TEMA 3. OPERACIONES DE LOS PROCESOS BIOSINTETICOS OBJETIVOS DEL TEMA.

El alumno conocer el fundamento de los diferentes mtodos para cuantificar el crecimiento microbiano El alumno utilizar la estequiometra para predecir requerimientos y rendimientos del crecimiento celular, lo cul le permitir formular un medio de cultivo El alumno aplicar los fundamentos de la esterilizacin para determinar tiempos y temperaturas para reduccin de carga microbiana en medios de cultivo, determinado la constante de muerte trmica El alumno conocer y aplicar relaciones matemticas para describir y predecir el crecimiento bacteriano. El alumno conocer y discutir el efecto de los factores ambientales en el crecimiento de un microorganismo. El alumno conocer, distinguir y aplicar los principios de los diferentes sistemas de cultivo. El alumno diferenciar los distintos mtodos para la recuperacin de metabolitos 1.- Mtodos para evaluar el crecimiento microbiano. Los microorganismos pueden crecer bajo una variedad de condiciones fsicas, qumicas y nutricionales muy diversas. En un medio nutritivo, los microorganismos extraen nutrientes a partir del medio y convierten estos en compuestos biolgicos. Parte de estos nutrientes son usados para biosntesis y formacin de producto. El crecimiento de cualquier sistema biolgico se define como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisn celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. Debido a la complejidad de fenmenos e interacciones involucradas en la cintica de poblaciones celulares, se deben manejar diversas suposiciones para obtener modelos que describan aceptablemente el comportamiento de una poblacin celular, ya que un modelo demasiado realista puede contener parmetros los cuales sean difciles de determinar.

Para un mejor entendimiento de la cintica de crecimiento iniciemos por mencionar los diversos mtodos empleados para cuantificar el crecimiento celular. La seleccin del mtodo

depender del objetivo de la medicin, ya que en ocasiones el medio para el crecimiento y la formacin de producto pueden ser muy complejos, dificultando el uso de mtodos directos, sobre todo en la presencia de slidos suspendidos. 1.1 Determinacin del nmero de microorganismos. 1.1.1 Mtodos directos. 1. Hemacitmetro. Tambin conocido como placa de Petroff-Hausser o cmara de Neubauer. Se utiliza para el conteo celular directo, en medios preferentemente claros y libres de partculas, colorantes (soluciones de azul de metileno, etc) son utilizados para distinguir clulas vivas de clulas muertas. No se recomienda para cultivos que forman agregados celulares. Este mtodo se recomienda para organismos de dimetros menores a 3 m.

Figura 1. Esquema de un hematocitmetro. 2. Contador de partculas. Basado en la relativa alta resistencia elctrica de las clulas. Los contadores comerciales usan dos electrdos y una solucin electroltica, un electrdo se coloca en un tubo conteniendo un orificio; a continuacin se aplica vaco al tubo interior, provocando que la solucin de electrolito conteniendo clulas sea absorbida a travs del orificio. Un potencial elctrico se aplica a travs del orificio, la resistencia elctrica aumenta y causa pulsos en el voltaje elctrico. El nmero de pulsaciones es una medida del nmero de partculas; la concentracin de partculas se calcula considerando el volumen predeterminado de muestra. 1.1.2 Mtodos indirectos. 1. Cuenta viable en placa. El conteo de clulas viables se realiza en cajas Petri con medio de cultivo adecuado y gelificado con agar, que son inoculadas con la muestra e incubadas. La palabra "viable" describe a un microorganismo capaz de reproducirse. Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (UFC). Mtodo til para bacterias y levaduras, pero no en hongos. 2. Recuento sobre filtros. Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con
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un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

Figura 2. Esquema de un contador de partculas (Fuente: Bioprocess Engineering: Basic Concepts. Shuler and Kargi, Prentice Hall, 2002).

1.2 Determinacin de la concentracin de masa celular 1.2.1 Mtodos directos. En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas. 1. Peso celular seco. Es un mtodo que solamente se aplica a clulas creciendo en un medio libre de slidos. Las muestras con la biomasa son centrfugadas o filtradas, lavadas con solucin buffer o agua y secadas a 80C por 24 horas. 2. Volumen de empaque celular. Permite la estimacin de la concentracin celular en medios de fermentacin rpidamente; el medio es centrfugado en un tubo graduado bajo condiciones estndar (rpm y tiempo) y el volumen de clulas puede ser medido aproximadamente. 3. Determinacin de protena celular. Mtodo de Biuret, mtodo de Lowry, mtodo de Kjeldahl. 4. Determinacin de un componente celular caracterstico. El crecimiento microbiano se estima mediante la determinacin de componentes intracelulares tales como ARN, ADN, protenas, peptidoglucano, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos. Ejemplo, ATP basada en la reaccin: luciferina + O2 + ATP luz (uso de la enzima luciferasa). 1.2.2 Mtodos indirectos. 1. Densidad ptica. Se basa en la absorcin de luz de clulas suspendidas en un medio de cultivo;por lo que es necesario considerar los antecedentes de absorcin por componentes en el medio de cvultivo; el medio de cultivo debe estar esencialmente libre de partculas. Una curva de calibracin es necesaria para relacionar la densidad ptica contra el peso celular seco. Algunas

