M T O D O S R P I D O S E A U T O M A T I Z A D O S PARA E N U M E R A O DE M I C R O R G A N I S M O S INDICADORES EM LEITE - UTILIZAO NO BRASIL

LUS A U G U S T O N E R O VANERLI B E L O T I MRCIA DE AGUIAR F E R R E I R A B A R R O S

N E R O , L. A.; B E L O T I , V.; p. 115-126, mar. 2000.

BARROS,

M. A. F. M t o d o s rpidos e automatizados para e n u m e r a o de

m i c r o r g a n i s m o s i n d i c a d o r e s e m l e i t e - U t i l i z a o n o B r a s i l - Semina: C i . A g r r i a s . L o n d r i n a , v , 2 1 . n . 1 .

RESUMO: A enumerao de brasileira.

presente reviso descreve microrganismos indicadores em

os leite

principais e avalia

mtodos r p i d o s e sua adequao ou

automatizados utilizados para no na indstria lctea

PALAVRAS-CHAVE:

Leite,

microbiologia

lctea,

mtodos

rpidos.

INTRODUO A anlise microbiolgica de alimentos vem

deteriorao do alimento ou (Franco lctea, & Landgraf, de 1996). so grande

c o n t a m i n a o fecal Na microbiologia como importncia

sendo

ulilizada

h muito t e m p o como uma forma Esse controle de

indicadores, os microrganismos aerbios mesfilos ( M A M ) e o grupo dos coliformes. Microrganismos aerbios mesfilos so todos aqueles capazes de crescer em 35-37C que o em condies foi de temperatura de Esses Um aerobiose. ou

de c o n t r o l e e m o n i t o r a m e n t o da matria-prima e do p r o d u t o industrializado. extrema importncia, j q u e permite assegurar a qualidade do alimento, para que este no oferea riscos s a d e do c o n s u m i d o r , e tenha as suas caractersticas garantidas O assume controle fisico-quimicas micro biolgico ainda nmero de esto de de um surtos e organolpticas indstria cada vez lctea mais ao no consumo. na maior devido

microrganismos indicam a qualidade sanitria c o m alimento obtido processado. n m e r o elevado destes m i c r o r g a n i s m o s indica q u e o alimento que todas as alimentar so condies O insalubre, mesmo que patgenos origem alta estejam ausentes. No entanto, deve-se considerar bactrias patognicas de mesfilas. o e portanto, de uma

importncia

ocorrncia significativo que, com

toxinfecao alimentar associados 1996).

freqncia,

c o n t a g e m de mesfilos pode significar q u e houve para crescimento patgenos o principal qualidade (Franco & Landgraf, 1936). grupo dos coliformes para totais a indicador 1989; utilizado avaliar

c o n s u m o de leite e d e r i v a d o s ( C a m a r g o , veicular vrios agentes ser um

O leite, p o r ser um p r o d u t o de o r i g e m animal, pode potencialmente alimento m u i t o rico zoonlicos. a l m de crescimento

em s u a c o m p o s i o nutricional, o q u e favorece o microbiano. realizado atravs chamados O monitoramento microbiolgico em amostras de leite e o u t r o s a l i m e n t o s , da pesquisa de microrganismos

microbiolgica da gua e a l i m e n t o s (Covert et al., Matner et al.,1990). s e n d o a presena de indicativa de tratamento bactrias Enterobacter, m e m b r o s desse grupo, parte deste grupo, Citrobacter e

inadequado ou contaminao ps-desinfeo. Fazem predominantemente, Escherichia, pertencentes aos gneros Kiebsialla,

indicadores, que, q u a n d o presentes no alimento, podem fornecer informaes sobre as condies sanitrias durante o p r o c e s s a m e n t o , produo ou armazenamento, possvel presena de patgenos,
1

q u e t m a c a p a c i d a d e de

f e r m e n t a r a lactose p r o d u z i n d o c i d o e g s q u a n d o incubadas a 35-37 C (Franco & Landgraf, 1996).

Mdico Veterinrio, Programa de Mestrado em Sanidade Animal, D M V R C C A . UEL, Londrina. PR. Docente do Departamento de M e d i c i n a Veterinria Preventiva, U E L , L o n d r i n a , PR. Mdica Veterinria, responsvel pelo Laboratrio de Inspeo de P r e d u t o s de Origem Animal, CMVP, C C A . U E L , Londrina. PR.

Semina: C i . Agrrias, Londrina, v. 2 1 , n. 1, p. 115-126, mar. 2000

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A s bactrias p e r t e n c e n t e s a o grupo d o s c o l i f o r m e s fecais, correspondem aos a coliformes totais q u e lactose com

U

levado

ao

desenvolvimento

de

mtodos

alternativos na micro biologia de a l i m e n t o s . Vrias t c n i c a s para e n u m e r a r e i d e n t i f i c a r b a c t r i a s t m sido estudadas, de prticos pequena e e so atualmente Esses na de denominadas so mais requerem fornecem a mtodos rpidos, simples mais quantidade mtodos e

continuam

fermentando

produo C Nessas copas de esta

de g s q u a n d o so positivas,

incubados a 4 4 - 4 5 , 5 enquanto e A E. tem coli Klebsiella poucas

condies, cerca de 9 0 % d a s culturas de E. coli Enterobacter caracterstica. deste grupo q u e mantm

execuo, material

o nico microrganismo

resultados

rapidamente.

Geralmente

c o m o habitat natural o trato

praticidade j justifica a utilizao d e s s e s s i s t e m a s , c o m economia de tempo e material no laboratrio, permitindo a l g u n s deles ao dos aumentar o nmero de amostras analisadas e processadas por dia, m e s m o que em o tempo de i n c u b a a o s e j a similar (Vasavada e t al., mtodos convencionais

intestinal de h o m e n s o a n i m a i s de s a n g u e quente, s e n d o um s e g u r o indicador de contaminao fecal. Os demais podem 1996). Ma indstria lctea, a c o n t a g e m de coliformes utilizada c o m o indicativo de higiene na produo do leite ou da c o n t a m i n a o ps-pasteurizao m i c r o b i o l g i c a s tradicionais qualidade a partir do em fina! alimentos do sculo para foram XIX e ( S e n i k et al., 1 9 8 7 ) As anlises o controle de desenvolvidas vm sendo 1987). sendo o A base microrganismos presentes do grupo coliformes, em outros estar tambm

a m b i e n t e s , c o m o v e g e t a i s e solo (Franco & Landgraf.

