AFLATOXINAS Un poco de Historia.

o Las aflatoxinas cobraron importancia a partir de la muerte repentina en Escocia (1960), de cien mil pavos alimentados con man infectado con una especie fngica: Aspergilus flavus proveniente del Brasil. Los micelios de sta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas de man, girasol, algodn, soya, avellanas, almendras y cereales y sus derivados dispuestos en sacos o silos. En 1961-1962 comenzaron a aparecer publicaciones en las que se pona en manifiesto la presencia de una sustancia txica, ms tarde llamada aflatoxina, en la harina de cacahuate procedente de frica, Brasil y otras zonas. Tiempo despus los investigadores britnicos demostraron que se trataba del metabolito de un hongo Aspergillus flavus. La AOAC cre un grupo de trabajo encargado de establecer la metodologa ms idnea para la determinacin de aflatoxinas, este grupo emiti varios reportes que culminaron en la adopcin de un mtodo oficial en 1966.

Qu son? Las aflatoxinas, al igual que otras micotoxinas son metabolitos secundarios generalmente txicos producidos por algunas especies fngicas. Las aflatoxinas son producidas principalmente por algunas especies de aspergilus tales como: A. flavus, A. parasiticus y A. nominus Las ms txicas son la AFLATOXINA M1 (AFM1) (derivado metablico de la AFLATOXINA B1 y que se forma dentro del organismo animal), la AFLATOXINA B1 (AFB1) y la AFLATOXINA G1 (AFG1). Las notaciones B y G se refieren al hecho de que estos compuestos presentan fluorescencia azul (blue) y verde (green), respectivamente, cuando se exponen a la radiacin UV.

Dnde se pueden encontrar? Las aflatoxinas se pueden encontrar en cereales y sus subproductos, ensilados, piensos, carne y pescado secos, forrajes, frutos secos, especias, leche y derivados y otros alimentos para humanos. Los hongos que producen las aflatoxinas son capaces de desarrollarse en gran variedad de sustratos, pudiendo contaminar los alimentos cuando stos son cultivados, procesados, transformados o almacenados en condiciones adecuadas que favorezcan su desarrollo. De forma interesante, se habla de que casi la mitad de los cacahuates recin recolectados contienen esporas de Penicillium y/o Aspergillus. Factores de Riesgo El crecimiento y la produccin de toxinas dependen de muchos factores como el alimento en cuestin, su grado de acidez, la temperatura o humedad ambientales y la presencia de microflora competidora. Los alimentos con cierta humedad (superior al 15%), almacenados en condiciones de alta temperatura (ms de 25C) y alta humedad ambiental (ms del 85%), son un sustrato ideal

