NUTRICION MICROBIANA

Cursada 2004

INGENIERA BIOQUMICA I Cursada 2004 Trabajo Prctico N1

Regulacin de la expresin bacteriana por factores del entorno En la expresin de una clula, ya sea bacteria, hongo o clula animal celular intervienen dos tipos de efectores: efectores intracelulares y extracelulares. a) efectores intracelulares: se refiere a la informacin gentica que posee el microorganismo. La misma puede ser modificada por el agregado o extraccin de genes. b) efectores extracelulares: son los factores del entorno que pueden modificar la expresin. Estos se dividen en fsicos y qumicos fisicoqumicos: son los relacionados con las caractersticas del sistema de cultivo como agitacin, aeracin, formacin de espuma, nutrientes del medio de cultivo, pH, presin osmtica, estado redox y los parmetros fsicos como temperatura y presin. A travs de factores del entorno se puede optimizar o modificar la expresin de una clula logrando el aumento de produccin de biomasa o de algn producto en particular. Algunos ejemplos: En un cultivo de levaduras manejando el suministro de O 2 (efector externo qumico) puede optimizarse o bien la produccin de biomasa (levaduras de panificacin) o la produccin de alcohol etlico. Los cultivos de Aspergillus niger no deben estar limitados en Fe ni Mn para ser utilizados en la produccin de cido actico. En la obtencin de penicilina se logran altos niveles de de dicho antibitico cuando se utiliza cido fenil actico como inductor. Algunas bacterias (patgenas) expresan determinados antgenos segn la T, la presin osmtica, el pH y la composicin del medio de cultivo. clula

efectores externos fisicoqumicos

DNA

efectores internos
introduccin de genes que codifiquen para la produccin del compuesto de inters

T, pH Agitacin, presin osmtica componentes del medio de cultivo

expresin mejorada o modificada o o o mejoramiento de la produccin de algn componente de inters aumento de la velocidad de produccin evitar produccin de inhibidores

NUTRICION MICROBIANA La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para biosntesis y mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes: a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro (> 10 4 M) que estn representados por las fuentes de C, H, N, O, S, P, K y Mg ; b) Micronutrientes o elementos trazas (< 10 4 M) representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y c) Factores de crecimiento, que son generalmente componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica especifica , como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc.. Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en 1) medios sintticos o medios qumicamente definidos, tanto en cantidad como en calidad y 2) medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable. Tambin se pueden clasificar en medios mnimos, que contienen nicamente los nutrientes esenciales y medios ricos, que consisten en medios que contienen los nutrientes esenciales suplementados con otros nutrientes que puede actuar como fuentes alternativas de elementos (aminocidos, vitaminas, precursonres de cidos nucleicos) En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseo para tratar a continuacin la formulacin y optimizacin de los mismos. Diseo El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos.

Requerimientos nutricionales Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del CO 2 como las algas y algunas bacterias, heterotrfico que lo poseen organismos que necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencial esta determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. E1 O 2 es el oxidante mas comn en el metabolismo energtico. En la ausencia de ste, el NO 3-- SO42- son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Otras protistas obtienen su energa, en condiciones anaerobias por reaccin de oxido-reduccin realizadas sobre compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol de ser fuente de energa. Otro requerimiento nutricional esta constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. E] nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular. Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminoacidos, aunque tambin son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y D-asprtico para su incorporacin a la pared de la clulas. En algunos casos se requieren tambin peptidos de histidina. Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de fosfatos y sulfatos ( aminocidos azufrados). E1 fsforo se incorpora en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado para la sntesis de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes. Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del primero esta unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El ion K acta como coenzima y probablemente acta como catin en la estructura aninica de varios componentes celulares. El ion Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y acta como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras: a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, etc.. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. A veces es difcil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente est presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de estos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor ptimo. Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantotetico, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc..