1 9 9 3 ) . Um teste rpido ideal possuiria as s e g u i n t e s caractersticas: rapidez, e c o n o m i a e confiabilidade (Bigalke, 1984). Durante mais de duas dcadas os o mtodos objetivo et al. da

rpidos tm sido desenvolvidos microbiolgica 1 993). e derivados a de alimentos

com

de substituir metodologia tradicional

na anlise

(Vasavada

P a r t i c u l a r m e n t e na m i c r o b i o l o g i a de leite dificuldade avaliao

utilizadas d e s d e da plaqueamento et

ento

( S e n y k e t al., continua e a

m i c r o biologia lctea

q u a l i d a d e do leite a t e m p o de se t o m a r m e d i d a s corretivas efetivas, tem a p r e s s a d o a implantao dos mtodos rpidos em como o plaqueamento c o m em espiral, citometria filtrao de membrana de grade

convencional

caracterizao bioqumica dos microrganismos de interesse (Vasavada enumerao de al., 1 9 9 3 ) , a s s i m c o m o a totais e fecais pelo coliformes

hidrofbica (HGMF), microscopia de fluorescncia, fluxo, tcnicas impedncia e condutncia e v r i o s "kits" p a r a a c a r a c t e r i z a o Outros mtodos, como os

mtodo d e f e r m e n t a o e m tubos mltiplos (Gale & Broberg, 1993). Os mtodos tradicionais apresentam desvantagens na e n u m e r a o de microrganismos indicadores, p o d e n d o - s e citar o trabalho excessivo em laboratrio, o uso de grande quantidade de a necessidade da placas. de Deve-se falhas na vidrarias e espao tcnica, m e i o s de cultura, incubao a das

bioqumica e contagem de m i c r o r g a n i s m o s (Bishop & Juan, 1988). bioluminescentes, i m u n o e n z i m t i c o s e c o m cidos nuclicos para deteco de p a t g e n o s especficos e toxinas, t a m b m tm et a l . , 1 9 9 3 ) . A maioria d o s mtodos rpidos, d e s e n v o l v i d o s para deteco do no de coliformes, definido, cultura de de so emprega envolvendo a a tecnologia incluso substrato meio para Estes aumentado sua aceitao para uso na microbiologia de alimentos (Vasavada

realizao de a n l i s e s em duplicata e de grande para como considerar ainda possibilidade

a alta t e m p e r a t u r a do gar fundido riscos de contaminaes

utilizado no m t o d o tradicional de semeadura por profundidade e maiores semeadura devido ao g r a n d e n m e r o de etapas no preparo e da a m o s t r a (Chain & Fung, 1991),

substratos dos a ligados

especficos coliformes.

enzimas

constitutivas

substratos

Apesar disso, a c o n t a g e m de colnias de M A M em leite c r u e p a s t e u r i z a d o , b e m c o m o a tcnica de tubos mltiplos para e n u m e r a o de coliformes, so aceitas corno b o n s de trabalhosas, as indicativos de so qualidade e os microbiolgica ( 0 ' C c n n o r , 1984). No entanto, a l m tcnicas lentas r e s u l t a d o s s s o c o n h e c i d o s 2 a 7 d i a s a p s o inicio das anlises, e para alguns produtos, como o leite, no o tempo para a c o m o b t e n o de r e s u l t a d o s a sua perecibilidade compatvel

compostos indicadores de sua utilizao. Assim, q u a n d o o microrganismo est presente, enzima ou c a p a z de clivar o substrato Alm na e produz a liberar o para da

i n d i c a d o r que q u a n d o livre, a l t e r a a s u a c o l o r a o produz a fluorescncia. especificidade disso, melhorar indicao

contaminao fecal, os m t o d o s rpidos detectam e s p e c i f i c a m e n t e a E. coli e n o c o l i f o r m e s f e c a i s . V a s a v a d a e t al. ( 1 9 9 3 ) p r e v i a m q u e a s s i m q u e os mtodos rpidos muito bem fossem bem na reconhecidos, microbiologia seriam utilizados

( V a s a v a d a et al., 1 9 9 3 ) . As limitaes da m e t o d o l o g i a tradicional t m

lctea, em substituio aos m t o d o s tradicionais

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Semina: Ci. Agrrias, Londrina, v. 2 1 , n . 1, p. 115-126, mar. 2000

d e c o n t a g e m e m placas, estimativa d e N m e r o M a i s Provvel e testes empricos c o m o a reduo do azul de m e t i l e n o e da resazurina. No entanto, na e s c o l h a de um m t o d o rpido, alguns cuidados d e v e m ser c o n s i d e r a d o s , c o m o a importncia de c o n h e c e r - s e o principio ativo de c a d a mtodo, a micrbio La do alimento analisado e os fatores que influenciam s u a c o m p o s i o , urna v e z que, estes m t o d o s f o r a m d e s e n v o l v i d o s t o m a n d o - s e por b a s e u m a microbiota tpica d e p a s e s nos quais, a s condies d e p r o d u o , c o n s e r v a o e m e s m o climticas, diferem, em muito, das e n c o n t r a d a s no Brasil. 1.1 Microbiota do leite

Essas

contagens

so

maiores A sua

em

leite

acondicionado em lates do q u e q u a n d o mantidos sob refrigerao em lates mais tanques. e higienizao de refrigerao dificultada

m e n o s eficiente. Os corineformes encontrados no leite, t a m b m p o d e m ter c o m o o r i g e m a g u a . a s s i m como os microrganismos Gram negativos como Pseudomonas sp, coliformes e outros cocobacilos. m o d o geral, presena no alta carga & Gram portanto sua ou

As bactrias Gram negativas, de no so termodricas, pasteurizao microbiana McKinnon, negativas, na

leite p a s t e u r i z a d o p o d e s i g n i f i c a r r e c o n t a m i n a o , inadequada Muitas de das matria-prima no (Brarnley

1990). apesar

bactrias

sobreviverem

A m i c r o b i o t a do leite c r u b a s t a n t e v a r i v e l e depende animais, de diversos fatores e relacionados meio aos manipuladores ambiente,

pasteurizao,

produzem enzimas

proteolticas

t e r m o e s t v e i s . que a l m d e interferir n o p r o c e s s o d e c o a g u l a o d o leite, p r o d u z e m m e t a b l i i o s q u e conferem sabor e odor desagradaveis ao produto.

incluindo o s e q u i p a m e n t o s utilizados n a o r d e n h a . E m leites c o m c o n t a g e n s d e M A M abaixo d e 5.000 U F C / m L , a mnima contaminao do produto pelo exterior do no bere, e pelos equipamentos resulta de microrganismos no predomnio

1.2 O l e i t e p r o d u z i d o n o B r a s i l O M i n i s t r i o da A g r i c u l t u r a e R e f o r m a Agrria do Brasil (Brasil. M A R A , 1 9 9 7 ) d e t e r m i n a p a r a o leite pasteurizado os limites de 500 U F C / m L de MAM M A M para o leite tipo A , 4 0 . 0 0 0 U F C / m L d e M A M p a r a o leite tipo B e 1 5 0 . 0 0 0 U F C / m L de p a r a o leite tipos C, Integral, em a n l i s e s d e rotina estabelecidos. varias pesquisas sobre a qualidade Em so Light e D e s n a t a d o . aos

termodricos da Famlia Micrococaceae do interior do pele do teto. Os grupos predominantes bere e da microbiota