para el desarrollo de estos hongos productores de micotoxinas; el riesgo es mayor cuando existe una elevada proporcin de granos daados partidos, cuando el alimento est molido, y cuando el tiempo de almacenamiento es prolongado. No obstante, se debe tener presente que no todos los hongos producen micotoxinas; y a su vez, puede haber micotoxinas y ya no hongos. Qu daos causan a la salud? Son cancerigenas, teratogenicas y mutagenicas, hepatotoxicas e inmunosupresivas. Teratognicas: que puede originar alteraciones en el feto durante su desarrollo intrauterino originndole malformaciones. Mutagnicos: que pueden producir alteraciones en el material gentico de las clulas (mutaciones). Hepatotoxico: que causa dao a las clulas del hgado Inmunosupresor: Que suspende la respuesta inmunitaria del organismo ante determinados tratamientos mdicos La accin carcinognica de las aflatoxinas ha sido demostrada en ratas, truchas y hurones. Usando alimento con aflatoxinas se demostr que 0,5 ppm. en la dieta inducen en un 100% carcinoma heptico en ratas. Hay mayores evidencias en aquellas reas del mundo donde se ha incrementado la incidencia de carcinoma heptico en la poblacin expuesta a las aflatoxinas donde la nutricin proteica es deficiente. Se produce la aflatoxicosis aguda cuando se consumen niveles medios a altos de aflatoxinas. Los efectos de esta intoxicacin pueden incluir hemorragia, dao agudo del hgado, el edema, la alteracin en la digestin, la absorcin y/o el metabolismo de alimentos, y posiblemente la muerte. La aflatoxicosis crnica resulta del consumo de niveles bajos a moderados de aflatoxinas. Los efectos son generalmente subclnicos y difciles de reconocer. Algunos de los sntomas comunes son una difcil y deteriorada absorcin de los alimentos e ndices de crecimiento ms lento. Para que un animal (o ser humano) haya muerto por causa de aflatoxinas debi ser suministrado con grandes dosis de las mismas -y 'posiblemente' durante largo tiempo-, esto pone en duda la cadena entera de control de calidad sobre la que el gobierno nacional (adems de la empresa) tiene una gran cuota de responsabilidad. Los principales rganos afectados son hgado, rin y cerebro. Cmo se determina su presencia? En la eleccin de un mtodo para la determinacin de aflatoxinas se debe considerar el nivel de instrumentacin y la experiencia requeridos, el costo del ensayo, el nmero de muestras que se necesitan, la sensibilidad requerida, la precisin, la exactitud y la especificidad. Preparacin de la muestra En cualquier determinacin analtica de alimentos, los resultados del mtodo ms sofisticado significan poco si no se ha obtenido una muestra representativa de todo el producto. Puesto que las micotoxinas no estn distribuidas homogneamente en el grano o en los piensos, la toma de muestra de pienso o grano que proporcione una idea correcta en un anlisis de micotoxinas es difcil. Tomas individuales generalmente proporcionan bajas estimaciones del contenido en micotoxinas. De hecho, casi el 90% del error asociado a los anlisis de micotoxinas puede ser atribuido a como se tom la muestra original. Esto se debe a que aproximadamente un 3% de las semillas en un lote contaminado contienen micotoxinas, y que estas semillas contaminadas no estn generalmente igual distribuidas en el lote de granos.

En el anexo 1 de la Directiva 98/53/CE (Comunidad Europea) de la Comisin de 16 de Julio de 1998, se establecen las disposiciones (n muestras elementales, peso de la muestra elemental, condicionamiento y conservacin de las muestras, etc.) para el control oficial del contenido de aflatoxinas en determinados productos alimenticios, entre ellos cacahuetes, frutos de cscara, frutos desecados y cereales. En Mxico la NOM-188-SSA-1-2002 Productos y Servicios. Control de aflatoxinas en cereales para consumo humano y animal. Especificaciones sanitarias. Establece las condiciones en las que se debe llevar a cabo el muestreo. Con este patrn de contaminacin, es absolutamente necesario realizar metodologas sistemticas en el muestreo, la preparacin de la muestra y el anlisis para poder determinar de aflatoxinas del orden de las ppb. El procedimiento general de muestreo es el siguiente: 1. Reduccin del tamao de partcula Moler toda la muestra junta hasta reducir el tamao de partcula hasta el mnimo que sea prctico y manejable. 2. Homogenizacin Se debe mezclar la muestra perfectamente para garantizar la distribucin de las posibles porciones contaminadas. De esta forma, la porcin de muestra a la que se va a realizar la prueba analtica tiene la misma concentracin de aflatoxina que la muestra original.

