CONTENIDO

I.

INTRODUCCION .................................................................................................... 1

II. OBJETIVOS.............................................................................................................. 2 2.2. 2.3. III. 3.2. IV. 4.1. OBJETIVO GENERAL ..................................................................................... 2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................ 2 INFORMACION GENERAL ............................................................................... 3 INFORMACION GENERAL............................................................................ 3 ACTIVIDADES REALIZADAS .......................................................................... 4 DETERMINACION ESPECTOFOTOMETRICA DE NITRITOS .................. 4 INTRODUCCION ...................................................................................... 4 FUNDAMENTO ........................................................................................ 4 PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................ 5

4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.2.

DETERMINACION DE LECTINAS EN LEGUMBRES .............................. 10 INTRODUCCION .................................................................................... 10 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................... 10

4.2.1. 4.2.2. 4.3.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA ........................................................... 13 INTRODUCCION .................................................................................... 13 FUNDAMENTO ...................................................................................... 13 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................... 14

4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.4.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA .......................................................... 17 INTRODUCCION .................................................................................... 17 FUNDAMENTO ...................................................................................... 18 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................... 18

4.4.1. 4.4.2. 4.4.3. 4.5.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO .................................... 23 INTRODUCCION .................................................................................... 23 FUNDAMENTO ...................................................................................... 24 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................... 24

4.5.1. 4.5.2. 4.5.3. 4.6.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUCION MOLECULAR .............................. 28 INTRODUCCION .................................................................................... 28 FUNDAMENTO ...................................................................................... 28 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................... 29

4.6.1. 4.6.2. 4.6.3.

4.7.

ELECTROFORESIS ....................................................................................... 30 INTRODUCCION .................................................................................... 30 FUNDAMENTO ...................................................................................... 31 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................... 31

4.7.1. 4.7.2. 4.7.3.

V. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................... 34

I. INTRODUCCION

El siguiente informe refiere a las prcticas pre-profesionales realizadas en el Instituto Superior de Ciencias Biomdicas y Biotecnologa, durante el periodo del 1 de marzo al 21 de octubre del 2011.

El Instituto Superior de Ciencias Biomdicas y Biotecnologa es una institucin privada que promueve la investigacin de productos naturales en nuestra regin. La institucin nace con el objeto de lograr el uso y desarrollo sostenible de los recursos naturales de nuestra biodiversidad, principalmente, de aquellas plantas con propiedades nutricionales y benficas para la salud. En el Per, se han identificado 1,100 plantas, aproximadamente, que cuentan con diversas propiedades y, probablemente, sea la mayor cantidad descubierta a la fecha. Muchas de estas plantas han sido tradicionalmente usadas durante aos por las comunidades nativas de los andes y la Amazona peruana.

El por ello que se hace necesaria la investigacin en productos naturales desde diferentes los diferentes campos de la ciencia como son la etnobotnica, la bioqumica, la qumica orgnica, la qumica analtica, la farmacologa, etc.

El conocimiento de estos estudios permite al Qumico desarrollar su conocimiento en cuanto a nuestra realidad nacional y sus recursos, desde los conocimientos bsicos de los procesos, permitiendo tambin estar capacitado para investigar los fenmenos qumicos mediante ensayos y/o anlisis con el fin de elaborar o perfeccionar los materiales y productos.

II. OBJETIVOS

2.2.

OBJETIVO GENERAL

Buscar el fomento a la investigacin de productos naturales oriundos de la regin ahondando conocimientos con referencia al mbito de los productos naturales, su origen, empleo y aspectos de relevancia considerada.

2.3.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Conceptualizar lo que representa un producto de origen natural. Analizar el origen de los productos de naturales. Exponer la secuencia de los productos naturales, desde sus inicios hasta la poca actual. Enumerar un listado de los usos ms importantes de los productos naturales y su empleo en nuestra humanidad. Comprobar la importancia de los productos de origen natural. Realizar el aislamiento de los productos de origen natural. Realizar una purificacin de los extractos obtenidos de los productos de origen natural. Determinar la estructura de los metabolitos secundarios de los productos de origen natural. Formular una hiptesis estructural Realizar ensayos bioqumicos de acuerdo a los resultados obtenidos de los productos de origen natural.

III. INFORMACION GENERAL

3.2.

INFORMACION GENERAL

3.2.1. Nombre de la institucin: Instituto Superior de Ciencias Biomdicas y Biotecnologa 3.2.2. Ubicacin: Centro Comercial La Negrita of 309 - Arequipa 3.2.3. Duracin de la prctica: Del 1 de marzo al 21 de octubre del 2011. 3.2.4. Supervisin: Ms. Carlos Arenas Chvez

IV. ACTIVIDADES REALIZADAS

4.1.DETERMINACION ESPECTOFOTOMETRICA DE NITRITOS

4.1.1. INTRODUCCION El nitrito es un estado de oxidacin intermedio del nitrgeno. Los NO3- existentes en el agua, son habitualmente, consecuencia de una nitrificacin del N orgnico o proceden de la disolucin de los terrenos atravesados por el agua. Pueden provenir de la contaminacin orgnica (ej. aguas residuales) o de la contaminacin por abonos qumicos. La OMS incluye a los nitratos entre los componentes que pueden ser nocivos para la salud: - En determinadas circunstancias los NO3- pueden ser peligrosos para los nios cuando su concentracin es mayor de 45 ppm. El efecto perjudicial de los NO3- se debe a que por accin bacteriana se reducen a NO2- en el estmago, estos pasan a la sangre y son responsables de la metahemoglobinemia, con lo que el poder de absorcin del oxgeno por la sangre disminuye, produciendo asfixia interna. - Se conoce adems que in vitro los NO3- reducidos a NO2- pueden formar nitrosaminas de conocida accin cancergena.