(incluindo normal da

estafilococos), e estreptococos, que so bactrias

comumente

so:

micrococos no termodricos e estafilococos (30 a 9 9 % ) . e s t r e p t o c o c o s (0 a 5 0 % ) , c o r i n e f o r m e s (<10%), (<10%) Quando bacilos esporulados incluindo aqui as contagens de (<10%) e outros os bolores e l e v e d u r a s . microrganismos Gram negativos, 1990) relatada e ou

No entanto, conhecido q u e as contagens obtidas muito superiores limites

m i c r o b i o l g i c a d o leite p a s t e u r i z a d o , p r o d u z i d o e m diversas regies do Brasil, os autores encontraram e n t r e 6 & e 7 0 % de a m o s t r a s fora do p a d r o ( N a d e r

:

aumentam, h um incremento na porcentagem de termodricos, inclusive cocobacilos em no coliformes, detrimento d o s outros

et al., 1 9 3 8 ; Beloti et al., 1 9 9 7 ) . O u t r o a g r a v a n t e que as normas do MARA para o controle de q u a l i d a d e d o leite c r u , d e t e r m i n a m q u e s e realize a c o n t a g e m de M A M a p e n a s para os leites tipos A e B, P a r a o leite tipo C, q u e c o r r e s p o n d e a 9 2 % da produo nacional, n o se exige esse controle na matria-prima. A contagem de coliformes t a m b m n o precisa ser realizada (Brasil. M A R A ,

micrococceos (Brarnley & McKinnon, Grande variao e psicrotrficos no atribuda associada dos leite c r u t e m sido e

nmero de termodricos sazonais,

diferenas regionais, a m t o d o s de limpeza nas diferentes do gnero 1990).

desinfeco propriedades

equipamentos Algumas

(Thornan; & T h o m a s , espcies Microbacteruim grupo

Micrococcus e

1997). Baseado nessas informaes, possvel concluir que provavelmente a p e n a s u m a pequena p o r c e n t a g e m da indstria lctea brasileira controla c o l i f o r m e s o u m e s m o o t o t a l d e b a c t r i a s e m leite cru (Brasil, M A R A , 1997). Como resultado, o leite brasileiro apresenta pode se alta uma considervel carga contagens elevadas, Os microbiana, e apresentando

sp (cocobacilo Gram positivo do so termodricos, oriundos

corineforme)

quase q u e exclusivamente dos equipamentos de o r d e n h a . S u a m u l t i p l i c a o n o leite m u i t o p o b r e , portanto, contaminante na quando e alta foi a contagem significa que a destes carga microrganismos higienizao O tipo pode

grande,

indicando deficincias

sanitizao de e q u i p a m e n t o s

e s p e r a r q u e sua microbiota seja tpica d e leite c o m porcentagem de termodricos e cocobacilos Gram negativos. microrganismos termodricos

(Brarnley & McKinnon, 1990). de a c o n d i c i o n a m e n t o do leite t a m b m na contagem de termodricos. interferir

Semina: C i , Agrrias. Londrina, v. 2 1 . n. 1, p. 115-126. mar. 2000.

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formaro u m a indesejvel microbiota remanescente no leite pasteurizado, que ter diminudo o seu leite pasteurizado, t e m p o d e v i d a d e prateleira. D e fato, Belott ( 2 0 0 0 ) estudando a microbiota do e n c o n t r o u 52% d e c o c o b a c i l o s G r a m p o s i t i v o s , 2 3 % de cocos G r a m positivos e 1 7 , 1 % de cocobacilos Gram negativos, boas prticas na alm entre outros, produo do de e concluiu que a leite, bem como Como leite formada para c o m p o s i o d e s s a microbiota. indica carncia de recontaminao agravante, pasteurizado. ps-pasteurizao. inadequada microbiota essa

o indicador cloreto de trifeniltetrazlio (TTC), q u e quando reduzido pelas colnias em crescimento, c o n f e r e a e l a s a c o l o r a o v e r m e l h a . A leitura da placa de Petrifilm
r M

AC

inoculada
u

pode

ser

realizada aps incubao a 3 5

C por 48h.

G i n n e t al. ( 1 9 8 4 ) r e l a t a r a m q u e o P e t r i f i l m AC revela, de f o r m a geral, contagens menores de MAM em leite cru de quando pelos comparado para A metodologia padro explicao contagem em placas. autores

fornecida

osso

a n o r m a l i d a d e a p o s s i b i l i d a d e do T T C funcionar c o m o inibidor d e c r e s c i m e n t o d e a l g u m a s e s p c i e s de microrganismos. A p e s a r dessa constatao, os autores consideraram como um o sistema Petrifilm
M

p r e d o m i n a n t e m e n t e por c o c o s e cocobacilos Grarn positivos, p r e j u d i c a o d e s e m p e n h o d e m t o d o s r p i d o s para c o n t a g e m d e M A M .

AC para

apropriado na

mtodo

alternativo

c o n t a g e m d e m i c r o r g a n i s m o s viveis e m leite cru rotina laboratorial. Em estudo c o l a b o r a t i v o realizado por a. (1986), foi pesquisada a Ginn et do

MTODOS RPIDOS

PARA

ENUMERAO

DE MICRORGANISMOS EM AUMENTOS 2.1 P e t r i f i l m ( 3 M C o m p a n y , S t . P a u l , E U A ) , O base, sistema Petrifilm duplo: um composto filme que por um serve de e

utilizao

Petrifilm A C para e n u m e r a o d e M A M e m leites cru e pasteurizado h o m o g e n e i z a d o . Os resultados permitiram Petrifilm alternativa sistema de filme aos AC autores pode ser conclurem utilizado que o como uma

m e t o d o l o g i a padro. ( 1 9 8 7 ) realizaram um e s t u d o
r

recoberto c o m

nutrientes

desidratados

M c A I l i s l e r e t al. comparando o

a g e n t e s g e l e i f i c a n t e s solveis frio, e um f i l m e superior, de polietileno, que c o n t m um indicador de cor e a g e n t e s geleificantes (Vasavada, 1993). A amostra, superfcie amostra conjunto diluda do filme ou no, e inoculada na base em na o filme superior

Petrifilm "