Extraccin y purificacin de la muestra La deteccin de minsculas cantidades de aflatoxinas en los alimentos hace necesario que las toxinas se separen de compuestos presentes en la muestra que puedan interferir en la determinacin. Se realiza una extraccin inicial para remover la toxina de la matriz del alimento, pero se extraen a la vez otros compuestos. Estos compuestos pueden interferir en la determinacin analtica, por lo que una etapa de purificacin es necesaria. PRIMERA PARTE: La extraccin o o La muestra homognea y finamente dividida se somete a agitacin a alta velocidad en la presencia del sistema de disolventes para la extraccin Los disolventes ms utilizados son: acetona-agua (85:15) y cloroformo-agua (91:9). Los disolventes orgnicos se combinan con pequeas cantidades de agua para incrementar la penetracin del sistema en el tejido hidroflico del alimento. La fase acuosa puede ser una solucin cida que rompa las interacciones entre las toxinas y los constituyentes del alimento (como las protenas), aumentando la eficiencia de la extraccin Despus de la extraccin la solucin se filtra para separar los residuos slidos, y entonces queda lista para los procedimientos de purificacin

SEGUNDA PARTE: La purificacin o o o o En muestras con gran cantidad de lpidos, stos pueden extraerse despus de la extraccin utilizando disolventes no polares como el hexano Es esencial la eliminacin de compuestos fluorescentes, pues la propiedad de las toxinas que se usa en la determinacin es precisamente su fluorescencia Se usan columnas cromatogrficas para purificar los extractos de aflatoxina. Esas columnas pueden ser empacadas en el laboratorio o comprarse ya listas para su uso El extracto se hace pasar a travs de la columna de slica-gel usando un disolvente no polar. Las toxinas se quedan atrapadas en la matriz, mientras que el disolvente no polar arrastra todos los compuestos de interferencia (como los lpidos). Las toxinas se recuperan de la columna eluyendo con un disolvente ms polar

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Adems del slica-gel, se usan como adsorbentes Florisil R, Sephadex R, xido de aluminio, celulosa y poliamida Las columnas que se venden preempacadas tienen la ventaja de un empacado ms uniforme, menor cantidad de tiempo y de disolventes, pero son menos verstiles, pues no pueden adaptarse a los requerimientos de cada muestra Una vez que el extracto se ha purificado es necesario concentrarlo. Esto se logra usando un evaporador rotatorio bajo presin reducida, de forma que sean suficientes pequeos incrementos de temperatura para concentrar la muestra a sequedad Despus de la concentracin de la muestra a sequedad, puede redisolverse en un pequeo volumen de disolvente compatible con el sistema de determinacin Tcnicas para la cuantificacin de aflatoxinas

Mtodos cromatogrficos La cromatografa es un proceso en el cual los componentes de una mezcla pueden ser fsicamente separados para su identificacin y cuantificacin. Generalmente la mezcla en una fase mvil se hace pasar por una fase estacionaria (llamada matriz), y los diferentes componentes de la mezcla se separan de acuerdo con una propiedad particular. Mtodos de minicolumnas o o o o Es un mtodo barato y rpido Permite monitorear un gran nmero de muestras usando personal sin entrenamiento cientfico El mtodo fue primero descrito por Romer (1975) y adaptado por Stanley y colaboradores (1979) Una minicolumna de 6 x 190mm es empacada con una capa de fibra de vidrio en el extremo inferior, seguida por una capa de sulfato de calcio, Florisil como adsorbente, aluminia y otra capa de sulfato de calcio El extracto de la muestra en cloroformo es colocado en la minicolumna y se deja migrar hacia abajo Se adiciona como disolvente de elucin cloroformo-acetona (9:1) El sulfato de calcio sirve para secar la muestra, mientras que la alumina atrapa muchos de los compuestos de interferencia Las aflatoxinas quedan atrapadas en una banda en la parte superior de la capa de Florisil, y son examinadas bajo luz UV Se puede estimar la concentracin de aflatoxinas en la muestra comparando la intensidad de la fluorescencia de la minicolumna de la muestra con una columna a la que se adicion una cantidad conocida de aflatoxinas estndar La sensitividad del mtodo no es muy grande (5-15 g/kg) Se usa slo como mtodo preliminar para la aplicacin de otros mtodos ms sofisticados en caso de un resultado positivo