4.1.2. FUNDAMENTO

Esta determinacin se realiza mediante un mtodo colorimtrico. El nitrito produce la diazotacin de la sulfanilamida, la cual forma un compuesto de coloracin rosado con la naftilendiamina, cuya intensidad de color media fotomtricamente a 530 nm es proporcional a la concentracin de NITRITOS presente en la muestra.

Figura 1. Reaccin qumica de la diazotacin

4.1.3. PARTE EXPERIMENTAL 4.1.3.1. MATERIALES Matraces aforados de 25 mL. Pipetas graduadas de 1 y 5 ml. Vaso de precipitados Espectrofotmetro de absorcin molecular UV-visible.

4.1.3.2. REACTIVOS Sulfanilamida Clorhidrato de N-1-Naftiletilendiamina Solucin patrn de Nitrito de Sodio Solucin patrn de Nitrato de Sodio Agua destilada Agua desmineralizada

4.1.3.3. PROCEDIMIENTO A. ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS. Si se debe almacenar, conservar a 4oC hasta 24 h; para perodos ms largos, adanse 2 ml H2SO4 conc./l y mantngase a 4oC. (Nota: Cuando se conserve una muestra con cido, no se pueden determinar NO3- y NO2- individualmente). B. SOLUCIONES PATRN DE NITRITO DE SODIO En un matraz aforado se disuelve en agua 1.000 g de nitrito de sodio (NaNO2), pesado con exactitud, y se diluye hasta 100 ml.

Con pipeta se transfiere 5 ml de la solucin preparada, a un matraz aforado de 100 ml y se diluye hasta el enrase, dando una solucin que contiene 0.05 mg de nitrito de sodio ( NaNO2 ) por ml. Con pipetas se transfiere 5, 10 y 20 ml de la solucin preparada en el inciso anterior, a matraces aforados de 100 ml y se diluye hasta el enrase. Estas soluciones patrn contienen 2.5 g, 5.0 g y 10.0 g de nitritos de sodio por ml respectivamente. C. SOLUCIONES PARA DESARROLLAR EL COLOR a) Solucin No.1 (Sulfanilamida): En un matraz aforado de 100 ml que contiene 80 ml de agua, se disuelven calentando en el bao de agua 0.2 gramos de sulfanilamida. Se enfra, se filtra si es necesario y se agrega mientras se agita continuamente 10 ml de cido clorhdrico concentrado (d20C=1.19g/ml), luego se diluye a 100 ml con agua. b) Solucin No.2 (Diclorhidrato de N-1-naftiletilendiamina): En un matraz aforado de 250 ml se disuelven en agua 0.25 gramos de diclorhidrato de N-1naftiletilendiamina y luego se diluye a 250 ml. Nota: Esta solucin se guarda en un frasco oscuro hermticamente cerrado en refrigeracin, durante un perodo no mayor de una semana. c) Solucin No.3 (cido Clorhdrico diluido): En un baln aforado de 100 ml se diluyen 44.5 ml de cido clorhdrico concentrado (d20C=1.19g/ml) a 100 ml con agua. D. ELABORACIN DE LA CURVA PATRN Se toman con pipeta alcuotas de 10 ml de las soluciones de concentraciones 2.5, 5.0 y 10.0 microgramos de nitrito de sodio (NaNO2) por ml y se transfieren a matraces volumtricos de 100 ml, a cada uno de los cuales se les agrega agua hasta un volumen aproximado de 60 ml, a otro matraz volumtrico de 100 ml se transfiere aproximadamente 60 ml de agua. A cada uno de los 4 matraces se agrega con pipeta las siguientes soluciones ya preparadas: 10 ml de Solucin de Sulfanilamida y 6 ml de Solucin de cido Clorhdrico diluido, se mezcla y se deja la solucin en 40 reposo durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, se agregan 2 ml de Solucin de Diclorhidrato de N-1-natiletilendiamina, se mezcla y se deja en reposo de 3-10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se llevan a volumen con agua.