curvas de calibracin pueden desviarse del comportamiento lineal a valores de OD (densidad ptica) > 0.3 (ley de Lambert y Beer). 2. Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos. 3. Nefelometra. El nmero de partculas en solucin puede determinarse a partir de mediciones de la intensidad de la luz dispersada con la ayuda de un fototubo (nefelometra); la luz pasa a travs de una muestra del cultivo y un fototubo mide la luz dispersada por las clulas en la muestra. La intensidad de la luz dispersada es proporcional a la concentracin celular. 4. Determinacin de factores fisicoqumicos. Mediciones de viscosidad, evolucin del calor, etc. El crecimiento celular se relaciona con algunos componentes como ADN, ARN y protenas como se muestra en la siguiente figura 3.

Figura 3. Cintica de crecimiento celular y cambio de la composicin macromolecular.

Si se considera la curva del nmero de clulas por mililitro, que comnmente se utiliza para establecer una cintica de crecimiento microbiano, en esta curva se distingue tres fases

importantes: la fase lag, la fase log y la fase estacionaria. La primera de llas, en la cual el nmero de clulas permanece prcticamente constante, se observa que la cantidad de ARN por unidad de peso aumenta al igual que el peso por cada clula, lo que indica que la clula de manera individual est aumentando de tamao y conjuntamente est preparando la maquinaria biosinttica para iniciar un crecimiento sostenido. El aumenta de ARN indica un aumento de la snteis de protenas y enzimas. En esta etapa sin embargo la cantidad de ADN por unidad de peso disminuye, lo que indica que dentro de cada clula se mantiene constante. Una vez que se inicia la fase log, aumento del nmero de clulas, los tres factores mencionados permanecen constantes, lo que indica un crecimiento balanceado. Finalmente, en la etapa final de la fase log, se observa una vez mas cambios en la relacin de ARN, ADN y peso celular individual, indicando que las clulas se preparan para entrar en una etapa de crecimiento lento, posteriromente en la fase estacionaria la clulas regresan a la condicin inicial de la cintica de crecimiento.

2.- Formulacin y esterilizacin de medios de cultivo. 2.1 Formulacin de medios de cultivo. Para hacer la formulacin de un medio de cultivo cuando no setiene un conocimiento previo de las necesidades del microorganismos o cuando se quiere conocer la cantidad de los nutrientes necesarios para asegurar que se tendra la cantidad de sustratos necesarios para la biosnteisis de metabolitos es conveniente realizar clculos de las cantidades necesarias en base a la estequiometra del crecimeitno celular, sobretodo considerando la fuente de carbono. 2.1.1 Estequiometra del crecimiento celular. La conversin microbiolgica de carbohidratos (fuente comnmente utilizada como fuente de carbono) para obtener biomasa y productos de inters industrial es tema siempre actual, debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulacin de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operacin de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo inters poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energa resultan tiles para este fin. La produccin de biomasa (biomasa = concentracin de microorganismos expresada en gramos de clulas secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de carbono y energa, de nitrgeno y de oxgeno, y la produccin de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas para plantear y calcular balances de materia y energa.

2.1.1.1 Frmula mnima. En primer lugar se ha encontrado que la composicin elemental de un importante nmero de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se mantiene prcticamente constante;
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as podemos definir un microorganismo promedio (composicin estndar) como aquel cuya composicin es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el aproximadamente 5 % restante est representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composicin elemental promedio de la biomasa se mantiene prcticamente constante, la concentracin intracelular de protenas, ARN y dems constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estadios del cultivo de un mismo microorganismo. Teniendo en cuenta esta composicin media, podemos escribir lo que sera la frmula mnima de nuestro microorganismo promedio como C H1,79O0,5N0,2 (en la que est representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines meramente prcticos definir 1 C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene 1 tomo gramo de C. As pues tenemos que:
1 C - mol de biomasa = 12 + 1,79 + 16 x 0,5 + 14 x 0,2 = 25,8 g 0,95

Si x es la fraccin de C en la biomasa, para el microorganismo promedio se tiene que x = 0,465. De forma anloga se puede definir 1 C-mol de sustrato (entindase por sustrato la fuente de carbono y energa), 1 C-mol de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 Cmol de glucosa estar representado por CH2O y su peso es 30 g. Para el etanol, 1 C-mol de etanol (CH3O0,5) pesa 23 g. En general para un compuesto de la forma CnHpOqNm, 1 C-mol estar representado por CHp/nOq/nNm/n. Ahora bien, el crecimiento de un microorganismo lo podemos definir como la siguiente reaccin qumica, donde se considera que la fuente de nitrgeno es amonaco o una sal de amonio y es un organismo aerobio: CH s1O s 2 + a NH 3 + b O 2 y x / s CH b1O b 2 N b 3 + y p / s CH p1O p 2 N p 3 + y CO 2 / s CO 2 + w H 2 O + q (calor)
Sustrato Biomasa Producto