AC

com

mtodo

padro para e n u m e r a o de M A M em derivados d e leite. O s a u t o r e s significantes entre desnatados influencia o para as no encontraram diferenas produtos desnatados contagens do em e no os AC. os da de ambos

sobreposto. C o m o auxilio de um difusor plstico, a espalhada incubado uma rea determinada. geleificante, incubao, o as temperatura Aps a e tempo Aps solidificao da substancia

m t o d o s , o q u e i n d i c a q u e a gordura do leite n o desempenho Petrifilm Considerando todas as amostras analisadas, o mtodo padro, indicando a AC para viabilidade derivados

autores e n c o n t r a r a m u m a correlao de 0,98 c o m utilizao do leite. Petrifilm

indicados pelo fabricante. expresso em O sistema UFC/mL. Petrifilm,

colnias visveis s o e n u m e r a d a s e o resultado

particularmente, como alternativo

tem ao

Em outro estudo colaborativo realizado por 11 laboratrios, (Curiale & Fahey, 1989) o Petrifilm A C foi avaliado p a r a a e n u m e r a o d e M A M e m derivados de leite leite os (achocolatado, em p queijo leite que o pasteurizado, os resultados, desnatado, concluram

recebido, g r a n d e mtodo

aceitao

padro de semeadura

por profundidade

de c o n t a g e m em placas na analise microbiolgica de a l i m e n t o s ( B e a u c h a t et al., 1998). As p l a c a s Petrifilm para a contagem de MAM e de coliformes em leite e d e r i v a d o s so r e c o n h e c i d a s pela A s s o c i a t i o n of Official Analytical C h e m i s t s e Standard Methods for Examination of Dairy Products (Curiale &. Fahey. 1989). Vrias v e r s e s do Petrifilm esto disponveis no mercado: para contagem de aerbios mesfilos (AC), coliformes coli (YM). (CC, HSCC), (RSA) coliformes e e bolores e Escherichia Sataphylococcus leveduras (EC), enterobactrias (EB), aureus

evaporado e sorvete de creme). autores Petrifilm Uma

De acordo c o m

teve u m d e s e m p e n h o to b o m q u a n t o avaliao do em Petrifilm AC para

metodologia padro. contagem de M A M p a d r o (Piton leite cru foi realizada p o r 1 991). Os r e s u l t a d o s

14 laboratrios, c o m p a r a n d o - o com a metodologia & Grappin, indicaram boas repetibilidade e reprodutibilidade do sistema Petrifilm A C . Chain & F u n g ( 1 9 9 1 ) avaliaram a eficincia do Petrifilm AC para c o n t a g e m d e M A M e m leite cru, c o m p a r a n d o - o c o m a metodologia tradicional

O Petrifilm AC possui os m e s m o s nutrientes encontrados no gar padro de contagem {PCA) e

113

Semina; Ci. Agrrias, Londrina, v. 2 1 , n. 1, p. 115-126, mar. 2000

e m placas e c o m o u t r o s s i s t e m a s ( R e d i g e l , Spiral Plate

I M

rpido e de baixo custe, quando c o m p a r a d o c o m o mtodo padro de contagem em placas que utiliza o VRB, a tcnica de tubos mltiplos, utilizando

, Isogrid} e encontraram urna correlao os autores a descreveram facilidade na o pouco espao

d e 0.99 e m t o d a s a s c o m p a r a e s . A l m d a alta correlao encontrada, praticidade visualizao e que de c o m o vantagens para o uso do semeadura. de contagem a Petrifilm AC a

N e l s o n e t al. ( 1 9 3 4 ) c o m p a r a r a m o P e t r i f i l m EC c o m os c a l d o s Lauril Sulfato e o L a c t o s a d o Bile V e r d e Brilhante, e o plaqueamento convencional em V R B para e n u m e r a o de coliformes em leite cru Petrifilm na tcnica Os autores relataram uma correlao de 0,93 entre o EC e o V R B e 0 , 9 0 e n t r e o P e t r i f i l m dos tubos mltiplos com ambos os EC e o m t o d o de N m e r o Mais Provvel ( N M P ) caldos utilizados. N M P em tubos leite.

colnias e de 1 0 % do

espao requisitado para e s t o c a g e m e incubao, corresponde cerca foi a requisitado pela metodologia tradicional. A nica n e c e s s i d a d e de muito plstico do sistema,

desvantagem citada amostra com o

cuidado na semeadura, no m o m e n t o de espalhara difusor m o m e n t o e m q u e . s e g u n d o o s a u t o r e s , p o d e ocorrer uma perda parcial da amostra. Senik et al. (1987) os indicaram uma falta de no

C u r i a l e et al. ( 1 9 9 1 ) a v a l i a r a m o P e t r i f i l m ' " EC comparando-o com o mtodo de c o m o objetivo de enumerar coliformes em Nessa E. coli, Enterobacter que uma EC foram aerogenes e

equivalncia de MAM em

entre leite

resultados

obtidos

p e s q u i s a foram utilizadas c e p a s p u r a s d e Kiebsiella em leite o de

r M

Petrifilm AC e no m t o d o p a d r o de contagem pasteurizado, da provavelmente lctea das devido constituio microbiota

pneumoniae, relataram Petrifilm

inoculadas Os de 0.913

esterilizado

laboratorialmente. correlao e o mtodo

autores entre alm

amostras analisadas, resultando em contagens de M A M mais baixas no Petrifilm A C . Ainda (1999b) marcante em leite pasteurizado, que o prejudicado leite Beloti et al. do verificaram AC de do desempenho pela termodricos baixa

padro

c o n s t a t a r e m alta repetibilidade e reprodutibilidade. Beloti (2000) avaliou a eficincia do P e t r i f i l m EC em leite pasteurizado comparando-o de com mtodo placas, (VRB), padro de contagem coliformes 0,802. o

Petrifilm microbiota

presena na Esses

microrganismos apresentam colnias

em Bile Os de

brasileiro.

q u e utiliza o g a r V e r m e l h o V i o l e t a obtendo uma indicaram em 42,5% EC, deve a correlao de uma das amostras coincidncia

microrganismos no produzem Para a

capacidade no sendo as placas

redutora do T T C ou no o r e d u z e m , e dessa forma, vermelhas, coliformes. possuem os identificados Petrifilm' pelo mtodo. CC e HSCC nutrientes

resultados resultados Entretanto, no correlao

analisadas. maiores a baixa

4 1 , 4 % dos resultados foram indicando uma que se

c o n t a g e m de

Petrifilm

maior sensibilidade

e n c o n t r a d o s n o g a r v e r m e l h o v i o l e t a bile ( V R B ) , T T C e agentes seletivos. Os coliformes crescem e reduzem o TTC, de que assumindo fermentar aparece a a coli, colorao lactose e s

deste sistema.

2.2

SimPlate

(BioControl

Systems,

Inc.,

vermelha, produzirem

alm gs,

Bellevue, W A , EUA) O sistema IDEXX objetivo Lab. de SimPlate

l M

associado

c o l n i a s . P a r a i d e n t i f i c a o de E. presentes no CC e

a p l a c a de

foi

desenvolvido MA, EUA.

pela o e

Petrifilm' E C , a l m d o s c o m p o n e n t e s j citados H S C C , contm o 5-bromo-4coli. e C e r c a de libera o eloro-3-indolil-b-D-glucuronideo ( B C I D ) , q u e indica a a t i v i d a d e g l u c u r o n i d s i c a da E. 9 7 % das c e p a s de glucuronidase, indicador associada que a que torna bolhas E. a de coli cliva o produzem a enzima BClO azul, sempre pela

Inc., W e s t b r o o k , oferecer um

com

diagnstico

rpido

pratico na deteco de diversos microrganismos presentes em alimentos, fornecendo resultados em Nmero Mais Provvel de 84 (NMP) A baseado uma amostra de a na ser e a positividade especialmente analisada cavidades de ao meio placa

colnia gs

desenvolvida.