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Cromatografa en capa fina. TLC (Thin-Layer Chromatography)) o o o Es otra tcnica analtica barata que puede ser ejecutada usando equipo bsico de laboratorio Es un mtodo de multideteccin por el que pueden determinarse la mayora de las micotoxinas de inters. Es un procedimiento semicuantitativo que frecuentemente est limitado por tener una baja precisin y una baja eficiencia cromatogrfica

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Se realiza en una capa delgada de material adsorbente soportada por vidrio inerte o una charola plstica El adsorbente es generalmente slica-gel La fase mvil es el sistema de disolventes que se coloca en un recipiente junto con el plato (el plato debe traer aplicado el extracto con la muestra, y el nivel del disolvente no debe llegar a la altura de la muestra) El disolvente se deja migrar hacia arriba por el adsorbente, arrastrando la mezcla de componentes en diferentes grados de acuerdo con su afinidad por las fases mvil y estacionaria Se calcula el valor del Rf despus de revelar la placa con luz UV: o

Rf =

DistanciaCompuesto DistanciaDisolvente

El valor del Rf de la muestra se compara con el valor del Rf para estndares de aflatoxina colocados en la misma placa. De esta forma es posible identificar las aflatoxinas Los sistemas de disolventes ms usados son los que se muestran a continuacin: Sistema de Disolventes 1 Direccin Cloroformo-Acetona 90:10 ter-Metanol-Agua 96:3:1 Cloroformo-Acetona 9:1 2 Direccin

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La cromatografa en una sola direccin se usa para muestras que han sido altamente purificadas La presencia de altas concentraciones de compuestos de interferencia puede ser compensada empleando cromatografa en dos direcciones Se corre la cromatografa en una direccin y se deja secar la placa. La mezcla de disolventes ter-Metanol-Agua sirve para arrastrar los componentes lipdicos que no fueron removidos en la purificacin La placa se rota 90 y se realiza la segunda cromatografa usando cloroformo-acetona Los estndares deben colocarse en forma diagonal para que no interfieran con la migracin de la muestra Como en la cromatografa unidireccional, la placa se revela con UV, se calculan los valores de Rf y se compara la muestra con los estndares Las concentraciones aproximadas de aflatoxina se determinan comparando las intensidades de color con los estndares de concentracin conocida

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Cromatografa lquida de alta resolucin HPLC En este caso se emplea una columna de fase inversa (C18), seguida la separacin de una reaccin de derivatizacin para proveer a la aflatoxina de la fluorescencia necesaria para poder cuantificarse. Previamente a la separacin por HPLC se puede aislar selectivamente una micotoxina en concreto, mediante una columna de inmunoafinidad conteniendo anticuerpos especficos de la micotoxina en cuestin. o La fase mvil es colocada a alta presin y es forzada a travs de una columna que contiene la fase estacionaria

o o o o o

Es un mtodo ms eficiente y preciso que el TLC Puede estar adaptado a una computadora, con lo que la determinacin se vuelve completamente automatizada Requiere un tiempo largo de anlisis para una muestra sencilla, los instrumentos son caros y requiere un alto nivel de experiencia para operar y mantener el equipo Las muestras que se van a analizar por HPLC requieren mucho ms pureza HPLC de fase normal: las columnas son de slica gel y se usa cloroformo-cloruro de metileno. Los detectores estn equipados con detectores de fluorescencia. El problema es que la fluorescencia de B1 y B2 es muy dbil en los disolventes no polares utilizados HPLC de fase reversa: la fase estacionaria es de octadecilslca no polar y se usan disolventes polares (agua-acetonitrilo-metanol). B1 y G1 casi no presentan fluorescencia en disolventes polares, pero pueden convertirse a sus hemiacetales fluorescentes haciendo reaccionar el extracto de la muestra con cido TFA. Un mtodo alternativo es hacer reaccionar las toxinas con yodo/agua despus de la HPLC, lo que incrementa su fluorescencia