Debe notarse que en esta ecuacin todos los coeficientes estequiomtricos estn referidos a 1 C-mol de fuente de carbono y energa (fuente C y E). El valor de yx/s representa los C-moles de biomasa formados por cada C-mol de sustrato consumido, yp/s representa los C-moles de producto formados por cada C-mol de sustrato consumido, yCO2/s representa los moles de bixido de carbono formados por cada C-mol de sustrato consumido, a es el nmero de moles de la fuente de nitrgeno consumidos por cada C-mol de sustrato consumido, b es el nmero de moles de oxgeno (O2) consumidos por cada C-mol de sustrato consumido, w es el nmero de moles de agua formados por cada C-mol de sustrato consumido. Los rendimientos (ys) son importantes en los procesos de fermentacin como una medida de la eficiencia con que se produce un compuesto de inters. El rendimiento generalmente se define como g de producto/g de sustrato consumido, y se utiliza la letra Y. As por ejemplo, para los casos citados previamente se tiene que: Yx/s representa el rendimiento de biomasa en base a sustrato, esto es, la cantidad en gramos de biomasa formada por gramo de sustrato consumido. Yp/s representa el rendimiento de producto en base a sustrato, esto es, la cantidad en gramos de producto formado por gramo de sustrato consumido.

YCO2/s representa el rendimiento de bixido de carbono en base a sustrato, esto es, la cantidad en gramos de bixido de carbono formado por gramo de sustrato consumido. 2.1.1.2 Grado de reduccin. Otro concepto importante es el de grado de reduccin o grado de reductancia, que es de gran utilidad para plantear balances de materia y energa. El grado de reduccin se puede definir como el nmero de electrones que son transferidos al oxidar un compuesto, y se representan por . Para aclarar el concepto de grado de reduccin consideremos el caso de la oxidacin del etanol con oxgeno hasta CO2 y H2O. La ecuacin qumica que representa la reaccin es, donde se utiliza 1 C-mol de etanol: CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O Donde el nmero de electrones que intervienen en la reaccin son 1,5X2X2=6; 1,5 es el nmero de moles de oxgeno (O2) que se consumen para oxidar el compuesto hasta CO2, 2 es el nmero de electrones que tiene un tomo de oxgeno y 2 es el nmero de oxgenos en una molcula de oxgeno. Por tanto, el grado de reduccin del etanol es 6, = 6. En la siguiente tabla se muestra el caso para varios compuestos.

Los distintos valores de que figuran en cada ecuacin coinciden con el nmero de electrones disponibles que fueron transferidos desde el compuesto a oxidar al oxgeno. En general se expresa en trminos de nmero de electrones disponibles / C-mol de compuesto. En general, para calcular el valor de de un determinado compuesto se consideran que los grados de reduccin son: 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el caso del CO2, H2O y NH3 no se tienen electrones disponibles (estados de referencia), luego CO2 = H2O = NH3 = 0. Se considera adems que el estado de oxidacin predominante del N en la biomasa es -3. En trminos generales para un compuesto de frmula CHaObNc, su grado de reduccin vendr dado por:

 = 4 + a - 2b - 3c Si tenemos un compuesto cuya frmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la forma

CH i O j N k
h h h

Si tomamos como ejemplo a nuestro microorganismo promedio su x (donde el subndice x indica biomasa) ser: e - disp. x = 4,19 C - mol En el cultivo de microorganismo hay desprendimiento de calor por reaccin de oxidacin con el oxgeno, y este calor por mol de electrones transferidos al oxgeno es relativamente constante para la oxidacin de una amplia variedad de molculas orgnicas y corresponde a 27 Kcal/mol electrones disponibles transferidos al oxgeno (O2). Planteando un balance de materia y energa para un microorganismo creciendo en un cultivo que est representado por la reaccin qumica simple.
CH s1O s 2 + a NH 3 + b O 2 y x / s CH b1O b 2 N b 3 + y p / s CH p1O p 2 N p 3 + y CO 2 / s CO 2 + w H 2 O + q(calor)
(1)

Balance de carbono:

y x/s + y p/s + y CO 2 / s = 1

(2)

Balance del grado de reduccin:

s + (-4)b = yx/s . x + yp/s . p (3)

Reordenando y dividiendo por s obtenemos 4b + y x/s . x + y p/s . p =1

(5) (4)

s
o lo que es lo mismo

++=1

Donde

s y . = x/s x s y p/s . p = s

4b

(fraccin de e- disponibles del sustrato transferidos al O2) (fraccin de e- disp. del s transferidos a la biomasa) (fraccin de e- disp. del s transferidos al producto)

Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservacin de la masa y la energa, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos ms carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos. Si asumimos, como ya se mencion, que el calor de reaccin por mol de electrones disponibles transferidos al oxgeno es constante para un importante nmero de molculas orgnicas (qo = 27 Kcal/mol electrones disponibles transferidos al O2), el calor generado en la ecuacin est dado por: q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato (6)

Si se conoce la velocidad de consumo de O2 del cultivo, se puede calcular la velocidad de produccin de calor y por lo tanto, los requerimientos de H2O de enfriamiento para mantener constante la temperatura del biorreactor.