produzidas

adicionada

cultura

fermentao da lactose. N o r m a l m e n t e , as placas para contagem de coliformes so 24h a 35 C, p o r m adicionais para coli. Estudos realizados uma por Matner alm e t al. (1990) e incubadas por E. p o d e m ser necessrias 24h

m i s t u r a transferida para a placa de S i m P l a t e . A p s a r e t i r a d a do e x c e s s o de liquido, a p l a c a invertida e incubada a 3 5 C por 2 4 h . microrganismos viveis nmero de cavidades c o m resultado O t o t a l de pelo que positivo determinado

identificao d a s colnias de

c o r r e s p o n d e a u m valor d e N M P d e U F C , c o n f o r m e u m a t a b e l a de equivalncia fornecida pelo fabricante. A primeira formulao do meio de cultura

demonstraram

maior

sensibilidade

simplicidade do Petrifilm EC,

de ser mais

Semina: Ci. A g r r i a s , Londrina, v. 2 1 . n. 1, p- 115-126. mar. 2000

119

utilizado para d e t e r m i n a r c o n t a g e m total d e M A M no sistema SirnPlate se b a s e a v a na Tecnologia de Mltiplas E n z i m a s ( T o w n s e n d & Naqui. 1998). O meio de cultura utilizado para os pelos referidos exposta era composto enzimas, por que que que vrios substratos quando liberavam fluoresce se como metabolizavam mltiplas

do S i r n P l a t e T P C Cl. Portanto, qualquer alterao da cor positivo. Uma (Smith mtodo Petriftlm uma 0,97 com o & avaliao do SirnPlate de MAM em de alimentos contagem do Townsend, padro TPC foi em Cl para contagem realizada placas, TPC Cl e do do original (azul) considerada resultado

produzidas

microrganismos substratos substncia luz

1999} c o m p a r a n d o - o c o m o

4-metil-umbeliferona. quando

e R e d i g e . Os resultados revelaram d e 0,94 SirnPlate

ultravioleta aquelas que

correlao com o

( 3 6 5 n m ) ( B e a u c h a t et al., cavidades
c

1998).

Consideravam-

m t o d o p a d r o , 0,92 c o m o P e t r i f i l m Redigel. como oficial a o leitura em 24h

positivas, C. Plate

Em todas as ocasies, foi

a p r e s e n t a s s e m f l u o r e s c n c i a luz. ultravioleta a p s 2 4 h do incubao a 3 5 O SimPlate

considerada Nero

Sim P l a t e T P C Cl. Color ( T P C ) foi (2000) avaliou desempenho MAM em alimentos Petrifilm Tambm e foi da a de SimPlate T P C C l para e n u m e r a o d e M A M e m

Total

a v a l i a d o para e n u m e r a o de padro de contagem em todas as em

( B e a u c h a t et al., 1 9 9 8 ) , e c o m p a r a d o c o m o m t o d o placas, (0.97). a R e d i g e l . O s autores e n c o n t r a r a m alta correlao comparaes vantagem descrita de como A da ausncia

142 a m o s t r a s d e leite p a s t e u r i z a d o , c o m p a r a n d o o c o m o m t o d o padro de contagem em placas, utilizando g a r Padro para C o n t a g e m e m p l a c a s (PCA). entre os Os resultados revelaram uma de 0,68 e correlao de 0,76, leitura mtodos varincia

n e c e s s i d a d e de cultura.

preparo e esterilizao do meio desvantagem e n c o n t r a d a foi do nmero

q u a n d o a l e i t u r a foi r e a l i z a d a em 48h

em 24h, c o n f o r m e para e a varincia. de que melhora a do

o r i e n t a o do fabricante. No entanto, a c o r r e l a o foi d e 0 , 9 1 melhora do leite medida

i m p o s s i b i l i d a d e de se o b t e r c o l n i a s isoladas e a impreciso determinao microrganismos presentes no alimento, j que u m a tcnica que s e baseia e m N m e n o M a i s Provvel. Beloti (2000) TPC avaliando para o desempenho MAM do em

0,084. A m e s m a p e s q u i s a r e v e l o u q u e a c o r r e l a o observada qualidade analisado, independente

tempo de incubao do SimPlate T P C Cl. Sendo um meio d e cultura que presena de no depende

SirnPlate de

enumerao de a

leite pasteurizado e n c o n t r o u v a r i a o no nmero cavidades fluorescentes q u a n d o (12 a 15 c m ) , leitura s e realizava nos extremos da distncia preconizada pelo fabricante provocando uma g r a n d e m a r g e m d e d v i d a n a l e i t u r a das placas. A l m d i s s o , Foi e n c o n t r a d a u m a b a i x a c o r r e l a o {0,71) entre o s i s t e m a e a m e t o d o l o g i a tradicional de contagem de aerbios (PCA), devido a alta que microrganismos no mesfilos e m placas no leite de os freqncia

da utilizao de substratos enzimticos e s p e c f i c o s para indicar a bactrias, o T P C Cl p o d e s e r utilizado s e m sofrer n e n h u m a interferncia de possveis enzimas naturalmente presentes n o s alimentos (Smith & Townsend, da r e d u t a s e porm qualidade Nesse do leite q u e rpido, 1999). na p r o v a indireto, da do mtodo em A r e s a z u r i n a um indicador utilizado um para bastante

determinao funo

bacteriolgica

d o leite

metabolizavam

metabolismo

redutor de diversos microrganismos.

substratos disponveis no meio de cultura e, dessa forma, no emitiam fluorescncia, cavidades O falso-negativas. T P C Color no Indicator mercada (Cl) para resultando em

t e s t e , o tempo de reduo do c o r a n t e

i n v e r s a m e n t e proporcional quantidade d e b a c t r i a s p r e s e n t e s n o leite, sendo portanto a p e n a s u m a p r o v a estimativa, no determinando a quantidade reduo pela muitos anos resazurina pela tem exata sido d e m i c r o r g a n i s m o s presentes n o leite. O teste de utilizado como um ser por indstria lctea

SirnPlate

recentemente

lanado

e n u m e r a o d e M A M utiliza u m p r i n c p i o diferente, no qual o meio de cultura T P C c o n t m a substncia indicadora resazurina, de c o l o r a o azul escura q u a n d o est na forma no reduzida oxi-reduo. resultando resazurina na causando mudana O crescimento do meio e A

indicador da qualidade higinica do leite correlacionados no al., c o m a

cru. Entretanto, n o produz resultados q u e p o s s a m confiavelmente bacteriana contagem em leite, s e n d o e x p l c i t a a devem 1977). no se de nmero et bactria no

bactria n o provoca u m a a l t e r a o d o potencial d e reduo da cor a do indicador,

r e c o m e n d a o de que os resultados ser d i v u l g a d o s em termos O SimPlate TPC em n e n h u m a circunstncia (Holley Cl,

reduzida a s s u m e

colorao rosa, varia so as entre o

d e v i d o f o r m a o de r e s o r u f i n a , q u e por sua v e z pode formar dhidroresorufina incolor e o amarelado; que essas cores

entretanto,

baseia no t e m p o de reduo da resazurina, c o m o ocorre na p r o v a da redutase, e sim na q u a n t i d a d e

o b s e r v a d a s n a s c a v i d a d e s c o m r e s u l t a d o positivo

120

Semina: C i . A g r r i a s , Londrina, v. 21 . n. 1. p. 115-126. mar. 2000

de cavidades que apresentam reduo do indicador devido ao crescimento existem Bacillus bacreriano em 24h, que de devem que ser c o r r e s p o n d e a um valor em N M P de U F C / m L . Ainda agalactiao, Fatores o subtilis, considerados, como fato Streptococcus

