esto es quitando la aguja de la jeringa, tomando las precauciones necesarias, quitando luego los tapones de los tres tubos QuantiFERON -CMV y aadiendo 1ml de sangre en cada uno (hasta llegar a la marca negra del lateral de la etiqueta). Volver a colocar bien los tapones y mezclar como se describe a continuacin. Si se utiliza una aguja con aletas para recoger la sangre, usar un tubo de purga para asegurarse de que el conducto est lleno de sangre antes de usar los tubos de QuantiFERON -CMV. Mezclar el contenido de los tubos agitndolos fuertemente durante 5 segundos ( 10 veces) para estar seguro de que toda la superficie interna del tubo est cubierta de sangre. La sangre en los tubos debera aparecer espumosa despus de mezclar. Es esencial que el mezclado se realice correctamente para que la sangre se mezcle bien con el contenido de los tubos.

2.

Vase el vdeo en la pgina web de Cellestis para ms informacin. 3. Etiquetar los tubos correctamente.

Usar el Estndar del kit reconstituido para producir una serie de diluciones de 3 concentraciones diferentes de IFN-. Diluir usando el Diluyente Verde del kit. Repetir el ensayo de estndar al menos dos veces; las operaciones explicadas a continuacin producen cantidades suficientes para ello. a. b. c. d. e. f. Etiquetar 4 tubos: S1, S2, S3, S4. Aadir 150l de Diluyente Verde a los 4 tubos (S1S4). Aadir 150 l de Estndar del kit en S1 y mezclar bien. Dispensar 50 l de S1 en S2 y mezclar bien. Dispensar 50 l de S2 en S3 y mezclar bien. El DV slo ser el estndar nulo (S4).
50L 50L

4. Los tubos se colocarn en el incubador a 37C lo antes posible y siempre dentro de las 16 horas siguientes a la recogida de la sangre. No refrigerar ni congelar las muestras de sangre. INSTRUCCIONES DE USO Estadio 1 Incubacin de la sangre y extraccin de plasma 1. Si la sangre no se coloca en el incubador inmediatamente despus de ser recogida, mezclar de nuevo los tubos inmediatamente antes de colocarlos en el incubador, tal como se describe en el paso 2 del apartado anterior. Incubar los tubos DE PIE a 37C entre16 y 24 horas. El incubador no precisa CO2 ni humidificacin. Los tubos se pueden conservar entre 2C y 27C un mximo de 3 das antes del paso siguiente. Tras la incubacin de los tubos a 37C, centrifugar los tubos 15 minutos a 2000 - 3000 FCR (g). El sedimento gelatinoso contiene las clulas que se separan as del plasma. Si no es as, habr que volver a centrifugar los tubos a mayor velocidad. Es posible extraer el plasma sin centrifugar aunque, en tal caso, habr que poner especial atencin en retirar el plasma sin las clulas. Las muestras de plasma pueden cargarse directamente de los tubos de recogida de sangre a la placa ELISA del QuantiFERON -ELISA, sobre todo si se utilizan equipos ELISA automatizados. Como alternativa, es posible almacenar las muestras de plasma antes de efectuar el ensayo ELISA ya sea en los mismos tubos centrifrugados o en recipientes de almacenamiento de plasma. Por ejemplo, recoger >150l de plasma en pocillos de microplacas o en microtubos en rack (ambos en formato de 96 pocillos) y sellar para prevenir prdidas o evaporacin durante el almacenamiento. Las muestras de plasma se pueden conservar hasta 4 semanas como mximo a temperaturas de entre 2C y 8C o inferiores a 20C (preferiblemente temperaturas inferiores a 70C) para periodos ms largos en tubos o en recipientes de almacenamiento de plasma.

GRFICA 1. Preparacin de la curva Estndar

150L

2. 3. 4.

S1

S2

S3

S4

Kit Standard 8.0 IU/mL

4.0 IU/mL

1.0 IU/mL

0.25 IU/mL

0 IU/mL (GD ONLY)

Preparar diluciones nuevas del Estndar del kit cada vez que se realice el ensayo ELISA. 5. Reconstituir el concentrado 100X de conjugado liofilizado con 0,3 ml de agua deionizada o destilada. Mezclar suavemente para que se forme la menor espuma posible para la total disolucin del conjugado. 6. El conjugado listo para su uso se prepara diluyendo la cantidad necesaria de solucin ya disuelta de concentrado 100X en Diluyente Verde (DV) tal como figura en la tabla 1 (Preparacin del conjugado). Mezclar bien pero suavemente para evitar que se forme espuma. Volver a guardar inmediatamente el concentrado 100X de conjugado que no se utilice a 2C - 8C. Utilizar exclusivamente Diluyente Verde.