En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, aparte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos especficos del proceso considerado. Un ejemplo es el caso de los precursores que constituye la base de una molcula que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el cido fenil actico para la produccin de penicilina. Otro ejemplo es el agregado de cloruros o bromuros en el caso de algunos antibiticos como cloro y bromotetraciclinas producidas por el Streptomyces aureofaciens. El agregado de sulfito, en el proceso de fermentacin alcohlica, que favorece la formacin de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento especifico. El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y evolucin de los parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracteriza do por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de amonio como fuente de nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como mas generalmente se hace, con agregados peridicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma mas conveniente mediante un control automtico de pH. El diseo de un medio especifico para la produccin de cido ctrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composicin; por lo tanto dicho medio debe disearse de manera tal que su preparacin (a partir de diversas materias primas) considere una eliminacin total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas. Disponibilidad de los componentes Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados por la clula. Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metlicos cuya concentracin es modificada por quelacion, ya que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminocidos, hidroxiacidos, hidrxidos, y los aniones fosfato y carbonato. Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de los iones metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico) o cido ctrico. En medios complejos de uso industrial la situacin es an mas complicada ya que existe una gran variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metlicos reduciendo la concentracin ionica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar: aminocidos, protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales. En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo su concentracin efectiva, como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que tienen los grupos reactivos R-COO-, RHN-, RS-, RO, que son los mas importantes. La dinmica de formacin del complejo est determinada por la constante de equilibrio de formacin del complejo metal-ligando, y por la velocidad a

la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio de la formacin de complejos es prcticamente independiente de la naturaleza del ligando, ya que depende particularmente del ion metlico. Se puede hacer una lista de trminos de valores decrecientes de la constante de equilibrio como sigue: Fe3+ > Cu2+ > Ni2+ > Co3+ > Zn2+ > Co2+ > Cd2+ > Fe2+ > Mn2+ > Mg2 = Ca2+ = Sr2+ > Ba2+ > Na+ > K+ y de la cual se puede deducir, por ejemplo, que el ion Cu2+ estar fundamentalmente como complejo mientras que Ca2+ Na+ y K+ estarn principalmente en forma de iones metlicos libres. Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene tambin una serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion: Sr2+ > Ca2+ > Zn2+ > Mn2+ > Fe2+ > Co2+ > Mg2+ > Ni2+. De ambas consideraciones surge por ejemplo que cuando se alcanza el equilibrio el ion Ca2+ estar casi siempre libre para ser utilizado y si esta complejado se har rapidamente disponible, en cambio el Mg2+ estar generalmente libre pero si esta complejado se har disponible muy lentamente. En la misma forma se puede deducir que el Co2+ estar fundamentalmente en forma complejada siendo disponible adems a muy baja velocidad. Por esa razn ese elemento es potencialmente limitante. En conclusin, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgnicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y sobre todo el ion metlico considerado, ya que la concentracin libre de este es lo que interesa. Materias primas fundamentales Los componentes empleados en la industrias de fermentacin son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composicin qumica. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de muchos productos obtenidos por fermentacin, se hace prioritario disminuir el costo de los medios. Las materias primas mas importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrogeno. Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidn, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros. Son muy importantes tambin por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. Tambin se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destileria, alpechin y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente tiles para procesos de produccin de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, tambin contienen muchas impurezas que impiden su utilizacin en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separacin y purificacin de los productos. Las fuentes de nitrgeno de naturaleza inorgnica mas comunes son el amoniaco o las sales de amonio. Las orgnicas estn representadas por varios productos, como ser: 1) Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas

por hidrlisis cida o enzimatica de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y animales, pescado, caseina, gelatina, harina de soja, algodn, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relacin enzima-sustrato y variando tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de la cadena de polipeptidos. Aparte de su funcin como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgnicas como fosfatos y suministran tambin algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura de la misma. 3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autlisis o plasmisis de la levadura, es bsicamente una mezcla de aminocidos, peptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y 5) Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz que tiene mucha importancia por su utilizacin como componente esencial de los medios para la produccin de varios antibiticos y enzimas. Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompaar a las distintas materias primas utilizadas. Formulacin La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximacin con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composicin de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composicin elemental y tpica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.51.0; Mg, 0.5-1. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados. La composicin de un medio mnimo basado en este principio, que adems tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de energa, figura el la tabla 3, que ha sido calculada por Pirt para la produccin de 10 g/l de Klebsiella aerogenes . Tabla 3. Composicin de un medio mnimo para Klebsiella aerogens (Adaptado de Pirt) Componente Glucosa NH4CI KH2PO4 MgSO4-7H20 CaCI2.2H20 FeSO4 7H20 MnSO4.4H20 ZnSO4-.7H20 CuS04.5H20 Elemento provisto/funcin Masa del Componente (g) C, Energa 22.7 N 4.37 P+K 1.13 S + Mg 0.232 Ca 0.011 Fe 0.007 Mn 0.002 Zn 0.002 Cu 0.0004

CoCl2.6H20 EDTA, Sal disdica dihidrato H2O (destilada)

Co Agente quelante

0.0004 0.394 1,000 ml

Por el conocimiento de la estequiometria de crecimiento y de formacin del producto, es posible formular adecuadamente un medio de cultivo. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentacin: Fuente de C + fuente de N + O2 + minerales + nutrientes especficos biomasa + productos + CO2 + H2O. Supongamos que queremos formular un medio para la produccin de biomasa de levadura de panificacin. En este caso se puede establecer la siguiente ecuacin basada en la estequiometria: 0-585 C12 H22 O12 (sacarosa)+ 3.205 O2 + 0.61 NH3 C3.72 H6 11 O1.95 N0.61 (biomasa) + 3.30 CO2 + 4.29 H2O + 387 Kcal. La ecuacin anterior representa as la formacin de 100 g de biomasa a partir de 200 g de sacarosa. Debe aclararse que en la frmula de la levadura que representa lo composicin centesimal de la misma faltan los elementos menores como el P, el S y el Mg por lo cual la suma no da 100 g sino 90.46. Es conveniente utilizar en lugar de la formula centesimal la correspondiente a la formula mnima que resulta de dividir el porcentaje de cada elemento por 3.72, o sea haciendo uno al carbono. En este caso se considera que toda la fuente de carbono se emplea para la formacin de biomasa y de CO 2 que se desprende sin formacin de otros productos . En la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras reacciones que incluyan productos y deducir de las mismas la cantidades de biomasa y productos que se pueden obtener a partir de una determinada cantidad de fuentes de carbono y de nitrgeno. Las otras fuentes de elementos menores y factores no son necesarios de incluir en las ecuaciones. Aplicando este criterio podemos establecer entonces que para obtener una determinada concentracin de biomasa, por ejemplo 30 gl-l, debemos formular el medio como mnimo con 60 g/l de fuentes de carbono asimilable, que es en el caso anterior la sacarosa. Con respecto a las fuentes de nitrgeno, esta debe estar en concentracin tal como para satisfacer la ecuacin anterior, que es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g, lo que representa 8.54 g de N 2. Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente fundamental a ser agregada. Del conocimiento de la composicin centesimal de otros componentes menores podemos establecer as las cantidades a agregar. Ahora bien, sabemos por otra parte que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina, cido pantotenico, etc. Esas vitaminas deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de produccin de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar con costos de produccin mnimos, es conveniente estudiar las fuentes de carbono, nitrgeno y de vitaminas y minerales mas econmicos y disponibles que podamos encontrar. Surge as la eleccin lgica de las melazas de caa de azcar o de remolacha que renen la mayor parte de las condiciones.

Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formacin de biomasa y producto y los valores de la energa de mantenimiento ser posible establecer los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio. Optimizacin Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacion de los medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes: 1) No existencia de informacin respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado. 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento. 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que pueden causar inhibicin del crecimiento. 4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formacin del producto. 5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales. La metodologa mas elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se varia la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante las concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de biomasa obtenida. Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el mtodo resulta poco practico. Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentracin de un componente dependa de los niveles de los otros, o sea, se produzca interaccin entre componentes. Se puede mejorar mucho la optimizacion en batch empleando tcnicas estadsticas o utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes. Utilizando cultivos continuos (tema que se vera en el desarrollo de este curso) es posible obtener un cultivo limitado por un solo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudindose conocer por lo tanto el efecto que su variacin ejerce sobre el cultivo al mantenerse los dems componentes constantes. En la fig. 1 se muestra la optimizacion de un medio lograda por el mtodo de los pulsos trabajando con un cultivo continuo y en el cual se grfica la variacin de la concentracin de biomasa en funcin del tiempo despus del pulso de un componente dado.

Figura 1. Optimizacin de medios de Fermentacin. 1. Nutriente no limitante. 2. Nutriente limitante. 3. Nutriente limitante a mayor concentracin. 4. Nutriente txico.

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Disponibilidad de nutrientes y estabilidad de los medios de cultivo Los nutrientes con los cuales se formulan los medios de cultivo deben estar disueltos para que los mismos se encuentren disponibles para ser utilizados por los microorganismos. Los medios de fermentacin utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo son slidos en suspensin, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilizacin pueden ser importantes. Las modificaciones pueden ser beneficiosas o perjudiciales . La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilizacin por calor, depender no solamente de la naturaleza de los componentes sino tambin de la temperatura, duracin del calentamiento, pH del medio y de la agitacin. De modo que la disponibilidad de los nutrientes puede modificarse tanto cuantitativamente como cualitativamente debido a reacciones entre componentes, antes, durante o despus de la esterilizacin. Algunos de los ejemplos son: Dentro de los macroelementos, los azcares pueden descomponerse por la accin del calor en presencia de sales inorgnicas y compuestos amnicos.
sales

sacarosa
H+

hidroliza

Los grupos carbonilos de los azcares con los grupos amino de las protenas, aminocidos, etc., dan productos de condensacin (reaccin de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amnico disponible. azcares reductores + -NH2 condensacin

Por este motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgnicos. La esterilizacin de los HPO4= utilizados como fuente de P y buffer, debe realizarse separada de las sales de Mg, Na, o K, ya que las sales de PO 4 con Mg y Na o Mg y NH 4 al calor poseen baja solubilidad, lo que disminuye la disponibilidad de todos los nutrientes mencionados. NaMgPO4 NH4MgPO4 KMgPO4 poseen baja solubilidad

El Fe puede precipitar, y por lo tanto no estar disponible cuando el medio no es suficientemente cido. Para aumentar su disponibilidad se usan quelantes que lo atrapan y lo mantienen disuelto (EDTA), o cido ctrico. Los aminocido, factores de crecimiento y vitaminas son lbiles al calor, por lo tanto se los prepara disolvindolos separadamente en pequeos volmenes de agua, en soluciones muy concentradas y luego se los esteriliza por filtracin. Finalmente se los incorpora a los medios de cultivo ya esterilizados (en general 1ml de solucin por cada litro de medio) en condiciones de asepsia. Si la fuente de N utilizada son sales de NH4+ se deben autoclavar a un pH menos que 7 para evitar su volatilizacin como NH3. Si sta es urea debe esterilizarse por filtracin ya que a pH

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bajos (cercanos a 5) por la accin del calor se descompone en NH 3 y CO2, no quedando disponible urea disuelta para ser utilizada por el microorganismo. Tiempo de esterilizacin: existen casos en los cuales si se prolonga la esterilizacin 50 a 60 min se producen perdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso. Preparacin de medios de cultivo: Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en fracciones separadas: fraccin 1: Fte. de C, micronutrientes, sales de Mg, Ca, etc. fraccin 2: Fte. de N en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtracin, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente. fraccin 3: Vitaminas. Se preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtracin. fraccin 4: Fosfatos, se esterilizan por calor.

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