T o w n s e n d et al., ( 1 9 9 3 ) a v a l i a r a m o S i m P l a t e CEc para e n u m e r a o de coliformes e E. coli em alimentos, comparando-o com o Petrifilm EC, tcnica de N M P no sistema de t u b o s apresentou e a correlao de boa quando mltiplos e comparado Resultados

plaqueamento em V R B + M U G . O SimPlate CEc c o m o s o u t r o s m t o d o s (rv-: 0 , 9 0 ) p a r a a d e t e c o quantificao coli colilormes. semelhantes foram encontrados para e n u m e r a o de E. (r > 0 . 8 6 ) , i n d i c a n d o a e q u i v a l n c i a do CEc aos outros mtodos avaliados C E c para em 145 SimPlate

microrganismos

psiccfilos e t e r m o d r i c o s s e r e m d o t a d o s de m e n o r atividade redutora. Os microrganismos produtores de c i d o ltico r e d u z e m c o m m a i o r rapidez Pseudomonas sp, que os no produtores. negativas como sp
:

Bactrias psicrotrficas G r a m s p , Achromobacter sp r e d u z e m da Flavobactorium de reduo

Alcaligenes A

p a r a e n u m e r a o d e c o l i f o r m e s e E . coli. Beloti ( 2 0 0 0 ) a v a l i o u o SimPlate e coli tubos enumerao a tcnica de coliformes

lentamente a habilidade a resazurina

resazurina. depende em et al., microrganismos transferir 1997). A

velocidade dos

amostras d e leite p a s t e u r i z a d o c o m p a r a n d o - o c o m de f e r m e n t a o em o CLBVB. Os mltiplos indicaram utilizando resultados

eltrons p r e s e n t e s no meio para o oxignio, e p a r a (Venkitanarayanan molcula de resazurina possui u m a considervel q u a n t i d a d e d e o x i g n i o livre, o q u e indica s e r u m b o m receptor de eltrons, Leuccitos presentes no leite cru possuem grande capacidade redutora; a exposio maior luz, a s s i m c o m o a presena de oxignio no leite, tambm celular, podem interferir por nos resultados da

ausncia de c o r r e l a o entre os m t o d o s . Em fevereiro de 2000. a Inc. anunciou a BioControl Systems, patente de trs o b t e n o da

produtos da I D E X X L a b o r a t o r i e s , Inc., e n t r e e l e s o sistema S i m P l a t e (Biocontrol, 2000). 2.3 ColiSure

T

(IDEXX EUA)
1

Laboratrios

Inc.,

r e d u t a s e . Q u a n t o m a i o r a p o p u l a o bactria na e composta leuccitos. mais r a p i d a m e n t e a r e s a z u r i n a r e d u z i d a ( B a k e r et et., 1942). Sua sensibilidade presena de leuccitos indica leite O com facilidade a presena para a de colostro ou da masttico. tempo requerido reduo bem menor quando comparado ao devido potencial

W e s t b r o o k , W1A

O sistema ColiSure em gua. O 100 ml por 24h.

foi d e s e n v o l v i d o p a r a a e E . coli
u

d e t e c o q u a l i t a t i v a de c o l i f o r m e s t o t a i s

meio desidratado reconstitudo em C de coliformes coli observada

de a m o s t r a de g u a e i n c u b a d o 3 5 A presena

resazurina

p e l a c o l o r a o v e r m e l h a e a =.

identificada

t e m p o de reduo do azul de metileno, s u a alta sensibilidade s variaes do

pela fluorescncia luz ultravioleta. O ColiSure e m p r e g a em seu m e i o de cultura os mesmos de nutrientes CEc, indicadores presentes vermelho coli. que Alm no na luz dos o SimPlate presena tornando-se

de oxireduo do leite, promovido pelas bactrias, leuccitos e luz. O a z u l de m e t i l e n o necessita de um E. potencial de reduo elevado para mostrar a l t e r a o d e cor. O sistema S i m P l a t e ainda pode ser utilizado detectar a e quantificar de coliformes totais e coli ( C E c ) em a l i m e n t o s , c o m leitura em 2 4 h , necessidade e t al., de o passos A placa so confirmatrios utilizada os o mesmos que Um 1998). para sem

coliformes

e fluorescendo

ultravioleta na detergentes e

p r e s e n a de E. antibiticos

nutrientes indicadores, o C o l i S u r e a i n d a possui inibem crescimento de microrganismos n o coliformes. Um e s t u d o r e a l i z a d o p o r Beloti & F r a n c o ( 1 9 9 7 ) c o m leite p a s t e u r i z a d o , c o m p a r o u o d e s e m p e n h o do ColiSure mltiplos enumerao comumente meios de utilizando-o na a de coliformes o tcnica e E. Os dos tubos de que coli com metodologia CLBVB. padro

(Tovnsend princpio se dos apenas

contagem meio de

e m p r e g a d o s para contagem total, diferenciandocultura utilizado, emprega vermelho a tecnologia do substrato definido. clorofenol

utiliza

autores

nutrientes p r e s e n t e s no m e i o de cultura o B-D-galactopiranosdeo

encontraram u m a boa correlao (0,80) entre os cultura comparados. maior Contra-provas do com uma o CLBVB, totais e demonstraram ColiSure vivel para indicando que o uma sensibilidade

( C P R G ) , q u e q u a n d o clivado pela p-D-galacfosidase, presente em todos os coliformes, torna-se vermelho. A identificao de E. coli feita pela e n z i m a - D glucuronidase, q u e quebra o 4-metil-umbeliferil pD-glucunonideo ( M U G ) , liberando a umbeliferona, q u e fluoresce luz ultravioleta.

quando comparado ColiSure

alternativa

q u a n t i f i c a o de c o l i f o r m e s 24h.

E. coli em leite p a s t e u r i z a d o , c o m a v a n t a g e m de oferecer resultados e m

Semina: C i . Agrrias, Londrina, v, 2 1 . n. 1, p. 115-126. mar. 2 0 0 0

121

2.4

ReadycuIt-LMX

(MercK,

D a r m s t a d t ,

borda

da

placa a

(Chain placa da

&

Fung,

1991).