El concepto de electrones disponibles brinda un mtodo simple de clculo para verificar los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en llamar anlisis de consistencia interna. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o (5) con datos obtenidos en el laboratorio, se pueden estimar parmetros no medidos y tener idea de cun confiables fueron las determinaciones. Medidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos: 0,94 yx/s + yp/s + yCO2/s 1,06 0,93 + + 1,07 Valores inferiores o superiores a estos lmites de aceptabilidad determinados estadsticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones experimentales. En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificacin de la biomasa producida se efecta gravimtricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa expresado en g/L (x) correspondiente a la utilizacin de una determinada cantidad de sustrato (s) (igualmente x expresada en g/L) con lo cual se define el rendimiento en base a sustrato como Yx/s = al que s tomamos como rendimiento global en el que slo se tienen en cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y sustrato. Para calcular los valores de yx/s, yp/s, y yCO2/s conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de x, s, p y CO2 se utilizan las relaciones: y x/s = Yx/s

p x ; y p/s = YP / s ; y CO S S

2 /s

= YCO 2 / s

CO S

(7)

Resulta de gran inters conocer los destinos que toma la fuente de C y energa durante el crecimiento microbiano y la fraccin de la misma empleada por el microorganismo para obtener la energa necesaria para llevar adelante sus funciones metablicas. Para lo cual, por el balance de sustrato:
S = Sx + Sp + SE (8)

donde S = Sustrato total consumido Sx = Fraccin de sustrato utilizado en la formacin de biomasa Sp = Fraccin de sustrato utilizado en la formacin de producto SE = Fraccin de sustrato utilizado para obtener energa Por otro lado, se debe cumplir que: - Sx s = X x (9)

Sp s = P p por consiguiente:
SE = S - Sx - Sp SE = S + X ..

(10)

x P + P. s s
fE : Fraccin de fuente de carbono y energa (FCE)

fE =

S E x p = 1 Yx/s Yp/s s s S

destinada a la obtencin de energa. fE = 1 - yx/s - yp/s = y CO2 / s (11)

Experimentalmente lo que se hace es determinar la produccin global de CO2, conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido, se calcula SE por estequiometra. Este mtodo presenta dos inconvenientes: en primer lugar existen reacciones enzimticas que incorporan O2 a determinados componentes celulares (O2 que no es empleado para obtener energa) no obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para oxidar la fuente de carbono y de energa; y el ms importante es que debemos suponer que x s, caso contrario se introduce un gran error en el clculo. Hasta aqu los balances planteados por el mtodo de electrones disponibles consideran el caso particular de formacin de biomasa y producto cuando la fuente de N es NH3. Ahora bien, qu sucede cuando sta no es NH3? Lo que se hace en este caso es modificar los estados de referencia para que en los balances: CO2 = H 2 O = fte.de N = 0 con lo cual estamos estableciendo un "grado de reduccin generalizado". Tomemos: Biomasa = C H a1 O b1 N c1 Sustrato = C H a 2 O b 2 N c2 Producto = C H a 3 O b 3 N c3 Fuente de N = C d 4 H a 4 O b 4 N c4 Se definen los i generalizados como: x = 4 + a1 - 2 b1 -

C1 ( 4d 4 + a 4 2 b 4 ) C4

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s = 4 + a2 -2 b2 -

C2 ( 4d 4 + a 4 2 b 4 ) C4 C3 ( 4d 4 + a 4 2 b 4 ) C4

p = 4 + a3 - 2 b 3 -

N =4+

C d a4 b a b 2 4 4 4 4 + 4 2 4 d4 d 4 C4 d 4 d 4 d4

2.2 Esterilizacin de medios de cultivo. Muchas fermentaciones industriales se desarrollan con cultivos puros con cepas seleccionadas. Si se tiene la presencia de microorganismos ajenos en el medio de cultivo, as como en algunas partes del equipo, estos microorganismos pueden competir por los nutrientes limitantes. Los microorganismos extraos pueden generar productos que limiten el crecimiento de los organismos productores. Por lo tanto, antes de arrancar una fermentacin, el medio y todo el equipo relacionado debe ser liberado de organismos vivos, en otras palabras, debe ser esterilizado y posteriormente se debe cuidar el entorno asptico durante el desarrollo del proceso. Por esterilizacin se entiende la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se realiza por medios fsicos (filtracin, calor), por medios qumicos u otra va. Esta definicin excluye cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a los microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo. Para una operacin econmica, en virtualmente todos los procesos de fermentacin es obligatorio tener en todas las etapas del proceso a los cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar (matraz de propagacin) hasta el fermentador de produccin. Un biorreactor puede ser esterilizado, destruyendo los microorganismos con algn agente letal como calor, radiacin o un producto qumico o separando los organismos viables mediante un procedimiento fsico como la filtracin. 2.2.1 Mtodos de esterilizacin. La esterilizacin se puede llevar a cabo por tres diferentes mtodos: qumicos, y fsicos. 2.2.1.1 Mtodos Qumicos. Es el uso de un compuesto qumico letal para los microorganismos. Por ejemplo, el oxido de etileno y el glutaraldehdo son agentes esterilizantes. Oxido de etileno: es un lquido que hierve a 10.7C, que acta inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfhdrilos (R-SH) mediante una reaccin llamada alquilacin (RS-CH2CH2O-H). Se usa en la industria para la esterilizacin para objetos de plstico (cajas Petri, jeringas) que se funden a temperaturas menores a 100 C. Debido a su alto poder de penetracin, estos objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. Glutaraldehdo: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.