Mtodos biolgicos En los bioensayos se usa una gran variedad de sistemas biolgicos para probar la presencia de aflatoxinas. El nico bioensayo aceptado por la AOAC es en embriones de pollo. o o o Extractos crudos de micotoxinas o de estndares son inyectados en la bolsa de aire de embriones de pollo antes de la incubacin Se construye una curva de dosis respuesta con las concentraciones de estndar En la curva anterior se interpola el valor de respuesta obtenido para la muestra

Mtodos inmunolgicos El anlisis de aflatoxinas usando inmunoensayos se basa en el hecho de que los animales que estn expuestos a macromolculas extraas sintetizan protenas reactivas llamadas anticuerpos, que son especficos para esos antgenos. Las aflatoxinas son demasiado pequeas y por s mismas no causan una respuesta inmunolgica. Pero si se inyectan a los animales acopladas con macromolculas antignicas, los anticuerpos resultantes pueden ser utilizados para fines analticos. A. Radioinmunoensayo RIA o Su principio es la competicin entre las aflatoxinas de una muestra y aflatoxinas estndar marcadas radiactivamente, por un limitado nmero de sitios en los correspondientes anticuerpos El extracto de la muestra es incubado con el correspondiente anticuerpo y la toxina marcada La toxina libre y la unida son separadas y el nivel de inhibicin ejercido por la muestra en la unin de la toxina marcada y el anticuerpo puede ser determinado. Este valor es comparado con una curva estndar obtenida incubando concentraciones variables del estndar de toxina en las mismas condiciones La sensibilidad del ensayo es proporcional a la pureza del extracto Procedimiento El extracto purificado o el estndar de aflatoxina se disuelven en buffer de fosfato y se incuban con la toxina marcada radiactivamente y con una dilucin apropiada del anticuerpo Se separa la toxina libre de la unida precipitando el complejo toxina-anticuerpo con una solucin saturada de sulfato de amonio, centrifugando y decantando

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o o B. ELISA o

La cantidad de toxina libre marcada radiactivamente es determinada midiendo el nivel de radiactividad emitido por el sobrenadante La cantidad de toxina unida marcada radiactivamente es determinada midiendo la radiactividad del precipitado

Es similar al RIA, pero de mayor sensitividad y menor variabilidad. Tambin est basado en la unin competitiva entre las toxinas libres de la muestra y toxinas marcadas con sitios en un anticuerpo Usa un conjugado enzima-toxina como el marcador Despus de incubar con la muestra, la cantidad de complejo enzima-toxina unida al anticuerpo es determinada adicionando un sustrato para la enzima El producto de la reaccin catalizada por la enzima puede ser cuantificado espectrofotomtricamente, midiendo la cantidad de complejo enzima-toxina unida al anticuerpo, y con ella la cantidad de toxina en la muestra No involucra compuestos radiactivos, por lo que puede considerarse ms seguro Requiere menos tiempo Pueden determinarse varias muestras a la vez Una fase slida (placas o tubos de poliestireno) es pretratada con albmina srica bovina y glutaraldehdo Se adicionan los anticuerpos diluidos en buffer La placa se deja secar al aire y puede ser guardada hasta 3 meses en desecador sin perder su reactividad Se mezcla el extracto de la muestra o el estndar de aflatoxinas con el conjugado enzima-toxina Se adiciona la mezcla anterior a la placa con anticuerpos y se incuba durante 1 hora a 37C Se lava la placa repetidamente con una mezcla Tween-buffer para remover la toxina o el conjugado enzima-toxina que no se unieron Se determina la cantidad de conjugado enzima-toxina unido a los anticuerpos adicionando a la placa el sustrato de la enzima, que es convertido a cromforo para leer su absorbancia