Se mide la absorbancia de las soluciones elaboradas en el inciso anterior en una celda de 1 cm de longitud ptica empleando un colormetro fotoelctrico o un espectrofotmetro a una longitud de onda de aproximadamente 538 nm. Se construye la curva patrn de absorbancias en funcin de la concentraciones de las soluciones patrn de nitrito de sodio; dichas concentraciones se expresan en microgramos (g)/ml. E. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE NITRITOS a) Medicin del color 1. Se transfiere con pipeta a un matraz aforado de 100 ml, una alcuota del filtrado no mayor de 25 ml y se le agrega agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 60 ml. 2. Al matraz se le agrega con pipeta las siguientes soluciones: 10 ml de Solucin de Sulfanilamida y 6 ml de Solucin de cido Clorhdrico diluido, se mezcla y se deja la solucin durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego se adicionan 2 ml de Solucin de Diclorhidrato de N-1natiletilendiamina se mezcla y se deja en reposo de 3-10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad; luego se diluye con agua hasta el enrase. 3. Se mide la absorbancia de la solucin en una celda de 1 centmetro de longitud ptica empleando un colormetro fotoelctrico o un espectrofotmetro a una longitud de onda de aproximadamente 538 nanmetros. Nota: Si la absorbancia de la solucin coloreada obtenida a partir de la muestra excede la obtenida a partir de la solucin patrn de concentracin ms alta, se repiten las operaciones para la medicin del color, tomando una alcuota del filtrado ms pequea que la tomada anteriormente en el inciso 1.

F. RECTA DE CALIBRADO En las condiciones citadas se pueden medir concentraciones de nitratos comprendidas entre 5 y 50 mg/l. Se calculan los volmenes de la disolucin madre de nitrato que hay que coger para preparar varios patrones con los que construir la recta:

V * 100ppm = 10 ml * C PATRN (5, 10, 20, 30, 40, 45 y 50) Tomamos 1 ml de cada una de las disoluciones patrn y seguimos el procedimiento descrito antes. G. CALCULOS La lectura de la absorbancia de la muestra frente a la curva patrn da directamente la concentracin de NO3- en ppm. En el caso de una muestra diluida tener en cuenta el factor de dilucin. H. INTERFERENCIAS Se requieren muestras pticamente claras, por lo que es necesario filtrar en el caso de muestras turbias ( ej: aguas residuales). Interfieren los oxidantes o reductores fuertes. Los iones Fe+, Fe2+, Mn4+interfieren ligeramente cuando la concentracin es mayor de 1 ppm. Los NO2- no interfieren por la presencia del cido sulfanlico (El cido sulfanlico es una amina aromtica, concretamente su estructura es la del ac. paminobencenosulfnico. Impide que los NO2- oxiden la brucina, ya que stos reaccionan con el ac. sulfanlico y dan una sal de diazonio incolora porque reaccionan y originan un compuesto de diazonio incoloro) La incompatibilidad qumica hace improbable la coexistencia del nitrito, cloro libre y tricloruro de nitrgeno (el tricloruro de nitrgeno proporciona un color rojo falso cuando se aade el reactivo colorante). El NCl3 proporciona un color rojo falso cuando se aade el reactivo colorante. Los iones siguientes interfieren debido a precipitacin en las condiciones de la prueba, y deben estar ausentes: Sb3+, Au3+, Bi3+, Fe3+, Pb2+, Hg2+, Ag+, cloroplatinato (PtCl2-6) y metavanadato (VO2-3). El in cprico ( Cu2+) interfiere al catalizar la descomposicin de la sal de diazonio. Los iones coloreados que alteran el sistema de color, tambin deben estar ausentes. Los slidos suspendidos se eliminan por filtracin.

I. RECTA DE CALIBRADO DE NITRATOS UNIDADES: PPM RANGO: 0 50 a) Preparacin de la disolucin madre de NO3- de 100 ppm. Disolver 0.1629 gramos de KNO3 en agua destilada y diluir a 1000 ml. Pm KNO3 = 101.11 101.11 62 Pm NO3- = 62 0.1629 X X = 100 mg de NO3b) Clculo de los volmenes de la disolucin madre para preparar los distintos estndares. V * 1000 PPM = 10 ml * C estndares ( 0 - 50 ppm) Tomar los distintos volmenes y enrasar hasta la seal con agua destilada.

4.2.DETERMINACION DE LECTINAS EN LEGUMBRES

4.2.1. INTRODUCCION Las lectinas son protenas capaces de unir molculas de azcar y son ubicuas en organismos vivos. El trmino lectina, propuesto por Boy y Sharpleigh en 1954, deriva del latn legere (seleccionado, escogido) y se refiere a la capacidad de unin selectiva de azcares particulares. Este trmino fue generalizado desde 1972 para todas aquellas protenas ligadoras de azcares y aglutinadoras de clulas que no poseen un origen inmune y son encontradas en animales, vegetales y microorganismos. Las semillas de leguminosas son particularmente fuentes ricas de lectinas. En los vegetales, la mayora de las lectinas se encuentran en rganos de reserva, lo cual es una evidencia indirecta de su papel como protenas de defensa. 4.2.2. PARTE EXPERIMENTAL 4.2.2.1. MATERIALES Licuadora Vaso de precipitados Gasa

4.2.2.2. REACTIVOS

Agua destilada Sangre de conejo Legumbres

4.2.2.3. PROCEDIMIENTO

A. MATERIAL VEGETAL Lentejas, Lens esculenta (Fabaceae, Leguminosae), que fueron recolectadas de la localidad de Castilla, Provincia de Arequipa (16 44' 0" latitud sur y entre 70 16' 0" y 71 8' 16" longitud oeste). B. EXTRACCIN SALINA