Aps a

Alemanha) Assim como o ColiSure, o Readycult-LMX b a s e a d o na i d e n t i f i c a o de c o l i f o r m e s e E. coli, pela d e t e c o de enzimas especficas p r o d u z i d a s por 0 estes microrganismos, de cultura tendo sido tambm, a desenvolvido para analise microbiolgica de gua. meio desidratado adicionado 1 00 ml_ da a m o s t r a e incubado a 3 5 C p o r 2 4 h . Os substratos presentes no meio de cultura so 0 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil-p-D-Galactopiranosideo e o MUG. A mesma a enzima, do a p 1

semeadura, crescem

incubada espiral

e as c o l n i a s formada pelo em setores mesma

ao longo a

trilha

processo. De acordo c o m a quantidade de amostra dispensada, escolhidos placa com dividida correlacionados diluies, que podero ser

para c o n t a g e m ,

j q u e uma

placa apresenta -1 diluies d e c i m a i s em duplicata. A p s e s c o l h a d o ( s ) s e t o r ( e s ) c o n v e n i e n t e ( s ) , feita a c o n t a g e m de c o l n i a s e o r e s u l t a d o obtido corrigido, a f i m d e s e d e t e r m i n a r a c o n t a g e m final ( F u n g , 1 9 9 6 ) . O m e c a n i s m o d e s e n v o l v i d o , p a r a o plaqueamento em espiral, reduz o tempo, e espao o n m e r o de diluies, requerido et.al., mtodo & Fung. para as 1977). padro de 1991), o equipamentos Numa contagem fsico o

(BCIG)

Galaclosidase

promove

quebra a

BCIG, de

modificando a colorao do meio de a m a r e l o para azul-esverdeado, indicando presena c o l i f o r m e s . A i d e n t i f i c a o da E. c o l i r e a l i z a d a pela q u e b r a do M U G pela enzima b - g l u c u r o n i d a s e , observada pode pela emisso de fluorescncia s o b luz E. coli de ainda pela adio do reativo ultravioleta. A c o n f i r m a o da p r e s e n a de ser feita Kovacs nos tubos que fluorescerem. Barros et al. (1999} realizaram uma pesquisa
T V I

anlises microbiolgicas (Peeler comparao com de MAM (Chain

s i s t e m a r e v e l o u u m a c o r r e l a o d e 0.93, alem d a s vantagens de possuir u m a c o n t a g e m de colnias facilitada e a n e c e s s i d a d e de por amostra, amostra no j que dilui da momento apenas u m a placa a e cada automaticamente semeadura,

diluio s e m e a d a em quadriplicata. Os autores descreveram c o m o desvantagens a necessidade do p r e p a r o ideat da p l a c a c o m o g a r solidificado, j que este tem que possuir uma superfcie que e m espiral u n i f o r m e e n o c o n t e r n e n h u m a bolha d e ar, influenciaria n o c a s o d o plaqueamento

visando avaliar o d e s e m p e n h o do Readycult-l_IvlX

p a r a a d e t e c o e a quantificao de c o l i f o r m e s t o t a i s e E - c o l i e m Leite p a s t e u r i z a d o u t i l i z a n d o a t c n i c a d e tubos mltiplos e comparando-o com a metodologia t r a d i c i o n a l em C L B V B e Triptona e E C . Os r e s u l t a d o s d a s 125 amostras analisadas indicaram u m a m a i o r sensibilidade d o Readvcult-LlVlX n a identificao d e c o l i f o r m e s totais e E. coli e reduo no t e m p o de leitura para 24h. Para enumerao de coliformes totais, o R e a d y c u l t - L M X apresentou u m a c o r r e l a o de 0,82 c o m o C L B V B ; em relao e n u m e r a o de E. coli, o R e a d y c u l t - L M X
1 f ,

estar associado um m t o d o de c o n t a g e m automtica. Chain & F u n g ( 1 9 9 1 ) t a m b m relataram o baixo custo placa um por amostra pela ( U 5 $ 2,27), de justificado apenas uma dos principalmente utilizao para

por a m o s t r a .

E n t r e t a n t o , seria necessrio inicial aquisio

investimento

se correlacionou c o m os

equipamentos, na fase de implantao do sistema. Em um estudo da eficincia do plaqueamento em espiral para e n u m e r a o de colnias puras de microrganismos plaqueamento em comparando-o profundidade, as placas al., foram 1991). mtodo, devido a de bactrias se significativas com no um o nvel

c a l d o s EC e triptona em 0,86.

2.5

P l a q u e a m e n t o em

espiral

foram

O p l a q u e a m e n t o em espiral realizado p o r um equipamento semeadura sido aceito um mtodo que de na permite a automatizao alimentos. na Foi como amostras de

encontradas diferenas de 5%, quando

contadas

m a n u a l m e n t e ( M a n n f n e n et de contagens mais de altas

desenvolvido na dcada de 70 e desde ento t e m microbiologia de alimentos, (Vanderzant & oficial Splittstoesser. utilizao al., 1991).

Gilschrist et al. ( 1 9 7 3 ) r e l a t a r a m a o c o r r n c i a pelo possibilidade grupos

1 9 9 2 ; A s s o c i a t i o n o f Official A n a l y t i c a l C h e m i s t s , 1 990). E x i s t e m vrios relatos sobre a do mtodo para enumerao de bactrias, fungos e l e v e d u r a s em a l i m e n t o s ( M a n n i n e n et Nesse sistema, a amostra do previamente homogeneizada, alimento, depositada placa c o m

desagregarem no m o m e n t o q u e so dispensadas s o b r e a p l a c a . M a n n i n e n et al. ( 1 9 9 1 ) c o n f i r m a r a m essa observao, uma e considerando-a contagem o mais sistema positiva prxima como por da uma representar realidade

indicaram

alternativa a o m t o d o d e c o n t a g e m c m placas (PCA) para e n u m e r a o de bactrias, fungos e leveduras em leite cru, d e v i d o m a i o r r a p i d e z e praticidade do mtodo, principalmente se associado contagem de c o l n i a s p o r u m scanner laser.

automaticamente, d e f o r m a uniforme e contnua, em quantidades decrescentes sobre u m a m e i o d e cultura solidificado, o b e d e c e n d o a o f o r m a t o do u m a espiral de Archimedes, do centro p a r a a

122

Semina: Ci. Agrrias, Londrina, v. 2 1 , n. 1, p. 135-126. mar. 2000

P e e l e r e t al.