o o o

o o o o o o o o o o

Procedimiento del ELISA

C Kits comerciales Basados en la tcnica enzimo-inmuno anlisis competitivo. El principio bsico de estos kits es la afinidad de las aflatoxinas por anticuerpos especficos fijados a un soporte. o La reaccin de competicin entre la aflatoxina y un producto enzima/conjugado (coloreado) que contiene el kit indica la ausencia de aflatoxina cuando el resultado de la prueba es una seal coloreada, y presencia de las mismas en caso de ausencia de color. o Estas tcnicas permiten el control de las aflatoxinas in situ, de un modo rpido, fiable y sencillo. Un ejemplo de estos Kits comerciales, es el Aflatest, el cual es aceptado, tanto por la normatividad mexicana, como por la AOAC o AflaTest de VICAM es el nico anlisis de aflatoxina que da resultados numricos precisos. Usando la cromatografa de afinidad monoclonal, AflaTest puede aislar aflatoxinas B1, B₂, G1, y G2 de alimento para consumo animal y humano y granos, a niveles tan bajos como 0.1 ppb y tan altos como 300 ppb. Puede ser ejecutado en menos de 10 minutos y no requiere habilidades especiales. Los resultados pueden ser registrados utilizando una

lectura de fluormetro digital con dispositivo automtico de impresin. AflaTest es tambin ideal como el paso de limpieza total para cualquier anlisis de HPLC.

Limite permitido de Aflatoxinas De acuerdo con la Norma oficial mexicana NOM-188-SSA-1-2002 granos y cereales para consumo animal y humano, la contaminacin no debe exceder de 20 g/kg de aflatoxinas totales en granos y cereales para consumo humano. En granos y cereales para consumo animal se aceptan concentraciones de 21-300 g/kg. Bibliografa

o AOAC Official Methods of Analysis. 16 ed. 1995. o Kirk, R.S. et.al. Anlisis qumico de alimentos de Pearson o Fung, Daniel et.al. Instrumental Methods for Quality Assurance in Foods. EUA, ASQC Quality Press, 1991. o Food science and technology, a series of monographs. HPLC in food analysis. EUA, academic press limited. 1988.
o

http://www.adiveter.com/ftp/articles/articulo578.pdf? PHPSESSID=ccce4496d48378e78c40cc0c471d7e4a http://es.msnusers.com/Alimentosanalisis/Documentos/Archivos %2DAlumnos/ASOCIADOS%20A%20CEREALES%20%2D%20ALUMNOS%2EDOC

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO Facultad de qumica

Anlisis de alimentos.

Aflatoxinas

Profra: M.C Fca. Aida Iturbe Chias Alumnas: Cova Prez Cecilia Prez Hernndez Alejandra

Mayo 2007

Cromatografa lquida de alta resolucin HPLC En este caso se emplea una columna de fase inversa (C18), seguida la separacin de una reaccin de derivatizacin para proveer a la aflatoxina de la fluorescencia necesaria para poder cuantificarse. Previamente a la separacin por HPLC se puede aislar selectivamente una micotoxina en concreto, mediante una columna de inmunoafinidad conteniendo anticuerpos especficos de la micotoxina en cuestin. o La fase mvil es colocada a alta presin y es forzada a travs de una columna que contiene la fase estacionaria o Es un mtodo ms eficiente y preciso que el TLC o Puede estar adaptado a una computadora, con lo que la determinacin se vuelve completamente automatizada o Requiere un tiempo largo de anlisis para una muestra sencilla, los instrumentos son caros y requiere un alto nivel de experiencia para operar y mantener el equipo o Las muestras que se van a analizar por HPLC requieren mucho ms pureza o HPLC de fase normal: las columnas son de slica gel y se usa cloroformo-cloruro de metileno. Los detectores estn equipados con detectores de fluorescencia. El problema es que la fluorescencia de B1 y B2 es muy dbil en los disolventes no polares utilizados
o HPLC de fase reversa: la fase estacionaria es de octadecilslca no polar y se usan disolventes polares (agua-acetonitrilo-metanol). B1 y G1 casi no presentan fluorescencia en disolventes polares, pero pueden convertirse a sus hemiacetales fluorescentes haciendo reaccionar el extracto de la muestra con cido TFA. Un mtodo alternativo es hacer reaccionar las toxinas con yodo/agua despus de la HPLC, lo que incrementa su fluorescencia

Mtodos biolgicos En los bioensayos se usa una gran variedad de sistemas biolgicos para probar la presencia de aflatoxinas. El nico bioensayo aceptado por la AOAC es en embriones de pollo.

