UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

PRACTICA N 3 NUMERACION DE COLIFORMES, DETERMINACION DEL NMERO MS PROBABLE ESTUDIANTE: LIPA MANRIQUE FERNANDO ANDR

CDIGO:

2011 - 111005

3er AO

PROFESORA:

Ing. AMELIA CASTRO GAMERO

AO ACADMICO 2013
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NUMERACION DE COLIFORMES, DETERMINACION DEL NUMERO MS PROBABLE

I.

OBJETIVO Realizar el recuento del nmero ms probable de microorganismos coliformes en la muestra. Verificar que los alimentos estn libres de enfermedades gastro intestinales.

II.

MATERIALES Y EQUIPOS Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la muestra de alimentos. Incubadora a 35-37C. Pipetas bacteriolgicas de 1ml. Aguja de inoculacin con alambre de micrn o platino-iridio. Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa (Caldo Brila), volmenes de 1ml. En tubos de 150x15mm. Contenido tubos de fermentacin invertidos (75x1mm). Agar-violeta cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar Endo o Agar Mc Conkey.

III. FUNDAMENTO TEORICO INTRODUCCION Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este Pgina 2

mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades. GENERALIDADES Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; encontrndose que mientras mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. Pgina 3

Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. colienterotoxignica (ETEC), E. colienteropatgena (EPEC), E. colienterohemorrgica (EHEC), E. colienteroinvasiva (EIEC), E. colienteroagregativa (EAEC) y E. colienteroadherente difusa (DAEC).

Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados FUNDAMENTO La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. Pgina 4

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes totales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Preparar las muestras de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado.

2. Pipetear 1ml de cada una de las diluciones del homogenizado de alimento en tubos de caldo verde brillante billis lactosa (Caldo Brila) utilizando tres tubos por dilucin.

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3. Incubar los tubos a 35-37C por 24-48 horas.

4. Anotar los tubos que muestren produccin de gas (Prueba Presuntiva).

5. De cada tubo que contiene gas, aislar sobre las placas con agar-violeta cristal-rojo neutrobilis (VRBA) o agar Endo.

6. Incubar a 35-37C por 24-48 horas. 7. Confirmar la presencia de bacterias Coliformes por: a) La formacin de colonias, rojo oscuro con dimetro mayor de 5mm. En agar VRBA. b) La formacin de colonias rojas rodeadas halo rojo en agar Endo.

8. Anotar el nmero de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP para expresar resultado.

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V.

RESULTADOS Luego revisar la cantidad de tubos que presentan gas en el tubo invertido se compararon con la tabla para nmero ms probable de bacterias (ver el anexo).

Dilucin Tubo Presencia de gas Cantidad de Tubos positivos

10-2 1 2 + + 3

3 +

10-3 1 2 - + 2

3 +

10-4 1 2 + 2

3 +

Resultado 2100 coliformes/g o ml

VI. DISCUSIN DE RESULTADOS No se tom en cuenta la dilucin 10-1 porque este siempre sale positivo para todos los tubos y se opt mejor por las tres diluciones siguientes consecutivas. De tomar los tubos positivos y realizar el cultivo en agar VRBA todas las placas presentaran colonias fucsias que indican la presencia de coliformes, por dicho motivo no se realiz dicha prueba por estar sobre entendido el resultado. Comparando el resultado con el valor permisible de bacterias coliformes en la leche que es 1000-10000 1000000/gr o ml. La muestra estudiada es aceptable para su consumo o industrializacin, previa pasteurizacin. Por la presencia de bacterias coliformes en la muestra de leche, no se descarta la presencia de coliformes fecales como el E. coli, por eso se debe realizar la prueba de INDOL para descartar tales microorganismos.

VII. CONCLUSIONES La muestra de leche fresca presenta, mediante la numeracin del nmero ms probable de coliformes, 2100 coliformes/gr o ml. Demostrando la ptima condicin de la leche, segn normas de control. La numeracin ms probable (NMP) es un mtodo al igual que las unidades formadoras de colonias (UFC) para determinar la cantidad de microorganismos presentes en una determinada muestra para asegurar su uso y consumo.

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VIII. BIBLIOGRAFIA http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totalesfecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml http://www.pomif.com/pages/practicas/micro_alimentos/analisis_alimentos/microor ganismos/nmp/recuento http://www.slideshare.net/egrandam/nmp-de-coliformes-totales-y-fecales

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ANEXO

para calcular el NMP de las diluciones mayores que las que sealan, multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de 10, 100, 1000, etc. por ejemplo, si se han seleccionado tubos provenientes de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, multiplicar por 10, si de las diluciones 10-3, 10-4, 10-5, multiplicar por 100.

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