Se toman 100 g de muestra las que se trituran en un molino de maz hasta la obtencin de un material pulverizado, de los cuales 70 g de harina sern disueltos en 210 ml (proporcin 1:3 v/v) de una solucin de NaCl 10% dentro de un vaso de 500 ml. La mezcla resultante fue mantenida en agitacin por 1 hora a temperatura ambiente, para obtener la solubilizacin de las protenas. Posteriormente la suspensin obtenida se filtra en gasa, a fin de retirar las partculas grandes y materiales insolubles, y centrifuga a 3.000 x g por 20 minutos a 4 C. El precipitado se descarta y el sobrenadante obtenido (120 ml) se dializado en 1 litro de tampn bicarbonato de amonio (NH4HCO3) 0,1 M, pH 8,0, por 6 horas (realizndose cambios cada 2 horas). La eliminacin de sal ser comprobada aadiendo gotas de nitrato de plata (AgNO3) 0,01 N (de haber presencia de NaCl, la solucin adquirir una coloracin lechosa). Dos alcuotas de 0,1 ml se toman para la determinacin de protenas por el mtodo de Biuret y la prueba de hemaglutinacin con eritrocitos humanos. El dializado se conserva a 4 C. C. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR Para la purificacin de la muestra anterior se coloc 25 ml en una columna de exclusin molecular empacada con Sephadex G-100 (1,6 x 100 cm). Luego, 126 ml de la muestra anterior sern pasados por una columna de Sephadex G-75 (1,9 x 102 cm). D. PRUEBA DE HEMAGLUTINACIN La actividad hemaglutinante de la lectina se ensaya en eritrocitos intactos y sobre eritrocitos tripsinizados de humano de los grupos sanguneos del sistema ABO, todos factor Rhesus positivo (Rh+). La sangre se recolecta y mantiene en una solucin de Alsever (2,05% glucosa, 0,80% citrato de sodio y 0,42% NaCl, pH 6,1 ajustado con cido ctrico) a 4 C hasta su uso. E. ACTIVIDAD HEMAGLUTINANTE Para la determinacin de la actividad hemaglutinante de la lectina de la legumbre se emplean placas de microtitulacin de 36 pozos. En cada pozo de las primeras filas se adicionaron 50 l de CTBS e inmediatamente despus 50 l de la lectina. La muestra se diluye seriadamente,

con agitacin y transferencia de 50 l para el pozo siguiente hasta la penltima fila. Los primeros pozos sin muestra pero con eritrocitos sirvieron como controles. Terminadas las diluciones, se agregaron 50 l de la suspensin de eritrocitos al 3% (v/v) y las lecturas se realizaron despus de 2 horas de incubacin de la placa a temperatura ambiente. La inhibicin de la actividad hemaglutinante por diversos carbohidratos fue realizada con D-glucosa, D-maltosa, D-manosa, Dglucosamina, N-acetil glucosamina, D-galactosa, sacarosa, D-sorbitol y trealosa. Todos estos reactivos fueron adquiridos de Sigma Co., U.S.A. En las placas de microtitulacin (96 pozos, Sigma Co., U.S.A.) se adicionaron a los primeros pozos de las filas 25 l de carbohidrato a concentraciones que varan desde 50 a 0,05 mM en CTBS. Estos fueron diluidos serialmente con 25 l de CTBS ya presentes en los pozos hasta alcanzar una concentracin final de 3,86 g/ml. Las placas se mantuvieron en reposo por 5 minutos, para enseguida adicionrseles 50 l de una suspensin al 3% (v/v) de eritrocitos tripsinizados del grupo O. Despus de 2 horas en reposo a temperatura ambiente, se determin la menor concentracin de carbohidrato capaz de inhibir la aglutinacin inducida por 3,86 g/ml de lectina sobre eritrocitos tripsinizados del grupo O Rh+. Asimismo, se usaron los agentes quelantes EDTA (cido etilendiamino tetraactico) y EGTA (cido etilenglicol bis tetraactico; Sigma Co., USA) para ensayos de inhibicin. En cada pocillo de prueba se agregaron 25 l de TBS ms 25 l del respectivo agente quelante, y se hizo una dilucin seriada en la misma fila hasta obtener concentraciones que variaron desde 50 hasta 0,10 mM. Se determin la menor concentracin de agente quelante capaz de inhibir la aglutinacin inducida por 3,86 g/ml de lectina sobre eritrocitos tripsinizados del grupo O.

4.3.CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

4.3.1. INTRODUCCION La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. La cromatografa en columna es un mtodo cromatogrfico en que la fase estacionaria est contenida en un tubo estrecho o en su superficie interna, y en la fase mvil es forzada a travs del tubo, donde ocurre la separacin de los elementos.

Figura 2. Fases de la cromatografa en columna

4.3.2. FUNDAMENTO En la cromatografa en columna, la fase estacionaria est contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase mvil a travs del tubo, ya sea a presin por gravedad.

