MEDIOS DE CULTIVO

Objetivos Conocer el procedimiento adecuado para la preparacin de un medio de cultivo. Conocer las precauciones que se deben tener para esterilizar los materiales a trabajar Conocer los diversos tipos de medios de cultivo, as como su empleo para diversos propsitos.

Fundamento

Medio de cultivo Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. Condiciones generales para el cultivo de microorganismos: El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. 2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante) Autoclave: Una autoclave es un recipiente de presin metlico de paredes gruesas con un cierre hermtico que permite trabajar a alta presin para realizar una esterilizacin con vapor de agua. Su construccin debe ser tal que resista la presin y temperatura desarrollada en su interior. La presin elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a los 100 C. La accin conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulacin de las protenas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproduccin de stos, cosa que lleva a su destruccin. En el mbito industrial, equipos que funcionan por el mismo principio tienen otros usos, aunque varios se relacionan con la destruccin de los microorganismos con fines de conservacin de alimentos, medicamentos, y otros productos.

Materiales y qumicos

Materiales Autoclave 1 Erlenmeyer 3Placa Petri por grupo Balanza analtica Papel Kraft Papel aluminio Pabilo Termmetro Probeta de 500 mL

Qumicos Agar Cloruro de sodio C6H12O6(Dextrosa)

Procedimiento

Agar nutritivo

Medir 400 mL de agua destilada. Por cada litro de agua pesar 15 g de agar, 5 g de C6H12O6 y 35 g de cloruro de sodio. Encender el agitador y colocar el erlenmeyer con agua, adicionar la masa correspondiente de cada compuesto 6 g agar, 2 g C6H12O6 y 14 g de sal en ese orden. Agitar durante unos 8 minutos aproximadamente con calentamiento a 100 C.

Terminada la agitacin cubrir la boca del erlenmeyer con papel aluminio, recubrirlo con papel krafty ajustar todo con pabilo. Depositar todo los erlenmeyers en el autoclave y mantenerlos a 120 C durante 15 minutos. Sacar los erlenmeyers y dejar enfriar 10 minutos antes de verter el agar nutritivo en las 3 placas Petri previamente esterilizadas. Una vez en la placa esterilizada, dejar enfriar el agar por espacio de 20 minutos sin cerrar completamente la placa con su tapa. Finalmente colocar la placa Petri en un lugar fijo y a una temperatura moderada por un tiempo prolongado de una semana o ms para que se de el crecimiento del microorganismo.

Figura 1: Agitacin y calentamiento

Figura 2: Envasado para la esterilizacin

Figura 3: Esterilizacin en autoclave

Figura 4: Placas Petri esterilizadas

Observaciones

La agitacin no disolver totalmente los componentes adicionados, estos completarn su disolucin en el autoclave. El erlenmeyer no necesita estar esterilizado debido a que en el autoclave se da la esterilizacin del sistema. A 120 C el agar nutritivo se presenta en estado lquido.

Conclusiones

La proteccin del erlenmeyer con papel aluminio busca evitar la contaminacin del agar con el ingreso de microorganismo del medio ambiente. El agar nutritivo es un medio de cultivo slido sencillo de preparar y usado en la industria porque se mantiene solido a temperaturas relativamente altas. La dextrosa en la fuente de carbono. El cloruro de sodio es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante. La consistencia gel la dan el agar y el agua. La temperatura de fusin del agar nutritivo es superior a los 100 C. Es un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.

Glosario

Bibliografa

http://es.scribd.com/doc/7788947/2/Agar-Nutritivo revisado el 20/05/13 a las 08:06 am http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm revisado el 21/05/13 a las 12:12 pm http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm revisado el 21/05/13 a las 12:30pm

Cuestionario Enumere 10 diferentes medios de cultivo y la utilidad de los mismos

Agar sangre (TSA - Trypticase Soja Agar) El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de eleccin para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies bacterianas. Permite as mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actan sobre los glbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemlisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteracin (hemlisis gamma).