5.

6.

Tabla 1. Preparacin del conjugado Volumen de concentrado 100X conjugado 10 l 15 l 20 l 25 l 30 l 35 l 40 l 45 l 50 l 55 l 60 l

Nmero de tiras 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Volumen de Diluyente Verde 1,0 ml 1,5 ml 2,0 ml 2,5 ml 3,0 ml 3,5 ml 4,0 ml 4,5 ml 5,0 ml 5,5 ml 6,0 ml

Estadio 2 - QuantiFERON ELISA para IFN- humano 1. Antes del uso, todas las muestras de plasma y reactivos, a excepcin del concentrado 100X de conjugado, debern encontrarse a temperatura ambiente (entre 17C y 27C). Esperar al menos 60 minutos para que se alcance un equilibrio. Retirar las tiras innecesarias del bastidor, volver a cerrarlas en la bolsita de aluminio y colocarlas de nuevo en la nevera donde quedarn almacenadas hasta que se necesiten. Reservar al menos una tira para los Estndares QuantiFERON ELISA y un nmero de tiras suficiente para los individuos que se estn testando. Despus del uso, guardar el bastidor y la tapa para usarlos con el resto de las tiras. Reconstituir el Estndar del kit liofilizado aadindole el volumen de agua desionizada o destilada COMO SE INDICA EN LA ETIQUETA del vial del estndar (la solubilizacin debe ser completa). Mezclar suavemente para minimizar la formacin de espuma. Al reconstituir el estndar atenindose al volumen indicado se obtiene una solucin con una concentracin de 8 UI/ml.

2.

3.

7. Antes del ensayo, mezclar los plasmas para que el IFN- se reparta homogneamente por toda la muestra. Diluir tambin los plasmas CMV y de mitgeno en Diluyente Verde (relacin 1/10, 10l de plasma mezclado con 90l de DV) si se requieren resultados cuantitativos. No diluir la muestra nula de plasma (blanco). Se recomienda efectuar el ensayo en estas muestras: Nulo, antgeno CMV, mitgeno, antgeno CMV (1/10), mitgeno (1/10)

4. La curva del Estndar se prepara usando 3 diluciones del Estndar del kit y el Diluyente Verde slo como Estndar 4 (0 UI/ml).

Sin embargo, el software de anlisis QUANTIFERON-CMV tambin soporta las siguientes opciones de muestra.

Nulo, antgeno CMV; mitgeno Nulo, antgeno CMV (1/10), mitgeno (1/10) Nulo, antgeno CMV, mitgeno, antgeno CMV (1/10) Nulo, antgeno CMV (1/10), mitgeno

Generacin de la curva del Estndar Determinar el promedio de los valores DO de las rplicas del Estndar del kit en cada placa. Dibujar una curva del estndar del logaritmo(e) del promedio de DO (eje y) respecto al logaritmo(e) de la concentracin de interferngamma de los estndares en UI/ml (eje x), omitiendo de estos clculos el estndar cero. Calcular la lnea que mejor se adecue a la curva del estndar por anlisis de regresin. En base la curva del estndar, determinar la concentracin de IFN- (UI/ml) de cada una de las muestras de plasma utilizando para ello el valor DO de dichas muestras. Para obtener resultados cualitativos, usar los datos calculados para plasma sin diluir. El ELISA es exacto para muestras de plasma que contengan hasta 10 UI/ml. Para obtener resultados cuantitativos, es decir, cuando se necesiten valores efectivos en UI/ml, usar el valor de plasma no diluido si est por debajo de 10 UI/ml, si se supera este lmite, usar los valores de las muestras diluidas de CMV y mitgeno multiplicados por 10. Estos clculos pueden realizarse usando uno de los diversos paquetes de software para lectores de microplacas a disposicin en el mercado, as como con hojas de clculo o programas de gestin de datos estadsticos (p. ej. Microsoft Excel). Se recomienda utilizar estos paquetes para calcular el anlisis de regresin, el coeficiente de variacin (%CV) de los estndares y el coeficiente de correlacin (r) de la curva de estndar. Control de calidad del ensayo La exactitud de los resultados del anlisis depender de la exactitud de la curva estndar que se genere. Por consiguiente, los resultados procedentes de los estndares debern revisarse antes de interpretar los resultados correspondientes a las muestras analizadas. Para que el ELISA se considere vlido: El promedio de DO para el Estndar 1 debe ser 0,600. El coeficiente de variacin (%) de los valores DO de las rplicas del Estndar 1 y 2 debe ser 15%. Los valores DO de las rplicas del Estndar 3 y 4 (Diluyente Verde) no deben alejarse en ms de 0,040 unidades DO de su promedio. El coeficiente de correlacin (r) calculado a partir del promedio de absorbancia de los estndares debe ser 0,98. Si no se cumplen estos requisitos, el anlisis no ser vlido y habr que repetirlo. El promedio de DO para el Estndar Cero (Diluyente Verde) debe ser 0,150. Si el promedio de DO es > 0,150, habr que revisar el procedimiento de lavado de las placas.