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2.2.1.2 Mtodos Fsicos. Son aquellos que involucran a radiacin ionizante, filtracin y calor. a) Radiacin ionizante. La radiacin ionizante es altamente letal, al destruir molculas vitales de los microorganismos, lo que se consigue sin producir calor. La mayora de los daos son a nivel ADN. Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistente. En general la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son an ms resistentes que las bacterias a la radiacin. a.1 Radiacin UV. Luz ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin de la luz UV son susceptibles de ser destruidos. Se utiliza para sanear el aire, esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. a.2 Rayos gamma. Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas por ciertos istopos radiactivos (Co60), pero son difciles de controlar ya que este istopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y despus esterilizar. a.3 Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones). Se usan para esterilizar material quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar despus de empaquetado (ya que stas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente. b) Separacin mecnica de los organismos. Son posibles alternativas como la centrifugacin, adsorcin a intercambiadores inicos, adsorcin sobre carbn activado o filtracin. La filtracin es el nico mtodo en uso prctico. La esterilizacin por filtracin se utiliza frecuentemente para componentes, en solucin, sensibles al calor, que seran desnaturalizados durante el proceso de esterilizacin por vapor. Las vitaminas, los antibiticos o los componentes de la sangre son ejemplos de compuestos lbiles al calor que deben ser esterilizados por filtracin con membranas de 22 m que impiden el paso de microorganismos e incluso virus. Dos desventajas de la filtracin son: 1) ciertos componentes de la soluciones de nutrientes pueden ser adsorbidos sobre el material del filtro, y 2) debe ser utilizada una presin fuerte (de hasta 5 bar) que es indeseable en la prctica industrial. Una manera de economizar es la filtracin solamente del agua utilizada en la preparacin del medio de cultivo. Por ejemplo, en el proceso de bioconversin de esteroides se esteriliza una solucin concentrada de nutrientes mediante calor en el fermentador y luego se diluye con agua que ha sido esterilizada por filtracin. c) Tratamiento trmico. Los microorganismos mueren rpidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a su ptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminar microorganismos por termodestruccin. Los mtodos basados en el calor son quiz los ms utilizados para controlar el crecimiento microbiano en los sistemas de fermentacin. Por este motivo, a continuacin se describen ecuaciones que permiten calcular tiempos y condiciones para lograr la esterilidad de un medio de cultivo.

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2.2.2 Cintica de muerte microbiana. El proceso trmico de la destruccin de una poblacin microbiana, generalmente, sigue una cintica de primer orden. 2.2.2.1 La velocidad de muerte logartmica puede expresarse por: dN =kN (1) dt donde: N - concentracin de microorganismos viables k - constante de velocidad especfica de muerte (min-1) t tiempo (min) N = -k t No Integrando la ecuacin (1), con la condicin N = No a t = to (2)

ln

o N = No e - k t (3) Donde No es la concentracin de organismos viables al tiempo to La ecuacin (3) es ms representativa para clulas vegetativas. El valor absoluto de k es una medida de la resistencia trmica del microorganismo, es decir conforme k tiende a cero, la resistencia trmica es mayor. Grficamente la cintica de velocidad de muerte logartmica se puede representar por:

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Figura 1. Datos tpicos de velocidad de muerte para clulas vegetativas (E. coli) Cuando un medio de fermentacin es esterilizado, la concentracin y el tipo de contaminacin microbiana no puede conocerse con precisin absoluta, sin embargo la resistencia relativa de diferentes tipos de microorganismos puede servir como referencia para el diseo de ciclos de esterilizacin. La resistencia relativa de algunos microorganismos es presentada en el cuadro 1. Cuadro 1. Resistencia relativa de varios microorganismos al calor Resistencia relativa Bacterias vegetativas y levaduras 1.0 Esporas bacterianas 3 x 106 Esporas de hongos 2 - 10 Virus y bacterifagos 1 - 5 2.2.2.2 Efecto de la temperatura sobre la cintica de la muerte Por analoga con reacciones qumicas se puede establecer que la constante de cintica de muerte, muestran una dependencia de la temperatura del tipo Arrhenius: k = A e E / RT (8) donde: k - constante especfica de velocidad de muerte (min-1) A - factor pre-exponencial (min-1) E - energa de activacin de muerte (cal / mol) R - constante de los gases (cal / mol -K) T - temperatura absoluta ( K)

Figura 2. Dependencia de la muerte microbiana de la temperatura Donde la pendiente es una medida de la susceptibilidad del microorganismo al calor. Energa de activacin ( E):