4.3.3. PARTE EXPERIMENTAL 4.3.3.1. MATERIALES

Columna con sephadex Muestra, 300 l Solventes Pinzas con nuez Varillas de vidrio de 50 cm Embudo de vidrio Probeta graduada de 25 ml Tubos de ensayo Gradilla Soporte PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.3.3.2.

A. PREPARAR LA COLUMNA Introducir en la columna de vidrio una pequea cantidad de algodn. Tener cuidado de no utilizar mucho algodn ya que podra estar muy apretado. Slo se necesita suficiente para evitar que el adsorbente se escape. Aadir slica gel seca adsorbente, malla 230-400. Presionar el slica gel en la columna para lograr un buen empaquetamiento.

Figura 3. Silicagel

Figura 4. Armado de la columna

B. PRE-ELUCIN DE LA COLUMNA Dependiendo del tipo de experimentacin se especifica el tipo de solvente que se ha de usar para esta etapa. Un disolvente no polar como hexano es una opcin comn. Aadir hexanos (u otro disolvente adecuado) a la parte superior del slica gel. El disolvente fluye lentamente por la columna. Monitorear el nivel de disolvente, tanto en lo que fluye a travs del gel de slice y el nivel en la parte superior, teniendo cuidado de que no se seque. Cuando el nivel de disolvente inferior se encuentra en la parte inferior de la columna, el proceso de pre-elucin se da por completado y la columna est lista para cargar.

Figura 5. Empacado de la columna

Figura 6. Monitoreo del nivel del solvente

C. CARGA DE LA MUESTRA EN LA COLUMNA DE SLICA GEL La columna se carga por va hmeda. Una vez que est en la columna, se aade a la parte superior el disolvente de elucin, y ya est listo para iniciar el proceso de elucin

Figura 7. Adicin del extracto

Figura 8. Adicin

Figura 9. La muestra se va distribuyendo

D. ELUIR LA COLUMNA CON EL DISOLVENTE DE ELUCIN Si se van a separar una mezcla de uno o ms compuestos, se tendra que cambiar el disolvente de elucin aumentando poco a poco la polaridad. E. ELUIR LA COLUMNA Para acelerar el proceso de elucin se hace uso de una bomba de vaco, con el cual se logra obtener las fracciones de manera ms rpida.

F. ANALIZAR LAS FRACCIONES Si las fracciones son de color, slo tiene que combinar fracciones del mismo color, por ultimo almacenarlas en un lugar fresco y seco para su posterior utilizacin en futuros anlisis, anotando fecha y hora de almacenamiento.

Figura 10. Fases de la separacin de los metabolitos secundarios en la columna cromatogrfica.

4.4.CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

4.4.1. INTRODUCCION Cromatografa en capa fina (TLC) es una tcnica rpida, sencilla y econmica de anlisis. Se trata de una tcnica a microescala, ya que con una mnima cantidad de muestra como 10-9 g de material, puede ser fcilmente detectado el analito. En la cromatografa en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminologa inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partculas finas y distribuirse uniformemente en forma de lminas. Esto incluye sustancias inorgnicas (gel de slice, xido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgnicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilizacin de soportes hidrfobos facilita la separacin de compuestos no polares (lpidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lmina de 0,25-0,50 mm

de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plstico. 4.4.2. FUNDAMENTO La cromatografa en capa fina es un caso de cromatografa de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatogrfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase mvil o eluyente (disolvente B). El parmetro experimental asociado a la tcnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase mvil, y que depende de su estructura qumica y su hidrosolubilidad / liposolubilidad.

Figura 11. Cromatografa en columna

4.4.3. PARTE EXPERIMENTAL 4.4.3.1. MATERIALES

Placas para cromatografa Matraces erlenmeyer Pipeta graduada de 10 ml Probeta de 25 ml Cmara de desarrollo Agitador de vidrio Capilares Lmpara de luz ultravioleta REACTIVOS

4.4.3.2. -

Acetona Acetato de etilo

Hexano Metanol Acido sulfrico Etanol Silicagel PROCEDIMIENTO

4.4.3.3.

A. OBTENER PLACAS PARA CCF Las placas suelen ser de vidrio 20x20 cm, aunque tambin se emplean de otros tamaos y materiales (plstico, metal...) sobre las que se extiende el material adsorbente formado por una papilla mediante un aplicador especial hasta obtener una fina capa lo ms uniforme posible. El espesor puede variar, siendo el ms corriente 0,25 mm. Capas ms gruesas se utilizan en la tcnica preparativa, para conseguir cantidades apreciables de cada componente. Generalmente el adsorbente contiene una sustancia aglomerante, yeso (sulfato de calcio), que lo mantiene adherido a la placa de vidrio. La extensin debe realizarse en un tiempo mximo de cuatro minutos para evitar el endurecimiento de la suspensin por efecto del aglomerante.

Figura 12 Estructura de la slica gel

B. ACTIVACIN DE LAS PLACAS CROMATOGRFICAS Despus de la extensin se procede al activado de las placas, mantenindolas en estufa a 100-105oC durante 2h, con lo que su poder adsorbente aumenta extraordinariamente.

