CRECIMIENTO BACTERIANO

I.

OBJETIVO.microorganismos.

determinar

el

tiempo

de

genercion

de

II.

FUNDAMENTO.-

bacterias, levaduras, hongos, algas y clulas animales o vegetales en cultivos cuyo metabolismo est orientado a la produccin de determinadas sustancias. As con la aplicacin integrada de los conocimientos y las tcnicas de la bioqumica, la microbiologa, la gentica y la ingeniera qumica surge la bioindustria capaz de producir, a partir de recursos renovables y disponibles en abundancia, gran cantidad de compuestos esenciales para la vida y para mejorar la condicin del hombre. Una parte importante de los productos de esta industria son obtenidos por tcnicas de fermentacin de microorganismos (mo) considerando a estos como aquellas formas de vida cuyos individuos son de una magnitud tal que es preciso el uso del microscopio para su observacin. Son de inters industrial bacterias, levaduras y hongos de cuyos cultivos pueden obtenerse cidos orgnicos, alcoholes, antibiticos , por citar algunos ejemplos, siendo en algunas ocasiones el producto su propia masa (biomasa) o algn extracto de la misma. Actualmente se trabaja en la obtencin de fertilizantes y plaguicidas a partir de mo que pueden sustituir gradualmente a los de origen qumico

constituyendo un aporte a la conservacin del medio ambiente, pues es conocido que estas sustancias van ocasionando lentamente el deterioro de los suelos con efectos igualmente nocivos en los alimentos. Hay tambin mo causantes de enfermedades (patgenos) que pueden ser inescrupolasamente utilizados como armas de guerra biolgica o con un fin ms noble en el control de vectores de enfermedades. Ante la diversidad de usos que se dan a los mo, es conveniente que el futuro ingeniero Industrial tenga una visin general de este tipo de producciones. ALGUNOS METODOS DE CONTEO DE BACTERIAS 1. METODOS EN OBSERVACION DE CONTEO 1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra. 2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede

provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). 3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente

fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables. 4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. 5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin. 6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto.

8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos). 9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios. 10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. - Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable (tcnicas biolgicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas.

2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos. A. Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente

alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 clulas por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin escalones. B. Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello,

se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en el medio. parmetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector. 3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos. A. Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. B. Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y noviables. Es muy rpido. C. Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. D. PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de

microorganismos con una cierta rapidez basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin.

E. Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. F. Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con
14 14

C en

CO2: el tiempo necesario para detectar el

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CO2 es inversamente

proporcional a la cantidad de microorganismos presente. G. Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos.

III. MATERIALES.-

TUBO DE ENSAYO PIPETAS ASA Y AGUJAS DE KOLLE MECHERO DE VIDRIO MATRAZ

MATERIAL BIOLOGICO

LEVADURA FRESCA AZUCAR AGUA DEZTILADA

IV.

PROCEDIMIENTOS 1ero.

En 0.1 de levadura agregamos 0.2 de azcar dependiendo de la cantidad siendo a evaluar.

agua deztilada

2do. Una vez tenida la solucin colocar unas dos gotas en el portador de colonias para ser contadas

CONCLUCIONES

El crecimiento bacteriano puede considerarse como el crecimiento de poblaciones de muchos millones de clulas cuyas caractersticas son esencialmente estadsticas, y el comportamiento de la clula individual es tomado como una frecuencia.

El crecimiento de las bacterias en cultivo puede determinarse midiendo experimentalmente el incremento de la materia celular (protoplasma) o del incremento del nmero de clulas.

Las posibilidades fisiolgicas de los microorganismos se relacionan inversamente con sus necesidades nutricionales, ya que, la sntesis de componentes celulares a partir de materia inorgnica o compuesto