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Normalmente los valores de la energa de activacin (E) asociados con la destruccin o muerte microbiana son bastantes altos comparados con los de inactivacin trmica de compuestos qumicos constituyentes de medios de fermentacin tales como vitaminas, etc. (Cuadro 2). Cuadro 2. Valores tpicos para energas de activacin y parmetro pre exponencial A (min-1) E (cal / mol) Acido flico 16,800 --Alcohol d - pantotenilico 21,000 --Cianocobalamina 23,100 --Tiamina HCl 22,000 --B. stearothermophilus (esporas) 67,700 4.93 1037 B. subtilis (esporas) 76,000 9.50 1037 --Cl. botulinum (esporas) 82,000 --Anaerobio putrefactivo NCA 3679 72,400 Cl. sporogenes 68,700 1.66 1038 Clulas vegetativas 20000 (mximo) 1.20 1021 Como ejemplo, al analizar el efecto de la temperatura al pretender alcanzar un nivel deseado de esterilidad para un medio de fermentacin y el anlisis del efecto de la temperatura en la destruccin de una vitamina en el medio. Los valores de energa de activacin sugieren que un incremento en la temperatura drstico tiene un efecto significativo en la destruccin de algunos compuestos qumicos en el medio. La figura 3 muestra que lo mas deseable es un uso de temperatura alta y tiempo corto para esterilizar medios conteniendo tiamina y de Bacillus stearothermophilus. Tiamina: Temperatura = 102C Constante de velocidad especfica de descomposicin (k) = 0.014 min-1 Energa de activacin (E) = 22,000 cal/mol Bacillus stearothermophilus: Temperatura = 125C Constante de velocidad especfica de descomposicin (k) = 0.07 min-1 Energa de activacin (E) = 67,700 cal/mol

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Figura 3. Grfica tipo Arrhenius para esporas de Bacillus stearothermophilus y tiamina. As para un nivel de esterilidad de N / No = 10-16. Temperatura de Tiempo requerido para Prdida de tiamina -16 esterilizacin mantener N / No = 10 (%) (C) (min) 100 843 99.99 110 75 89 120 7.6 27 130 0.851 10 140 0.107 3 150 0.015 1 Cuando el log del nmero de sobrevivientes es menor a cero se habla de probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto, para un valor de probabilidad igual a -1, indica que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o correctamente expresado una unidad contaminada por cada 10 unidades idnticas procesadas. Un producto se considera estril cuando la probabilidad de encontrar unidades contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada milln de unidades idnticas procesadas. La relacin de Arrhenius ha sido observada solamente para cultivos puros. Las poblaciones que existen normalmente en soluciones no estriles son generalmente cultivos mixtos no homogneos que contienen organismos de resistencia variable al calor. La velocidad de destruccin por consiguiente no es una lnea recta sino una curva como se muestra en la figura 4 para un cultivo que consta de dos cepas.

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Figura 4. Curva de muerte de un cultivo mixto. Las lneas rectas A y B indican las velocidades de muerte de ambos cultivos puros. Durante la fermentacin deben ser observados tres puntos para asegurar la esterilidad: - Esterilidad en el medio de cultivo - Esterilidad del aire que entra y que sale - Construccin apropiada del biorreactor para su esterilizacin y para la prevencin de la contaminacin durante la fermentacin. 2.2.2.3 Tiempo de reduccin decimal (D). El tiempo de reduccin decimal o valor D, es el tiempo requerido para reducir un 90% la poblacin de un microorganismo determinado a una temperatura especfica (o, bien, para que el logaritmo del nmero de supervivientes se reduzca en una unidad). Matemticamente N 1 1 = ; ln = - kD 10 No 10 D = 2.303 k

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Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestruccin (Dt) vara para cada temperatura (de ah el subndice t), es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiolgicas. El medio en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al calor. Por lo general, los microorganismos son ms sensibles a las altas temperaturas cuando se encuentran a pHs cidos, mientras que las concentraciones altas de protenas o azcares en el medio disminuyen la efectividad del calor y protegen a las bacterias. Las altas concentraciones de sal tienen efectos variables segn el tipo de microorganismo. 2.2.2.4 Valor z o constante de resistencia trmica. Se define como la diferencia en temperaturas necesaria para causar una reduccin de un 90% en el valor D. Observe que el valor z es un valor caracterstico de cada microorganismo. El valor z describe adems la resistencia trmica de las esporas de las bacterias. Para calcular el valor Z, se grafican los valores D a diferentes temperaturas para un cultivo especfico de un microorganismo. Como se ilustra en la figura a continuacin, el valor z es la diferencia de las temperaturas que definen un cambio en el ciclo logartmico.

2.2.2.5 Valor F o Tiempo de muerte por tratamiento trmico. El tiempo de muerte por tratamiento trmico, mejor conocido como valor F, es el tiempo que se requiere para causar una reduccin especfica de una poblacin de un microorganismo a una temperatura dada. Este tiempo se puede expresar en minutos o como un mltiplo del valor D. Por ejemplo, para una reduccin del 90% de la poblacin, el valor F ser igual al valor D. Para una reduccin del 99% de la poblacin microbiana, el valor F ser igual a 2D. Por ejemplo Para una reduccin en la El valor F ser igual a poblacin microbiana de 90 % D 99 % 2D 99.9 % 3D El valor de F se puede expresar en funcin de D, de acuerdo a la informacin anterior, por lo que: F=nD donde n es el nmero de reducciones decimales en la poblacin microbiana. En ocasiones, el valor F se escribe con un subndice y un superndice que representan la temperatura y el valor z, tal como se ilustra a continuacin: F110 18 FTz
18