Cuando interesa realizar cromatografa de reparto, las placas se dejan un cierto tiempo para que adquieran humedad. Nota: Existen en el comercio placas de vidrio para cromatografa preparadas con el adsorbente incorporado (Cromatoplacas); tambin se encuentran en forma de lminas de aluminio o plstico (Cromatofolios), que presentan la ventaja de poderse recortar con facilidad, muy tiles para anlisis cuantitativo. Los cromatofolios de plstico no pueden calentarse demasiado y deben utilizarse con precaucin con ciertos eluyentes. C. PREPARACIN DE LA FASE MVIL La eleccin del lquido de desarrollo es fundamental para lograr una buena cromatografa. El tipo seleccionado depende de la naturaleza de las sustancias que se pretendan separar. En general, los compuestos polares requieren eluyentes con agua, mientras que los poco polares utilizan lquidos no acuosos. Para la eleccin el eluyente, resulta conveniente colocar en una placa de cromatografa una serie de manchas de la mezcla a ensayar, y en el centro de cada una de ellas una gota de uno de los lquidos de desarrollo que se pretenden utilizar (distinto para cada mancha). Una vez revelada la placa se observar fcilmente cul es el ms adecuado. D. APLICACIN DE LAS MUESTRAS Para aplicar las muestras se dispone normalmente de plantillas de plstico con una serie de agujeros que permiten marcar el punto de aplicacin e introducir una micropipeta o un capilar a 2 cm del borde inferior de la placa. El volumen aplicado suele ser de 2-10 mm3 (1 a 50 g de sustancia) y la mancha no debe tener un dimetro > a 5 mm.

Figura 13 Cromatograma que muestra el marcado de los puntos donde se aplicaran las muestras

E. CAMARAS SEPARADORAS Las cmaras separadoras, suelen ser recipientes de vidrio rectangulares o cilndricos. Para la admisin de placas de 20x20 cm, lo mejor son las cmaras rectangulares. Tambin se pueden emplear los llamados vasos de batera con tapa esmerilada, o vasos para la conservacin de preparaciones anatmicas. Los recipientes deben poderse cerrar hermticamente.

Figura 14. Cmara de desarrollo

Figura 15. Componentes de la cmara de desarrollo

F. REVELADO DE LOS ANALITOS El revelado puede realizarse por mtodos fsicos o por mtodos qumicos: - Entre los mtodos fsicos se encuentra la pulverizacin de una sustancia fluorescente (fluorescena) sobre la placa, con lo que al iluminarla con luz UV se observan las manchas oscuras sobre fondo fluorescente. As mismo, resultan de utilidad los adsorbentes que llevan incorporada una sustancia fluorescente, lo que permite la rpida localizacin de las manchas a la luz UV sin necesidad de pulverizar. - Tambin se puede recurrir a procedimientos qumicos, consistentes en la pulverizacin sobre la placa de un agente revelador que d una reaccin coloreada con las sustancias problemas, o bien se introduce la placa en el lquido revelador.

Figura 16. Revelado de los analitos en el cromatograma

G. DETERMINACION CUALITATIVA DE LOS COMPONENTES DE LA MUESTRA La determinacin cualitativa de los componentes de la muestra, una vez revelado el cromatograma, se realiza mediante la medida de la distancia recorrida por cada componente y la recorrida por el disolvente, calculando el Rf como se indica a continuacin: * El Rf es el "Factor de Retencin" y representa la relacin entre la distancia recorrida por la sustancia y la recorrida por el frente del eluyente.

Este parmetro nos indica la afinidad relativa de la sustancia por el adsorbente o por el eluyente. El valor del Rf est condicionado por numerosos factores tales como las variaciones en la composicin del lquido de desarrollo, la temperatura, que modifica el coeficiente de reparto y la viscosidad del eluyente, as como la naturaleza del adsorbente en s y las condiciones de trabajo. Por ello, para dar el valor del Rf como una caracterstica propia de cada sustancia, hay que especificar muy claramente las condiciones en que se ha realizado el ensayo. * Actualmente se emplea otro parmetro denominado Rx, que representa la relacin entre la distancia recorrida por la sustancia problema y la recorrida por otra sustancia patrn de caractersticas similares, en el mismo cromatograma y durante el mismo tiempo.

* Para realizar un anlisis cuantitativo se requiere desarrollar en la misma placa cantidades patrones conocidas de todos los componentes cuya valoracin se pretenda efectuar.

Figura 17. Clculos para determinar el Rf

4.5.CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

4.5.1. INTRODUCCION Para este tipo de cromatografa la retencin est basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambiadores de iones son: Resinas de Poliestireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena. Celulosa: Tiene tamao de poros mas grandes y bajas densidades de carga que los hacen ideales para la separacin de protenas. Poro controlado de vidrio o silicona porosa.