8. Aadir 50l de conjugado recin preparado a la concentracin lista para el uso en los pocillos de ELISA sirvindose de una pipeta multicanal. 9. Aadir 50l de las muestras de plasma a los pocillos correctos usando una pipeta multicanal. Para terminar, aadir 50 l/pocillo a cada una de las muestras de Estndar (S1 - S4). 10. Mezclar bien el conjugado y las muestras de plasma/estndares durante 1 minuto en un agitador de microplacas. 11. Tapar cada una de las placas e incubarlas a temperatura ambiente (entre 17C y 27C) durante 120 5 minutos. Mientras estn en el incubador las placas no debern exponerse a la luz directa del sol.

12. Durante la incubacin, diluir una parte del concentrado 20X de tampn de lavado con 19 partes de agua desionizada o destilada y mezclar bien. Se suministra suficiente concentrado 20X de tampn de lavado como para preparar 2l de tampn a la concentracin de uso. Lavar los pocillos con 400l de tampn listo para usar durante al menos 6 ciclos. Se recomienda utilizar un lavador de placas automtico. Es muy importante que se laven bien para que el anlisis d los resultados previstos. Asegurarse de que todos los pocillos estn completamente llenos de tampn (hasta el borde) antes de iniciar un ciclo de lavado. Se recomienda dejar escurrir durante 5 segundos como mnimo entre ciclo y ciclo. Aadir desinfectante normal de laboratorio al depsito de evacuacin y seguir los procedimientos establecidos para descontaminar el material potencialmente infeccioso. Volcar las placas sobre un pao absorbente para que escurran los restos de tampn que queden. Aadir 100 l de solucin enzimtica de sustrato en cada pocillo y mezclar bien con un agitador de microplacas.

13.

14. Tapar cada una de las placas e incubarlas a temperatura ambiente (entre 17C y 27C) durante 30 minutos. 15. Mientras estn en el incubador las placas no debern exponerse a la luz directa del sol. Despus de incubarlas durante 30 minutos, aadir 50l de solucin enzimtica de paro a cada pocillo y mezclar. Se aadir la solucin enzimtica de paro a los pocillos en el mismo orden y aproximadamente a la misma velocidad que el sustrato en el paso 13. Medir la Densidad ptica (DO) de cada pocillo a los 5 minutos de interrumpir la reaccin mediante un lector de microplacas equipado con un filtro de 450nm y con un filtro de referencia de 620nm a 650nm. Para calcular los resultados se utilizarn esos valores de DO.

Interpretacin de los resultados Los resultados del ensayo QuantiFERON-CMV se interpretarn segn los siguientes criterios: CMV menos Nulo 1 [UI/ml] < 0,2 0,2 Mitgeno menos Nulo 1 [UI/ml] 0,5 indiferente Resultado QFN-CMV No reactivo Reactivo Informe/ interpretacin Inmunidad anti CMV NO detectada Inmunidad anti CMV Detectada Resultado indeterminado para la capacidad de respuesta al CMV

16.

CLCULOS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO Cellestis facilita el software de anlisis para QuantiFERON -CMV que analiza datos sin elaborar y calcula los resultados. El software realiza el control de calidad del ensayo, genera la curva del estndar y da un resultado del ensayo para cada muestra en UI/ml. En lugar de utilizar el software de QuantiFERON -CMV, tambin pueden analizarse los datos mediante el mtodo siguiente.

< 0,2

< 0,5

Indeterminado

Los niveles de IFN- de la muestra de antgeno CMV y del control positivo del mitgeno suelen estar fuera del campo del lector de microplacas. Esto no afecta a los resultados cualitativos. En el apartado Resolucin de problemas se detallan las posibles causas.

