Gua de Prcticas de Biologa Celular y Molecular

Escuela de Medicina Humana USAT

PRCTICA N 5

Microscopa
BLGO. JOS LLONTOP NUEZ

I.

COMPETENCIAS
a. Identifica las partes de un microscopio ptico. b. Explica cmo se forman imgenes en el microscopio ptico. c. Ejecuta correctamente preparaciones en fresco y en seco definiendo el uso de los diferentes objetivos segn el caso.

II.

INTRODUCCIN.
El Microscopio ptico es una herramienta de suma importancia en el laboratorio de Biologa Celular, a travs del cual se puede obtener imgenes dimensionales del objeto observado al ser atravesado por la luz mirando a travs de los oculares. De un lado el microscopio provee aumento y permite ver detalles de objetos tan pequeos que no son visibles a simple vista (menor de 0,1 mm).8 Existe una gran variedad de microscopios que, segn la fuente de iluminacin utilizada, se agrupan en:

Microscopios pticos9: La fuente de iluminacin es la luz.

a. De campo claro. Permiten la observacin de preparaciones en sus colores naturales o contrastados mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo ms brillante. De campo oscuro. Permiten la observacin de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales. De contraste de fases. Gracias a la utilizacin de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el ndice de refraccin de las clulas y el medio que las rodea, permiten la observacin de clulas vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tincin de las mismas. De interferencia. Permiten observar clulas vivas sin teir, obtenindose una imagen en relieve de las mismas. De fluorescencia. La fuente de iluminacin proporciona luz ultravioleta que excita ciertas molculas presentes en las clulas (bien de forma natural o aadida a la preparacin) que emiten fluorescencia en el espectro visible.

b.

c.

d. e.

Microscopios electrnicos10: La fuente de iluminacin es un chorro de electrones y

las lentes son electroimanes. a. De transmisin. Permiten la observacin de muestras teidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a lminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que stos se envan a una pantalla que emite fluorescencia ms o menos intensa segn el nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tian ms intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no permitirn la emisin de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecern oscuras en un fondo ms brillante. Se consiguen entre 10 000 y 100 000 aumentos.

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b.

De barrido. Permiten la observacin de clulas enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1 000 y 10 000 aumentos. Durante las prcticas se emplear el microscopio ptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecnicos, de iluminacin y pticos). El Microscopio consta de las siguientes partes en su estructura:

A. Sistema Mecnico: Pie o Base Brazo o columna Tubo ptico Revolver Platina Tornillos Macro y Micromtrico B. Sistema ptico: Lentes convergentes que incluyen oculares y objetivos C. Sistema de Iluminacin: Espejo o lmpara de iluminacin Condensador Diafragma y Portafiltro. En el desarrollo de las prcticas sern usados 2 tipos de microscopios: 1. El microscopio estereoscpico, el cual es binocular, con aumentos de 4 a 40 veces. Permite observar muestras opacas y realizar disecciones de estructuras en organismos pequeos, ya que en l puede manipularse la muestra mientras se observa. Proporciona una imagen tridimensional. 2. El microscopio compuesto, que puede ser monocular o binocular. Permite obtener aumentos de 100 a 1500 veces. Los objetos a observar deben ser muy pequeos o cortados en lminas tan delgadas que la luz pueda atravesarlos. Estos se colocan en lminas de vidrio especiales denominadas porta-objetos y cubre-objetos. Las imgenes que se obtienen son bidimensionales e invertidas.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:

3.1.

Materiales y equipos 3.1.1. Materiales: 1. Biolgico: Cabellos (2 unidades) Insecto o arcnido (1 unidad) Orina (50 ml) 2. De vidrio: 2 tubos de ensayo 13x100 10 lminas portaobjetos 10 lminas cubreobjetos 1 placa petri 1 pipeta pasteur con chupn de goma 3. Reactivos y colorantes: Agua destilada (300 ml) Azul de metileno (20 ml) Aceite de inmersin (5 ml) Nocivo/Peligroso para el ambiente 3.1.2. Equipos, instrumentos y otros: 1 Microscopio 1 Estereoscopio

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1 centrfuga 1 Gradilla 5 hisopos 2 Estiletes

3.2.

Procedimientos.
3.2.1.

Recomendaciones para el uso y mantenimiento del Microscopio. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. Comenzar la observacin con el objetivo de menor aumento: 4x o 5x (ya est en posicin) o colocar el de 10x si la preparacin es de bacterias. Para realizar el enfoque: Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe la muestra, algo ntida, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin de enfoque inicial. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores o mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. Empleo del objetivo de inmersin: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de 40x. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es

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mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el enfoque inicial. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando una solucin limpiadora y un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
3.2.2.

Mantenimiento del microscopio y precauciones Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel para lentes. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en alcohol. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica. Identificacin de las partes del microscopio. Coloca el nombre de cada parte del microscopio en el grfico:

3.2.3.

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1. .................................................................. . 2. .................................................................. 3. .................................................................. 4. .................................................................. 5. .................................................................. 6. .................................................................. 7. ..................................................................

8. . ................................................................ 9. . ................................................................ 10. . ................................................................ 11. . ................................................................ 12. . ................................................................ 13. . ................................................................ 14. . ................................................................

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3.2.4.

Preparados microscpicos en fresco. En un tubo de ensayo 13x100 colocar orina (unos 2/3 de su capacidad) y centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. Descartar el sobrenadante y agitar vigorosamente el sedimento con lo que queda de lquido en el fondo del tubo. Con una pipeta pasteur tomar el homogeneizado y en una lmina portaobjetos colocar una gota de la muestra Poner encima una lmina cubreobjeto. Observar con los objetivos 4x, 10x y 40x. NO USAR EL OBJETIVO DE INMERSIN. Esquematizar lo observado a 400x en una circunferencia de 10 cm de dimetro, tratando de que exista proporcin entre lo visto y lo esquematizado. Preparados microscpicos en seco En una lmina portaobjeto colocar una pequea gota de sangre con anticoagulante y realizar un frotis sanguneo. Secar a temperatura ambiente o para acelerar use la estufa a 50 C. Preparar el sistema de coloracin usando varillas de vidrio unidas por mangueras del dimetro de ligaduras. Poner encima la lmina con el frotis y colorear con Wright. La coloracin Wright consiste el colocar el colorante de tal manera que cubre totalmente el frotis sanguneo, luego colocar unas gotas de agua destilada y finalmente distribuir (mezclar) homogneamente el colorante-agua sobre el frotis. Dejar por 8-10 minutos. Enjuagar lentamente con chorro de agua de cao hasta disminuir el exceso de colorante. Secar en estufa. Enfocar a 10x, luego agregar aceite de inmersin sobre el campo enfocado una vez de haber girado el objetivo de 10X. USAR EL OBJETIVO DE INMERSIN movindolo hacia el campo enfocado. Esquematizar lo observado en un campo de 10 cm de dimetro, tratando de que exista proporcin entre lo visto y lo esquematizado.

3.2.5.

3.2.6.

Observacin tridimensional en el estereoscopio. Colocar sobre la base de una placa petri, un insecto y observar sus estructuras. Graficar lo observado.

3.3.

Manejo de Residuos. El material de vidrio con las muestras procesadas deber lavarse con abundante agua y detergente, enjuagndolos luego con agua destilada. Los residuos lquidos no txicos se eliminarn directamente hacia el alcantarillado, inclusive la muestra de orina. Los insectos pueden desecharse directamente en el recipiente de residuos del laboratorio.