Los intercambiadores de iones favorecen la unin de iones de mayor carga y radio inferior. Un incremento en el contra-in (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de retencin. Un incremento del pH reduce el tiempo de retencin en el intercambio catinico, pero bajar el pH reduce la retencin en intercambio aninico. Se usa en la purificacin de agua, preconcentracin de componentes traza, cromatografa de intercambio de ligandos, cromatografa de intercambio de iones de protenas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y polisacridos. 4.5.2. FUNDAMENTO

La cromatografa de intercambio inico se fundamenta en las propiedades cido-base de las protenas. Una protena, a pH menor de su pI (punto isoelctrico), tendr carga positiva y a pH mayor de su pI presentar carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unir a una resina con carga negativa (Carboximetilcelulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga positiva (Dietilaminoetilcelulosa, DEAE-celulosa).

Figura 18. Principio del intercambio inico en la agarosa

Una vez unida la protena a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas: 1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI 2) mediante un gradiente inico aadiendo el contrain correspondiente (Na+ en el caso de intercambio catinico o Cl- para el intercambio aninico).

4.5.3. PARTE EXPERIMENTAL 4.5.3.1. MATERIALES

1 Recipiente para hielo 1 Par de guantes de ltex Gasa

1 Probeta de 250 mL 1 Probeta de 100 mL Licuadora Maizena 1 Recipiente para hielo 2 Vasos de precipitados de 500 mL Tubos para microfuga de 1.5 mL Gradilla para tubos de microfuga 1 Caja con puntas de 200 uL (amarillas) para micropipeta. 1 Caja con puntas de 1000 uL (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 20-200 uL 1 Micropipeta 200-1000 uL 1 Bandeja pequea Centrfuga Bolsa de dialisis REACTIVOS

4.5.3.2. -

Amortiguador de equilibrio I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0. Amortiguador de elucin I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl. Amortiguador de elucin II. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 3.0. Agua destilada. Extracto de la muestra a analizar. Suero fisiolgico. PROCEDIMIENTO

4.5.3.3. A.

PREPAREACION DE LA MUESTRA

Pesar 250 g de muestra y dejarlas remojando por 12 horas luego colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto fro hasta su uso). Agregar 3 volmenes de 50 mM Tris/HCl pH 7.0 fro por cada g de muestra y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora se caliente. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y colectar el filtrado en un vaso de precipitados de 1L.

Distribuir el filtrado en botellas de centrfuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4oC durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L. Al sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fraccin 1). Apartar 1 mL de la fraccin 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20C para su posterior uso. Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho.

B.

EXTRACCION

Las fracciones luego se les coloca en una bolsa de dilisis la que al mismo tiempo va dentro de una columna a la cual aadimos la solucin buffer. Mantenemos a baja temperatura (esto se puede lograr introducindola dentro del refrigerador por alrededor de 30 min). Medir la conductividad, si la conductividad es alta desechamos la solucin buffer y volvemos a repetir la operacin tantas veces sea necesario hasta obtener la minima conductivida constante. C. PRECIPITACIN CON SULFATO DE AMONIO ((NH4)2SO4) POR EQUIPO. Tomar 25 mL de la fraccin 1 y colocarlo en un vaso de precipitados y agitar el sobrenadante de manera continua y suave en un agitador magntico, mientras se aade lentamente sulfato de amonio slido (8.15g de (NH4)2SO4 por 25 mL del sobrenadante). La agitacin debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formacin de cmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningn momento utilizar varilla de vidrio o esptula para disolver los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequea con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitacin para evitar que la solucin se caliente. Cuando toda la sal se ha disuelto la solucin se encuentra a una saturacin del 55% con sulfato de amonio. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vaca a un tubo de centrfuga de 50 mL y se centrfuga a 10,000 rpm 4oC por 10 minutos.

Colectar el sobrenadante (Fraccin 2) y medir el volumen. Descartar el botn. Tomar 1 mL de la fraccin 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a 20oC para su posterior uso. Calcular el peso de (NH4)2SO4 para obtener una solucin al 75% de saturacin, (0.125 g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describi anteriormente. Una vez disuelto el (NH4)2SO4 (NH4)2SO4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrfuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4C por 10 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el botn en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL y almacenar la muestra obtenida para los anlisis biolgicos que se requieran.

4.6.CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

4.6.1. INTRODUCCION

La cromatografa de exclusin molecular, tambin denominada cromatografa de filtracin en geles y cromatografa de permeacin en geles, es una tcnica que se aplica fundamentalmente para la separacin y caracterizacin de sustancias de peso molecular elevado. Se utiliza extensamente en Bioqumica para separar molculas grandes como protenas e hidratos de carbono, si bien, tambin encuentra aplicaciones en la qumica de los polmeros.

4.6.2. FUNDAMENTO Las molculas se separan de acuerdo con su tamao. Las molculas pequeas penetran en los poros pequeos de la fase estacionaria, pero no las molculas grandes. Puesto que las molculas pequeas tienen que recorrer un volumen realmente mayor, las molculas grandes se eluyen primero. Esta tcnica se usa mucho en bioqumica para purificar macromolculas. Este tipo de separacin por tamao difiere de las dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida.

Figura 19. Esquema de una columna de cromatografa de filtracin en gel.