Chocolate Polyvitex (Agar chocolate) Este medio utiliza la misma base que el gar Sangre. Antiguamente se aadan los hematies a la base fundida y se elevaba la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio anlogo a ste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, despus de aadir antibiticos.

Caldo de Tioglicolato Es el caldo de enriquecimiento ms utilizado en Microbiologa.

Con el agregado de muchos factores nutrientes (Caseina, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc), el medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias patgenas. Agar Schaedler Schaedler + 5% sangre de cordero. Este medio reductor est particularmente adaptado al cultivo de los grmenes anaerobios. La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3, as como la adicin de la sangre de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes. K-W (Kanamicina-Vancomicina) Se utiliza para el aislamiento rpido de Bacteroides sp. Las levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una tincin Gram y confirmar la tolerencia al aire de todos los organismos aislados. Agar Mac Conkey El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la deteccin de organismos coliformes y patgenos entricos. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otros medios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. Agar de Czapek Es un medio especializado para estudios de hongos. Se utiliza de forma muy especial para estimular las caractersticas diferenciales de Aspergillus spp, lo que facilita su identificacin, y para estimular la filamentacin de Sporothrix schenckii. Agar Sabouraud El agar Sabouraud es un tipo de agar que contiene peptonas. Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos. Tambin es til para el cultivo de levaduras. BBE (Bacteroides Bilis Esculina) El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificacin presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis. El agar BBE permite una inhibicin selectiva de microorganismos

anaerobios facultativos y de la mayor parte de los anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall. Tambin pueden crecer en este medio: Fusobacterium mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras y algunos otros microorganismos. Agar Salmonella-Shigella (SS) Agar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se dise para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibicin de coliformes sin restringir el crecimiento de otros BGN patgenos.

Describe que medios de cultivo utilizara para una siembra simple de bacterias de fcil crecimiento. Y Por qu?

Nutritivo Caldo Es un medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Adems es un medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrgeno necesarias para el adecuado desarrollo bacteriano. Puede ser utilizado adems, como preenriquecimiento en la bsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar clulas daadas, diluir metabolitos txicos y sustancias inhibitorias. La siembra se realiza por inoculacin directa de la muestra o del microorganismo en estudio. La incubacin es por aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas. Los resultados se realizan al examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios slidos apropiados y realizar la identificacin bioqumica. La caracterstica del medio preparado: mbar claro, para una fcil observacin del cultivo

El almacenamiento se realiza en Medio deshidratado: a 10-35 C tambin en Medio preparado: a 2-8 C.

Mencione cuales son las condiciones de temperatura, pH y cantidad de oxigeno y de solutos bajo las cuales se desarrolla las levaduras. Las condiciones a las cuales se desarrollan las levaduras, serian: Oxgeno Las levaduras crecen bajo condiciones aerobias. Algunas son estrictamente aerobias y otras son facultativas. Las facultativas crecen mejor en aerobias y bajo condiciones anaerobias lo hacen ms lentamente. Las levaduras aerobias estrictas se conocen como oxidativas; y las que pueden desarrollarse tanto en medios aerobios como anaerobios se denominan fermentativas. PH En general, se considera que las levaduras, al igual que los mohos, se desarrollan mejor en medios cidos (3,8 5,6). Sin embargo, estas pueden tolerar un rango de pH que va desde 2,0 hasta 8,0. Temperatura Existen levaduras que pueden crecer a muy diversas temperaturas, generalmente en un rango de 0 a 50C. La mayora de las especies saprfitas, sin embargo, tiene temperaturas ptimas de crecimiento entre los 22 y las 30C. Concentracin de Solutos Las levaduras se pueden desarrollar en medios con concentraciones relativamente altas de solutos. Existe, adems, un grupo de levaduras que tolera cantidades de soluto aun mayores, por lo que se denominan osmfilas. Estas levaduras osmfilas tienen importancia en el deterioro de alimentos tales como la miel de abeja, los siropes y los concentrados de frutas.