El kit/componentes estn caducados.

Poner cuidado en utilizar el kit antes de la fecha de caducidad. Asegurarse de utilizar el Estndar y el concentrado 100X de conjugado en los tres meses siguientes a la fecha de reconstitucin. Desechar el sustrato si toma un color azul. Utilizar reactivos limpios.

LIMITACIONES Los resultados del anlisis QuantiFERON -CMV deben verse en relacin con el historial epidemiolgico del individuo, el estado mdico actual y otras evaluaciones diagnsticas. Pueden darse resultados poco fiables o indeterminados si: El usuario no se atiene a los pasos descritos en este folleto. Los niveles de IFN- en el tubo de la muestra del blanco son xcesivos. Pasan ms de 16 horas desde que se haya extraido la muestra de sangre hasta el momento que se pone a incubar a 37C.

La solucin enzimtica de sustrato est contaminada.

Curva de estndar no lineal y diferencias entre duplicados

Causas posibles Solucin Lavar la placa al menos 6 veces con 400l/pocillo de tampn de lavado. Puede que sean necesarios ms de 6 ciclos de lavado dependiendo del lavador en uso. Deber dejarse escurrir 5 segundos como mnimo entre ciclo y ciclo. Asegurarse de preparar correctamente las diluciones del Estndar siguiendo las instrucciones del folleto ilustrativo. Mezclar bien los reactivos dndoles la vuelta a los tubos o agitndolos con cuidado antes de dispensarlos en la placa. Las muestras y los estndares deben pipetearse de forma fluida, sin interrupciones. Todos los reactivos deben estar preparados antes de dar comienzo al ensayo.

Placa mal lavada.

Error al diluir el estndar. Se ha mezclado poco. Se pipetea mal o ha habido una interrupcin durante la preparacin del anlisis.

INFORMACIN TCNICA Resultados indeterminados Pueden deberse al estado inmunolgico del individuo o a varios factores tcnicos: Pasan ms de 16 horas desde que se haya extrado la muestra de sangre hasta que se incuba a 37C. Almacenamiento de sangre a una temperatura fuera del margen tolerado (entre 17C y 27C) Los tubos de recogida de sangre no se han mezclado lo suficiente

Presencia de cogulos de fibrina en muestras de plasma

Causas posibles Almacenamiento prolongado de muestras de plasma antes de ejecutar el ELISA Solucin Centrifugar muestras para sedimentar el material coagulado para que se pueda pipetear el plasma.

Si existen indicios de que se hayan producido fallos o errores tcnicos durante la recogida o preparacin de las muestras de sangre, habr que repetir todo el ensayo QuantiFERON -CMV con otras muestras. Si se teme que el procedimiento no haya sido ejecutado correctamente con plasmas estimulados, se puede realizar de nuevo el ensayo ELISA. A menos que se haya producido un error en el ensayo ELISA, no es de esperar que un resultado indeterminado a causa de un bajo valor de mitgeno cambie al repetir el anlisis. Resolucin de problemas relativos a ELISA Valores bajos de densidad ptica de Estndares
Causas posibles Error al diluir el estndar. Error al pipetear. Temperatura de incubacin demasiado baja. Incubacin demasiado breve. Filtro de lectura de placas incorrecto. Los reactivos estn demasiado fros. Solucin Asegurarse de preparar correctamente las diluciones del Estndar del kit, siguiendo las instrucciones del folleto ilustrativo. Asegurarse de que las pipetas estn calibradas y de utilizarlas en conformidad con las instrucciones del fabricante. La incubacin del ELISA deber realizarse a temperatura ambiente, de 17C a 27C. La incubacin de la placa del conjugado, estndares y muestras debe durar 120 5 minutos. La solucin enzimtica de sustrato debe incubarse en la placa durante 30 minutos. La placa debe leerse a 450 nm con un filtro de referencia de entre 620 y 650 nm. Todos los reactivos, a excepcin del concentrado 100X del conjugado, debern estar a temperatura ambiente antes de comenzar con el ensayo. Esto tarda aproximadamente una hora. Poner cuidado en utilizar el equipo antes de la fecha de caducidad. Asegurarse de utilizar el Estndar y el concentrado 100X de conjugado en los tres meses siguientes a la fecha de reconstitucin.

