UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD DE QUMICA Y BIOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

INFORME N 1 Separacin de protenas por cromatografa de exclusin molecular

CURSO INTEGRANTES

: :

BIOQUMICA ALFREDO GONZLEZ SARA PINTO FRANCISCA SEZ

PROFESOR AYUDANTE FECHA EXPERIENCIA FECHA ENTREGA

: : : :

ALEX ELIAS VALENTINA ROMERO 01 DE OCTUBRE DEL 2012 08 DE OCTUBRE DEL 2012

1. OBJETIVO GENERAL

Separacin de una mezcla de protenas a travs de cromatografa de exclusin molecular.

1.1. OBJETIVOS ESPECFICOS

Aprender la tcnica de cromatografa de exclusin molecular utilizando como fase estacionaria Sephadex G100.

Identificar las protenas separadas segn su absorbancia en 280nm y 550nm

2. INTRODUCCIN
La cromatografa de exclusin molecular se basa en la separacin de una mezcla, en este caso, de protenas de distinto tamao utilizando una columna cilndrica rellena con un gel poroso llamado fase estacionaria. La fase mvil est compuesta por la solucin a separar, la cual escurre a travs del gel. En el, las molculas de mayor tamao que el de los poros escurren con mayor facilidad a travs del espacio entre las partculas, por lo tanto, el tiempo de descenso por la columna no se ve retardado. Por otra parte, las molculas cuyo tamao es menor que el tamao del poro se ven retardadas por la fase estacionaria. En, de consecuencia, de esta tcnica se obtienen las protenas en orden a su tamao molecular, de mayor a menor. En esta experiencia, se espera separar una mezcla de fosfatasa cida de trigo, seroalbmina y citocromo C, utilizando como fase estacionaria Sephadex 100 en una columna de 12cm de largo. Para ello, se recolectar la solucin que escurre en tubos Eppendorf, con el propsito de registrar se abosrbancia a 280 y 550nm y as poder determinar qu protenas estn presentes.

3. DATOS Y RESULTADOS
Tabla 3.1: Datos obtenidos a partir de las muestras tomadas

N muestra 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

280 nm [A] 0,171 0,118 0,101 0,072 0,111 0,2 0,978 1,315 1,044 0,689 0,485 0,354 0,276 0,226 0,171 0,152 0,177 0,262 0,239 0,262 0,219

550 nm [A] 0,001 0,004 0,001 0 0,036 0 0,084 0,137 0,114 0,097 0,028 0,011 0,016 0,0147 0 0 0,002 0,073 0,041 0,061 0,029

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25 280 nm [A] 550 nm [A]

Figura 3.1: Grfica de los datos obtenidos.

4. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

En la grfica se observa que para la absorbancia de 280 [nm] se crea solo un peak, el cual corresponde a la fosfatasa cida de germen de trigo que es la segunda en tamao en la mezcla (la de mayor tamao y mayor masa molecular es la seroalbmina). Se asume que los compuestos que a esta longitud de onda absorbieron o reaccionaron se debe a que en su estructura hay aminocidos que absorben la luz a la longitud de onda mencionada, puesto que existen anillos aromticos que producen resonancia en las cadenas laterales.

Llama la atencin que solo se haya observado un peak a 280 [nm] por lo que se asume que la seroalbmina sali en la primera muestra tomada, esto se puede deber a que el flujo de la muestra era muy rpido. Otra posibilidad es que el gel no haya sido bien preparado quedando muchos espacios entre las partculas de este, causando que las molculas escurrieran demasiado rpido a travs del gel.

Al observar y analizar la curva de la absorbancia de 550 [nm] se puede apreciar que al igual que en la curva de la absorbancia anterior se observa un peak entre los puntos 6 y 8, lo que nos puede indicar que estamos en presencia del Citocromo C, esto se debe que este compuesto absorbe luz a 550 [nm] debido a que se trata de un compuesto coloreado.

Cabe la posibilidad de que desde la muestra nmero 16 hasta la muestra nmero 20 existan un pequeo error en la toma de la medicin, puesto que a esta longitud de onda solo debe existir un peak, que como se mencion anteriormente corresponde a la existencia del Citocromo C, esto se debe a que el nico que absorbe la luz a 550 [nm].

Mediante el anlisis de las muestras tomadas por cromatografa, se logr identificar dos de las tres protenas separadas de la muestra: La fosfatasa cida de germen de trigo y el Citocromo C.

5. BIBLIOGRAFIA

5.1. D. Freifelder, Tcnicas de Bioqumica y Biologa molecular, Abril 2003, editorial Revert S.A., Captulo 8, pgina 179-233. 5.2. Voet, Donald, Bioqumica, 2004, editorial medica Panamericana, tercera edicin, captulo 6, pgina 135 168.