F tiene el subndice "T", que indica la temperatura de tratamiento, 110C, y el superndice "z", identifica el valor de z, 18C. Cuando F es igual a 4D, indica que en el tiempo de tratamiento F, la poblacin microbiana se reducir en un 99.99%. Por ejemplo, si para un microorganismo el valor de D fuera de 5 minutos y la poblacin microbiana un milln de clulas por mL, entonces se requieren 20 minutos para reducir la poblacin al orden de 100 clulas por mL. En los procesos de pasteurizacin y esterilizacin, la determinacin del valor D y los clculos del valor F se hacen asumiendo que se reduce la poblacin del microorganismo contaminante ms resistente, por lo que para un tratamiento particular se reducir tambin en igual o mayor grado la poblacin de otros microorganismos menos resistentes. El smbolo F0 se utiliza para indicar que el tiempo de tratamiento trmico a 121C. Y es til para comparar tiempos de exposicin equivalente a 121C, pero realizados a temperaturas diferentes, para su clculo se considera un microorganismo ideal con un valor z igual a 10.

F0 = t10

T 121) z

Donde t es el intervalo de tiempo entre las mediciones de la temperatura T T es la temperatura de esterilizacin al tiempo T z es igual a 10 Por ejemplo, un tratamiento trmico a 111C durante 15 minutos,

F0 = 15( 10 ) 10 = 1.5 min equivaldra a un tratamiento de 1.5 minutos a 121C. Si ahora se considera un tratamiento a 124C durante 15 minutos, se tiene F0 = 15( 10 ) 10 = 29 min que indica un tratamiento similar al obtenido a 121C durante 29 minutos.
2.2.2.6 Razn de Letalidad. La razn de letalidad se define como el cociente entre dos tiempos de muerte por tratamiento trmico a diferentes temperaturas. El valor numrico de dicho cociente est dado por la siguiente expresin:
( 124121 )

111121 )

Utilizando esta frmula, se puede aproximar cuanto tiempo se requiere (FT1) para procesar un medio a una temperatura (T1) y reducir la poblacin microbiana de la misma forma que se hace con un proceso de tiempo conocido (FT2) a una temperatura especfica (T2). Es necesario conocer el valor de z para el microorganismo particular en que se hace la reduccin de poblacin. El concepto de tiempo de muerte por tratamiento trmico (valor F) est basado en la premisa que el tratamiento trmico se efectuar a una temperatura fija. El proceso que se asume en esta premisa est ilustrado en la grfica que sigue a continuacin:

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Sin embargo, en la realidad, los procesos de tratamiento trmico no alcanzan una temperatura de procesamiento de forma instantnea. El incremento de temperatura es algo ms paulatino, tal como se ilustra en la figura a continuacin.

Para hacer cmputos de un valor F equivalente (con una temperatura fija) que asemeje a los procesos reales, se suele subdividir la grfica del proceso (temperatura vs tiempo) en intervalos de tiempo reducidos en los cuales se asume una fija temperatura, tal como se ilustra a continuacin. Entonces se proyectan los tiempos de procesamiento de cada rectngulo a la temperatura caracterstica del proceso utilizando la frmula de la razn de letalidad.

2.2.3 Esterilizacin del medio de cultivo. El medio nutritivo que se prepara inicialmente contiene una variedad de clulas vegetativas diferentes y de esporas, derivadas de los constituyentes del medio, del agua y del recipiente. Estos deben ser eliminados por un procedimiento adecuado antes de la inoculacin. Existen un conjunto de procedimientos para la esterilizacin, pero en la prctica para instalaciones a gran escala, el calor es el principal mecanismo utilizado. Un conjunto de factores influyen en el xito de la esterilizacin por calor: el nmero y tipo de microorganismos presentes, la composicin del medio de cultivo, el valor del pH y el tamao de las partculas en suspensin. Las clulas vegetativas son eliminadas rpidamente a temperaturas relativamente bajas, como se muestra en la Figura 1, pero para la destruccin de las esporas se necesitan temperaturas de 121C.

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Las esporas de Bacillus stearothermophilus son las ms resistentes al calor. Por consiguiente son utilizadas como organismos de ensayo para probar los distintos procedimientos utilizados para esterilizar el equipo. El cuadro 3 proporciona datos sobre la relacin entre temperatura y el valor k. En el cuadro 4 se da una lista de tiempos de esterilizacin y temperaturas para varios organismos. Cuadro 3. Relacin entre temperatura y valores k en Bacillus stearothermophilus. T(C) 100 115 118 131 130 140 150 -1 k (min ) 0.019 0.666 1.307 2.538 17.524 135.9 956.1 Cuadro 4. Tiempo de esterilizacin y temperatura de esterilizacin de microorganismos. Clulas Clulas vegetativas Esporas de Hongos/levaduras Esporas de Streptomyces Esporas bacterianas En general Esporas de B. stearothermophilus Tiempo de esterilizacin (min) 5-10 15 5-10 5 15 Temperatura de esterilizacin (C) 60 80 60-80 121 121

3.- Cintica de crecimiento microbiano. Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado, donde se mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, nmero de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso (ver figura 3, fase log). M/M = N/N = [ADN]/[ADN] = [protenas]/[protenas] = ... = K As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una reaccin autocataltica de primer orden: velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente} Tambin se puede decir que el nmero de clulas, la masa celular u otros componentes se duplican cada determinado lapso de tiempo. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, porque todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es la velocidad especfica de crecimiento (), que es caracterstica para cada cepa bacteriana creciendo en un medio determinado y condiciones ambientales especficas. La curva tpica de crecimiento se presenta en la siguiente figura.