Mtodos inmunolgicos El anlisis de aflatoxinas usando inmunoensayos se basa en el hecho de que los animales que estn expuestos a macromolculas extraas sintetizan protenas reactivas llamadas anticuerpos, que son especficos para esos antgenos. Las aflatoxinas son demasiado pequeas y por s mismas no causan una respuesta inmunolgica. Pero si se inyectan a los animales acopladas con macromolculas antignicas, los anticuerpos resultantes pueden ser utilizados para fines analticos. Radioinmunoensayo RIA o Su principio es la competicin entre las aflatoxinas de una muestra y aflatoxinas estndar marcadas radiactivamente, por un limitado nmero de sitios en los correspondientes anticuerpos o o Procedimiento o El extracto purificado o el estndar de aflatoxina se disuelven en buffer de fosfato y se incuban con la toxina marcada radiactivamente y con una dilucin apropiada del anticuerpo o Se separa la toxina libre de la unida precipitando el complejo toxina-anticuerpo con una solucin saturada de sulfato de amonio, centrifugando y decantando o La cantidad de toxina libre marcada radiactivamente es determinada midiendo el nivel de radiactividad emitido por el sobrenadante o La cantidad de toxina unida marcada radiactivamente es determinada midiendo la radiactividad del precipitado

ELISA o Es similar al RIA, pero de mayor sensitividad y menor variabilidad. Tambin est basado en la unin competitiva entre las toxinas libres de la muestra y toxinas marcadas con sitios en un anticuerpo o Usa un conjugado enzima-toxina como el marcador o No involucra compuestos radiactivos, por lo que puede considerarse ms seguro o Requiere menos tiempo o Pueden determinarse varias muestras a la vez Procedimiento del ELISA o Una fase slida (placas o tubos de poliestireno) es pretratada con albmina srica bovina y glutaraldehdo o Se adicionan los anticuerpos diluidos en buffer o La placa se deja secar al aire y puede ser guardada hasta 3 meses en desecador sin perder su reactividad o Se mezcla el extracto de la muestra o el estndar de aflatoxinas con el conjugado enzima-toxina o Se adiciona la mezcla anterior a la placa con anticuerpos y se incuba durante 1 hora a 37C o Se lava la placa repetidamente con una mezcla Tween-buffer para remover la toxina o el conjugado enzima-toxina que no se unieron o Se determina la cantidad de conjugado enzima-toxina unido a los anticuerpos adicionando a la placa el sustrato de la enzima, que es convertido a cromforo para leer su absorbancia Kits comerciales o Basados en la tcnica enzimo-inmuno anlisis competitivo. El principio bsico de estos kits es la afinidad de las aflatoxinas por anticuerpos especficos fijados a un soporte. o La reaccin de competicin entre la aflatoxina y un producto enzima/conjugado (coloreado) que contiene el kit indica la ausencia de aflatoxina cuando el resultado de la prueba es una seal coloreada, y presencia de las mismas en caso de ausencia de color.

o Estas tcnicas permiten el control de las aflatoxinas in situ, de un modo rpido, fiable y sencillo. AflaTest de VICAM puede aislar aflatoxinas B1, B₂, G1, y G2 de alimento para consumo animal y humano y granos, a niveles tan bajos como 0.1 ppb y tan altos como 300 ppb. Limite permitido de Aflatoxinas NOM-188-SSA-1-2002 granos y cereales para consumo animal y humano, la contaminacin no debe exceder de 20 g/kg de aflatoxinas consumo humano. 21-300 g/kg. Consumo anima