BIBLIOGRAFA Transplantes: 1. Walker S, Fazou C, Crough T, Holdsworth R, Kiely P, Veale M, Bell S, Gailbraith A, McNeil K, Jones S, Khanna R. Ex vivo monitoring of human cytomegalovirus-specific CD8+ T-cell responses using QuantiFERON-CMV. Transpl Infect Dis 9, 165-170 (2007). 2. Westall GP, Mifsud N, Kotsimbos T. Linking CMV serostatus to episodes of CMV reactivation following lung transplantation by measuring CMV-specific CD8+ T cell immunity. Am J Transplant 8, 1749-1754 (2008). 3. Kumar D, Chernenko S, Preiksaitis J, Moussa G, Cobos I, Manuel O, Fenton J, Venkataraman S, Humar A. Clinical Utility of Cytomegalovirus Cell-mediated Immunity testing for Predicting CMV disease in High-risk Solid Organ Transplant Recipients (submitted September 2008). 4. Danziger-Isakov L, Heeger PS. Clinical utility of measuring T-cell immunity to CMV in transplant recipients. Am J Transplant 9, 987-8 (2009). VIH/SIDA: 5.Singh KP, Howard JL, Wild SP, Jones SL, Hoy J, Lewin SR. Human cytomegalovirus (HCMV)-specific CD8+ T-cell responses are reduced in HIV-infected individuals with a history of HCMV disease despite CD4+ T-cell recovery. Clin Immunol 124, 200-206 (2007). ASISTENCIA TCNICA Si se necesita asistencia tcnica, contactar a: Cellestis International Pty Ltd: Tel.: +61 3 8527 3500 Fax: +61 3 9568 6623 E-mail: quantiferon@cellestis.com Cellestis GmbH: (Europa) Tel.: Fax: E-mail: 0049 6151 428 59 - 0 0049 6151 428 59 - 110 europe@cellestis.com

El kit/componentes estn caducados.

Coloracin indeterminada /elevado ruido de fondo

Causas posibles Solucin Lavar la placa al menos 6 veces con 400l/pocillo de tampn de lavado. Puede que sean necesarios ms de 6 ciclos de lavado dependiendo del lavador en uso. Deber dejarse escurrir 5 segundos como mnimo entre ciclo y ciclo. Pipetetear y mezclar con cuidado para reducir los riesgos al mnimo. La incubacin del ELISA deber realizarse a temperatura ambiente, de 17C a 27C.

Placa mal lavada.

Contaminacin cruzada entre los pocillos de ELISA. Temperatura de incubacin demasiado elevada.

Pgina web: www.cellestis.com

RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO Estadio 1: Incubacin de la sangre

1. Recoger sangre del paciente en los tubos de recogida de sangre y AGITAR fuertemente durante 5 segundos (10x).

Estadio 2: ELISA de IFN-

1. Equilibrar los componentes de ELISA, excepto el concentrado 100X del conjugado, a temperatura ambiente al menos durante 60 minutos. 2. Reconstituir el Estndar del kit con 1,5 l de agua destilada o desionizada. Preparar estndares. 3. Reconstituir el concentrado 100X de conjugado liofilizado con agua desionizada o destilada. 4. Preparar conjugado con Diluyente Verde y pipetear 50L en todos los pocillos.

2. Incubar los tubos de pie a 37C durante 16 y 24 horas.

3. Despus de incubar, centrifugar los tubos durante 15 minutos a 2000 - 3000g FCR (g) para separar el plasma de los glbulos rojos.

4. Despus del centrifugado, extraer las muestras de plasma de cada tubo para cuantificar el IFN-. (opcional)

5. Aadir 50 l de las muestras de plasma y 50 l de estndar a los pocillos correspondientes. Mezclar utilizando el agitador.

6. Incubar durante 120 minutos a temperatura ambiente.

7. Lavar al menos 6 veces con 400l/pocillo de tampn de lavado.

8. Aadir a los pocillos 100 l de solucin enzimtica de sustrato. Mezclar utilizando el agitador.

9. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

10. Aadir 50 l de solucin de paro a todos los pocillos. Mezclar utilizando el agitador.

Fabricado para:
Cellestis Limited (Australia) y Cellestis GmbH (Europa) Level 1, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Australia Tel: (Australia) +61 3 8527 3500, (Europa) +49 6151 428 59-0 E-mail: quantiferon@cellestis.com Pgina web: www.cellestis.com Doc No. ES-01925002D, Agosto 2010 11. Leer los resultados a 450nm con un filtro de referencia de entre 620 y 650nm.

12. Analizar los resultados.

EC

REP

MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Alemania