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4.

MTODOS DE ENSAYO

La eleccin de los mtodos de ensayo para determinar la toxicidad de los vertidos objeto de estudio se realiz en base a su disponibilidad comercial en forma de kit miniaturizado, lo que facilita su implantacin en laboratorios no especializados, y a la existencia de normas de referencia sobre las que se apoyan. De este modo, en la Tabla 4 se presentan los mtodos elegidos con su norma de referencia correspondiente: Tabla 4. Mtodos de ensayo ENSAYO Toxicidad aguda en crustceo de agua dulce NORMA DE REFERENCIA ISO 6341 (1996)

Daphnia magna
Toxicidad aguda en crustceo de agua dulce

Thamnocephalus platyurus
Toxicidad aguda en crustceo de aguas salobres y saladas Artemia salina Toxicidad aguda en rotfero marino Brachionus plicatilis Inhibicin del crecimiento del alga de agua dulce

Thamnotoxkit. Protocolo estndar

Artoxkit M. Protocolo estndar ASTM E-1440-91 (2004) ISO 8692:2004

Selenastrum capricornutum
Ensayo de inhibicin de la bioluminiscencia sobre Vibrio

fischeri

ISO 11348-2:2007

A continuacin se describen brevemente cada uno de los ensayos de toxicidad que se llevaron a cabo: 4.1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN DAPHNIA MAGNA Se trata de un bioensayo rpido y simple para la evaluacin ecotoxicolgica de aguas residuales y lixiviados de residuos, as como para disoluciones de sustancias y preparados. Es uno de los ensayos estandarizados ms utilizados en toxicologa acutica de aguas continentales, ya que tiene una buena sensibilidad ante un elevado nmero de sustancias qumicas y es especialmente sensible frente a diversos metales.

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Figura 2. Daphnia Magna En este ensayo se obtiene una curva concentracin-efecto a partir de la cual se puede calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para los organismos de ensayo. Para ello, se emplean individuos juveniles del crustceo Daphnia magna procedentes de efipias de dicho organismo. As, tras la eclosin de estas efipias se seleccionan larvas de menos de 24 horas de vida, que se exponen por duplicado a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. La exposicin de los organismos a las distintas concentraciones de la muestra se lleva a cabo en frascos de vidrio o plstico de unos 60 ml de capacidad, durante un periodo de 24 h, a 20 2 C y en ausencia de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el nmero de larvas inmovilizadas para cada concentracin, para finalmente calcular la C(E)L50 mediante anlisis estadstico de los datos. 4.2. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN THAMNOCEPHALUS PLATYURUS Bioensayo rpido y simple para la evaluacin ecotoxicolgica de aguas residuales y lixiviados de residuos, as como para disoluciones de sustancias y preparados. La sensibilidad del crustceo de agua dulce Thamnocephalus platyurus es comparable a la de otros invertebrados de agua dulce, superndola a menudo. En este ensayo se obtiene una curva concentracin-efecto a partir de la cual se puede calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para los organismos de ensayo. Para ello, tras la eclosin de las efipias de este crustceo se obtienen individuos juveniles que se exponen, por triplicado, a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. Esta exposicin se realiza en placas de poliestireno de 24 pocillos, durante un periodo de 24 horas, a 251 C y en ausencia de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el nmero de larvas inmovilizadas en cada concentracin, y se calcula la C(E)L50 mediante anlisis estadstico de los datos.

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Figura 3. Thamnocephalus platyurus 4.3. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN ARTEMIA SALINA Bioensayo rpido, simple y econmico para la evaluacin ecotoxicolgica de aguas residuales y lixiviados de residuos, as como para disoluciones de sustancias y preparados, a travs de la exposicin del crustceo de agua salada y salobre Artemia salina.

Figura 4. Artemia salina Su objetivo, al igual que el de los dos ensayos anteriores, es obtener una curva concentracin-efecto a partir de la cual poder calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para estos pequeos organismos verstiles, pertenecientes al grupo de especies eurihalinas (se encuentran

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habitualmente en biotopos de elevada salinidad y son capaces de crecer y reproducirse tanto en aguas saladas como en salobres y dulces). Tras la eclosin de efipias de estos organismos, se seleccionan estadios larvales tempranos, generalmente II-III (ver Figura 5), y se exponen por triplicado a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. Esta exposicin se lleva a cabo en placas de poliestireno de 24 pocillos de 3 ml de capacidad, durante un periodo de 24 horas, a 251 C y en ausencia de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el nmero de larvas inmovilizadas en cada concentracin, y se calcula la C(E)L50 mediante anlisis estadstico de los datos.