4.6.3. PARTE EXPERIMENTAL 4.6.4. MATERIALES Columna cromatogrfica Pinzas con nuez Varillas de vidrio de 50 cm Embudo de vidrio Probeta graduada de 25 ml Tubos de ensayo Gradilla Soporte Colector de fraciones

4.6.5. REACTIVOS Muestra, 300 l Solventes Agua destilada Gel de sephadex

4.6.6. PROCEDIMIENTO A. PREPARACION DE LA COLUMNA Armar la columna en posicion vertical. Aadir solucin buffer hasta la mitad de la columna. Luego se aade muy lentamente y con mucho cuidado el gel de sephadex evitando la formacin de burbujas en su interior lo que podra producir resultados desfavorables. Dejar decantar el gel de sephadex por aproximadaente 30 minutos en el interior de la columna, luego taparla hasta su utilizacin. Dejar pasar solucin byffer atraves de la columna para asegurar la uniformidad del gel de sephadex.

B. EXTRACCIN Aplicar la muestra sobre la columna y esperar a que penetre en el gel. Se aade entonces un cierto volumen de tampn y se comienza a recoger fracciones en orden sucesivo (una fraccin cada tres o cuatro gotas). Almacenar en refrigeracin las fracciones obtenidas.

4.7.ELECTROFORESIS 4.7.1. INTRODUCCION

La electroforesis es la migracin de iones en un campo elctrico. Es una de las tcnicas analticas ms importantes dentro de la Bioqumica. Las molculas biolgicas (ADN, protenas, vitaminas, etc.) poseen cargas elctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo elctrico. La movilidad depender de la carga que presentan al pH que trabajemos. La electroforesis en gel es el mtodo ms conveniente para realizar separaciones de macromolculas (ADN y Protenas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que impide o reduce la difusin. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del lquido en los poros (reticulados hidratables). Los soportes pueden ser ms o menos restrictivos segn que el tamao de poros limite o impida el paso de las molculas. Los ms restrictivos, como los geles de acrilamidabisacrilamida, oponen impedimento al paso de las molculas, participando as en el proceso de separacin. Entre los menos restrictivos est la agarosa. El tamao de poro que da unas dimensiones moleculares de criba de los geles puede ser establecido previamente. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las molculas mayores respecto a las de menor tamao. Las separaciones moleculares estn pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electrofortica de las molculas que van a ser separadas.

Figura 20. Esquema de la separacin de las molculas en un proceso electrofortico.

4.7.2. FUNDAMENTO

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. 4.7.3. PARTE EXPERIMENTAL 4.7.4. MATERIALES 1 Micropipeta de 20-200 L 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta 1 Recipiente de plstico/gel para la tincin. 1 Cmara para electroforesis 1 Fuente de poder 1 juego de placas de vidrio 1 juego de separadores Pinzas para sujetar las placas

4.7.5. REACTIVOS Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% NNmetilen-bisacrilamida. 2 M Tris /HCl pH 8.8 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 20% SDS 10% Persulfato de amonio Agua destilada Isopropanol o butanol Mezcla de estndares de peso molecular de protenas. Amortiguador de muestra * Amortiguador de corrida * Solucin teidora * Solucin desteidora

4.7.6. PROCEDIMIENTO A. PREPARACIN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS. Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las pinzas.

Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios. Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.5, aadiendo al final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solucin (USAR GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA). Aadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o nbutanol saturado con agua, con la finalidad de disminuir la tensin superficial y que no se forme un menisco en la parte superior del gel. Se espera a que polimerice la acrilamida, no ms de 20 minutos.

Figura 21 Reaccin de polimerizacin de la acrilamida

Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel.

Figura 22. Pasos a seguir para la preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS.

Preparar la mezcla del gel concentrador similar al segundo punto. Se aade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior para formar los depsitos en los que colocaremos la muestra. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min y remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cmara de electroforesis. Aadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.

B. PREPARACIN DE MUESTRAS Pesar 1 g de muestra. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calcul en un tubo de microfuga y a ese volumen aadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable tambin, si los volmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al aadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total. Cabe sealar que los pozos tienen una capacidad mxima de 30 uL por lo que la mezcla protena: amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen. Realizar tambin una mezcla de estndares de peso molecular. Usar 7 L del estndar y mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra.

C. ADICIN DE MUESTRAS Y CORRIDA Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que se obtuvieron las fracciones y colocando al final el estndar, como se observa en la siguiente figura.

Figura 23. Aplicacin de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida SDS.

Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o segn se desee. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tincin depositando el gel en una charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H2O destilada y aadir la solucin desteidora. Poner a agitar suavemente. Tomar una foto al gel teido.

V. BIBLIOGRAFIA

1. Skoog, Douglas A. y Leary, Madrid: McGraw-Hill.

James

J.

1994.

Anlisis

Instrumental,

2. Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. 3. Eduardo Primo Yfera. Qumica orgnica bsica y aplicada. Primera Edicion.1996. Reverte, Madrid, Espaa. 4. Olga Lock de Ugaz. 1994. Invetigacion Fitoquimica, Metodos en el estudio de productos naturales. Univ Catolica Peru, Peru. Lima, Per.