(1977)

descreveram o sistema

p o r a m o s t r a de leite a entretanto, aquisio sempre um necessidade de dos implantao da A p e s a r de metodologia tcnica de

ser analisada importante investimento

pela inicial

DEFT a para para que a a de

c o m o um teste rpido p a r a a realizao de anlises m i c r o b i o l g i c a s q u e p o d e s e r m u i t o til n a a n l i s e de leite. No Brasil existem hoje poucos aparelhos, prova veimente devido ao alto custo do e q u i p a m e n t o e a dificuldades c o m relao assistncia tcnica.

lembrar

equipamentos tcnica ser mais de

necessrios e rpido em

prtico

padro

contagem direta

placas,

epifluorescncia

necessita

2.6 Direct Epifluorescent Filter Technique (D.E.F.T.J A DEFT consiste na deteco direta da quantidade de microrganismos presentes em a l i m e n t o s , a t r a v s d a utilizao d e c o r a n t e s vitais, que diferenciam as bactrias viveis das noviveis. O sistema necessita de a p e n a s 20 minutos para de terminar a c o n t a g e m de microrganismos em leite c r u e, c o r n o m a i o r v a n t a g e m , d i s p e n s a o longo tempo de incubao que os mtodos tradicionais de s e m e a d u r a r e q u e r e m (Tortorello & S t e w a r t , 1 994). A t c n i c a utiliza u m a m e m b r a n a filtrante e u m m i c r o s c p i o d e e p i f l u o r e s c n c i a , s e n d o e x t r e m a m e n t e s e n s v e l (Pettipher et al, 1980).

tcnicos especialmente treinados para a execuo (Vasavada et al., 1993), u m a vez que pode ser na leitura difcil a diferenciao d a s c l u l a s v i v e i s d a s n o viveis, principalmente devido fadiga microscpica do litro pelo tcnico responsvel

( V a s a v a d a . 1993). Os m i c r o r g a n i s m o s p o d e m ser c o n t a d o s de forma a u t o m t i c a por p r o g r a m a s de analise de imagens, dispensando o trabalho m a n u a l de operao (Pettipher et al., 1 9 8 0 ) . O u t r a soluo para esse problema a utilizao de equipamentos que realizam a leitura automaticamente, alimentos que c o m o a cilometria de fluxo, q u e permite em um a quantificao de

u m a tcnica de a u t o m a o em microbiologia de tempo emprega onde de extremamente a tcnica em de um

O leite um d o s a l i m e n t o s em q u e a D E F T aplicada com maior freqncia, O processo tem incio c o m u m p r - t r a t a m e n t o d a a m o s t r a e m u m a soluo de detergente e tripsina: i s s o necessrio para g a r a n t i r filtrabilidade da e agregados amostra, o que n o r m a l m e n t e dificultada pela presena de clulas somticas microbianos no caso de leite, a l m d a p r e s e n a d e g l b u l o s d e g o r d u r a . Vrios outros pr-tratamentos so descritos, porm todos baseados em diferentes concentraes de detergentes e enzimas nas solues (FernandezA s t o r g a et al., 1 9 9 5 ) . Aps o pr-tratamento. uma membrana microrganismos membrana amostra alaranjado a amostra passa por que Em retm seguida, como em os a da o um filtrante presentes. os com e

microrganismos rpido. A com disco clula citometria

de f l u x o

epifluorescncia direta, alaranjado de microbiana rotacional atravs

a amostra aspergida luz microseringa.

tratada Cada

acridina corada

emite

vermelha

q u a n d o excitada por luz x e n o n e e s s a e m i s s o registrada pelo a p a r e l h o . A g r a n d e v a n t a g e m d a t c n i c a o tempo de leitura: a p s os 30 minutos iniciais necessrios para o tratamento da amostra, a c o n t a g e m realizada em apenas um minuto. N o BrasiE p o u c o s e u t i l i z a e s s a t c n i c a n a r o t i n a industrial, qualidade. que, nem em laboratrios j h s de no controle pais de No entanto, alguns para

contendo tratada de

microrganismos corantes, analisada

a p a r e l h o s que e m p r e g a m a citometria de fluxo, e d e v i d o ao alto c u s t o , industrias. so viveis grandes

acridina

m i c r o s c p i o de epifluorescncia, o n d e se visualiza os m i c r o r g a n i s m o s v i v e i s em cor laranja e os noviveis em verde (Pettipher A DEFT se et al., 1980). bem com o a correlaciona muito 3 CONSIDERAES FINAIS

mtodo padro de contagem de microrganismos e m placas (0,94), s e r v i n d o c o m o base para u m a rpida resposta da qualidade do leite para p r o d u t o r e s e p a r a a i n d u s t r i a , j q u e a a n l i s e extremamente rpida (Manners, da cru, utilizao da D E F T para 1985). Tatini et al. ( 1 9 9 1 ) r e l a t a r a m a p o s s i b i l i d a d e a determinao da q u a n t i d a d e d e m i c r o r g a n i s m o s p s i c r o t r f i c o s e m leite desde que a a m o s t r a a ser analisada seja submetida processos de pr-incubao adequados. M a n n e r s (1985) classifica c o m o baixo o custo

A c a r g a microbiana do leite p r o d u z i d o no Brasil, constituio de de sua microbiota, so de bem como o principio cada mtodo, fatores que

influenciam

o desempenho prvias j

mtodos

rpidos algumas

para contagem d e M A M (Beloti e t a l . , 1999a). Pesquisas demonstraram dificuldades na implantao de mtodos alternativos de contagem de lctea brasileira, aerbios mesfilos na indstria contagens por apresentarem

m e n o r e s quando comparados c o m a metodologia t r a d i c i o n a l (Beloti, 2 0 0 0 ) . Esses resultados parecem ser quase uma
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Semina: C i . Agrrias, L o n d r i n a , v. 2 1 , n. 1, p. 115-126. mar. 2000

e x c l u s i v i d a d e d o leite b r a s i l e i r o , e e s t o r e l a c i o n a d o s a caractersticas intrnsecas produo e/ou b e n e f i c i a m e n t o d o leite a q u i p r o d u z i d o . P o r outro lado, o s m t o d o s para e n u m e r a o d e coliformes apresentam por bom a desempenho, tecnologia com do os

m e n o r manipulao, facilitam muito a execuo das anlises e diminuem a possibilidade de contaminao a u m e n t a n d o a preciso nas a n l i s e s . Segundo Franco & Landgraff (1996), a escolha da metodologia a ser adotada norteada pelos na realizao de parmetros: anlise, anlises microbiolgicas de um produto qualquer deve ser preciso seguintes pretendida, custo, tempo de

provavelmente a esses Na e com

utilizarem quando

substrato definido que confere m a i o r especificidade mtodos, comparados com tradicionais (Beloti, 2000). indstria lctea brasileira, o que possveis ser um e x c e e s , predomina a m o de obra de baixo c u s t o pouca qualificao, pode problema na execuo de tcnicas microbiolgicas tradicionais. Nos mtodos rpidos, entretanto, a simplicidade das operaes, o menor nmero de etapas no preparo do material e, c o n s e q e n t e m e n t e

aceitabilidade do m t o d o por rgos oficiais e pela c o m u n i d a d e cientifica e simplicidade de operao. Independentemente extremamente desenvolva e a do mtodo que de selecionado, cada importante laboratrio

programas

controle de qualidade obtidos e garantir que

laboratorial, c o m o o b j e t i v o de verificar a e x a t i d o preciso dos d a d o s sejam adequados para u m a tomada de deciso.

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ABSTRACT: This review microorganismo enumeration in KEY WORDS: milk,

describes milk. discussing dairy microbiotogy

the

main their

rapid adequacy

and autosnated mothods use d for or inadequaoy in Biszilian dairy

indicators industry.

rapid

methods.

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