Figura 5. Estadios de la Artemia Salina: nauplio (I), metanauplio (II), juvenil (III) y adulto (IV) 4.4. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA EN BRACHIONUS PLICATILI PLICATILIS S Bioensayo rpido, simple y econmico para la evaluacin toxicolgica de aguas residuales y lixiviados de residuos, as como para disoluciones de sustancias y preparados, a travs de la exposicin del rotfero de agua marina Brachionus plicatilis. El objetivo de este ensayo es obtener una curva concentracin-efecto a partir de la cual poder calcular la C(E)L50 aguda de la muestra para estos pequeos organismos marinos. Para ello, tras la eclosin de efipias se obtienen individuos juveniles que se exponen por sextuplicado, en grupos de 5 organismos, a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. La exposicin de los organismos a las distintas diluciones se lleva a cabo en placas de PVC de 36 pocillos de aproximadamente 1 ml de capacidad, durante un periodo de 24 horas, a 251 C y en ausencia

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de luz. Tras este periodo se cuenta y registra el nmero de larvas inmovilizadas en cada concentracin, y se calcula la C(E)L50 mediante anlisis estadstico de los datos.

Figura 6. Brachionus p plicatilis licatilis 4.5. ENSAYO DE INHIBICIN DEL CRECIMIENTO DEL ALGA

SELENASTRUM

CAPRICORNUTUM
Bioensayo rpido y simple para la evaluacin ecotoxicolgica de aguas residuales y lixiviados de residuos, as como para disoluciones de sustancias y preparados.

Figura 7. Selenastrum capricornutum Tiene como objetivo obtener una curva concentracin-efecto a partir de la cual poder calcular la CEb,50 (concentracin que inhibe en un 50% el crecimiento, medido como biomasa, del alga) de la muestra para el alga unicelular de agua dulce Selenastrum capricornutum. Para ello,

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a partir de un precultivo se obtiene una suspensin de algas con una densidad de 1104 cel/ml. Posteriormente, estas algas se exponen por triplicado a una serie de diluciones de la muestra a ensayar. La exposicin de las algas a las distintas concentraciones de la muestra se lleva a cabo en cubetas de 25 ml de volumen y 10 cm de paso de luz, durante un periodo de 72 horas, a 232 C y bajo iluminacin constante (aproximadamente 8.000 lux). La medida de la inhibicin del crecimiento de las algas en presencia de la muestra se realiza indirectamente a travs de la medida de la absorbancia de cada concentracin y del control (cultivo sin presencia de muestra) a 670 nm. Estas mediciones se realizan al inicio, a las 24, 48 y 72 horas siguientes. Finalmente se calcula la CEb,50 mediante el anlisis estadstico de los datos. 4.5.1. EFECTOS DE LA SALINIDAD EN LOS ENSAYOS REALIZADOS CON SELENASTRUM

CAPRICORNUTUM
Una vez determinada la conductividad1 de los primeros lotes de muestras, result evidente que mucho de los vertidos tenan influencia marina, estando constituidos por aguas salobres y/o saladas. Este dato oblig a replantear la realizacin de ensayos con el alga unicelular de agua dulce Selenastrum capricornutum, dado el previsible efecto txico causado por la propia salinidad de la muestra. An as, se consider de utilidad llevar a cabo este ensayo al objeto de determinar el umbral de efecto debido exclusivamente a la salinidad de la muestra, ensayndose nicamente aquellos vertidos cuya salinidad2 (valorada a partir de su conductividad) era suficientemente baja como para no causar efectos agudos que interfirieran en la valoracin de la toxicidad sistmica real, debida a otros solutos. Los resultados del ensayo de inhibicin de crecimiento en Selenastrum capricornutum realizado sobre una serie de diluciones de agua marina sinttica (Instant Ocean ) concluyeron lo siguiente: La concentracin efectiva de sal (salinidad) que inhibe en un 50% el crecimiento del alga al cabo de 72 horas de exposicin es del 6,5 . Es decir, CEb,50 (72 h) = 6,5 . La concentracin efectiva de sal (salinidad) que inhibe en un 20% el crecimiento del alga al cabo de 72 horas de exposicin es del 4 . Es decir, CEb,50 (72 h) = 4 . En base a estos resultados se decidi adoptar un valor umbral de efecto del 20%, por lo que no se procesaron aquellas muestras que presentaban una salinidad superior al 4 .