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Figura 4. Curva tpica de crecimiento para una poblacin bacteriana.

Como se puede apreciar, la curva de crecimiento presenta diferentes fases perfectamente definidas, las cuales se explican a continuacin : Fase lag: Tambin conocida como "fase de retardo", es una consecuencia del "choque" que sufren las clulas al encontrarse en ambiente nuevo. Los microorganismos reorganizan sus constituyentes moleculares y dependiendo de la composicin de los nutrientes, sintetizan nuevas enzimas; la sntesis de algunas otras enzimas es reprimida, etc. Mltiples fases lag pueden observarse cuando el medio contiene ms de una fuente de carbono. Fase log o de crecimiento exponencial: En esta fase, las clulas se multiplican rpidamente, y la masa celular y el nmero de microorganismos se incrementa exponencialmente con el tiempo. Este es un perodo de "crecimiento balanceado", esto es, todos los componentes de la clula crecen con la misma velocidad, esto es la composicin promedio de la clula permanece aproximadamente constante. La velocidad de crecimiento bacteriano durante la fase exponencial es de primer orden, y se puede representar por: dX = X X = X0 a t = 0 (1) dt la cual al integrarse origina X ln =t o X = X 0 e t (2) X0 donde: X = concentracin celular a tiempo t (g/L)

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Xo = concentracin celular a tiempo t (g/L) = velocidad especfica de crecimiento (t-1) Fase de desaceleracin: En esta fase, el crecimiento desacelera debido a la disminucin de uno o ms nutrientes esenciales o a la acumulacin de productos txicos al crecimiento. El rpido cambio del ambiente se traduce en un "crecimiento no balanceado" . Fase Estacionaria: En esta fase, la velocidad neta de crecimiento es cero (no existe divisin celular) o cuando la velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. La produccin de ciertos metabolitos es realizada durante la fase estacionaria, por ejemplo; antibiticos, hormonas, vitaminas, etc. Durante el desarrollo de la fase estacionaria uno o ms de los siguientes fenmenos tiene lugar: i) La concentracin total de masa celular permanece constante, pero el nmero de clulas viables puede decrecer ii) Lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable descender. Una segunda fase de crecimiento puede presentarse y las clulas crecer sobre los productos de la lisis (crecimiento tpico) iii) Las clulas pueden no estar creciendo pero pueden tener un metabolismo activo para producir metabolitos secundarios Durante la fase estacionaria, la clula cataboliza reservas celulares para generar nuevos bloques de construccin y monmeros para producir energa, a este fenmeno se denomina "metabolismo endgeno". La clula tambin puede gastar energa para mantener una membrana energizada y transportar nutrientes y para funciones metablicas esenciales tales como su movilidad y reparacin del dao a estructuras celulares, este gasto es llamado "energa de mantenimiento". Fase Declinacin o Muerte: Tambin conocida como "fase muerte", se da debido al agotamiento del medio o presencia de un veneno, la velocidad de muerte sigue una cintica de primer orden: dN = - k' d X o N = N s e - k' d t (3) dt donde: Ns = concentracin de clulas al final de la fase estacionaria k'd = constante de velocidad de muerte 3.1 Tiempo de duplicacin (td). Es el tiempo que se requiere para que el microorganismo incremente su poblacin al doble,esto es, el tiempo necesario para que se duplique una bacteria. A partir de la ecuacin (1): dX = X dt al integrar la ecuacin:

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td dX = dt X1 0 dt Si X2 = 2 X1, td= tiempo de duplicacin

X2

As : td = ln 2

0.693

(4)

3.2 Tiempo de generacin (tg). Para muchos propsitos en microbiologa es til conocer el tiempo de generacin de una poblacin durante el crecimiento exponencial, durante esta etapa de la curva de crecimiento, se deduce que el aumento de bacterias es una progresin geomtrica, existiendo una relacin directa entre el nmero de clulas presente en el momento inical y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial, de donde: N =N0 2n siendo: n = nmero de generaciones que ha ocurido durante el perodo de la fase exponencial. N = nmero de clulas al tiempo t. N0 = nmero de clulas al inicio de la fase exponencial. Para calcular el tiempo de generacin se emplea la ecuacin tg = t/n (6) donde: tg = tiempo de generacin t = tiempo de crecimiento transcurrido hasta el momento de la toma de muestra durante la fase exponencial. Para calcular el nmero de generaciones se puede emplear la expresin que se muestra a continuacin: (7) log N = log N0 + n log 2 n =(log N log N0)/log2 n=(log N log N0)/0.301 (8) (9) (5)

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