1 2

Ver apartado 4.7 de este Captulo Ver apartado 4.8 de este Captulo

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4.6. ENSAYO DE INHIBICIN DE LA BIOLMINISCENCIA SOBRE VIBRIO F FISCHERI ISCHERI Bioensayo estandarizado, rpido, simple y econmico para la evaluacin ecotoxicolgica de aguas residuales y lixiviados de residuos, as como para disoluciones de sustancias y preparados, a travs de la exposicin de la bacteria marina bioluminiscente Vibrio fischeri. Su objetivo es obtener una curva de concentracin-efecto a partir de la cual poder determinar la CI50 (Concentracin Inhibitoria) aguda de la muestra para este microorganismo.

Figura 8. Vibrio fischeri Para evitar interferencias debidas a la turbidez de la muestra, sta se puede filtrar a travs de un filtro de 0,45 m. Si la muestra no es de origen marino, debe tambin salarse (al 2%). Adems, para evitar que el efecto observado en el ensayo est influenciado por el pH de las muestras, hay que ajustar el pH al intervalo 6,0-8,5. Las muestras ya preparadas y sus diluciones seriadas sucesivas (por ejemplo 1/2, 1/4, 1/8, 1/16) se ponen en contacto (por duplicado) con un volumen equivalente de un cultivo de la referida bacteria marina bioluminiscente, previamente reconstituido y activado a partir de bacterias congeladas. Tras el tiempo de contacto establecido (generalmente 15 minutos), se miden secuencialmente y se registran las intensidades de emisin luminosa iniciales y finales para cada una de las concentraciones (por duplicado), y se calcula la CI50 de la muestra por regresin lineal e interpolacin en la recta correspondiente. El ensayo se realiza en bloque termosttico a una

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temperatura de 15 C. La expresin de resultados se realizar en trminos de unidades txicas (U.T.), equivalente a Equitox/m3. 4.7. MEDIDA DE LA CONDUCTIVIDAD Y DEL pH La determinacin del primero de estos parmetros se realiz mediante un conductmetro equipado con celda de conductividad y sonda de temperatura (marca CRISON), previamente calibrado. Las mediciones con este equipo se realizaron introduciendo la celda de conductividad y la sonda de temperatura en la muestra, tras lo cual ste suministr el valor de la conductividad a la temperatura de referencia elegida y a la temperatura de la muestra. La medida del pH de las muestras tomadas se realiz con un pH-metro (marca CRISON) previamente calibrado. Este equipo se compone de un par de electrodos conectados a un medidor capaz de medir pequeos voltajes, del orden de milivoltios. El valor de pH se obtiene a travs de la medida del potencial que alcanza un electrodo de vidrio al ser sumergido en la muestra. 4.8. RELACIN ENTRE CONDUCTIVIDAD Y SALINIDAD Al objeto de determinar la salinidad de las muestras de vertidos con influencia marina a partir de sus valores de conductividad, se procedi a la realizacin de un ensayo que permitiese correlacionar estos dos parmetros. Para ello, se realizaron una serie de diluciones de agua marina sinttica (Instant Ocean ) y se midi la conductividad de las mismas. Los resultados de este ensayo se resumen en la Tabla 5, mientras que en la Figura 9 se representa la recta de regresin obtenida. Tabla 5. Resultados del experimento conductividad/salinidad SALINIDAD SALINIDAD 0 0,137 0,273 0,547 1,093 2,188 4,375 8,75 17,5 CONDUCTIVIDAD (S/cm) 0 260 501 1011 1887 3480 6730 13060 23900

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SALINIDAD SALINIDAD 35

CONDUCTIVIDAD (S/cm) 42100

Salin idad-C on ductividad a T ambien te

50000 45000 40000

Conductividad (S/cm)

35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40

y = 1219,5x + 773,01 2 R = 0,9943

Sa linidad ()

Figura 9. Regresin Conductividad A partir de esta recta y de las lecturas de conductividad se calcularon los valores de salinidad de cada una de las muestras de vertidos con influencia marina.

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