UNIVERSIDAD AUTNOMA DE AGUASCALIENTES CENTRO DE CIENCIAS BSICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICA. Biotecnologa ambiental.

Inmovilizacin de enzimas en una matriz polimrica.

M. en C. Javier Araiza Arvilla.

Aguascalientes, Ags. junio del 2013

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS EN UNA MATRIZ POLIMRICA Antecedentes En los ltimos aos, la biotecnologa ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos qumicos, en la industria alimentaria y farmacutica. Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos: Presentan una gran actividad cataltica. Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad). Son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica (Arroyo, 1998).

A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos qumicos industriales debido a que la mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos y productos es difcil, y por tanto, no se pueden reutilizar (Arroyo, 1998). Con la inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea econmicamente rentable (Arroyo, 1998). La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte. Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar: 1. El aumento de la estabilidad de la enzima. 2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.

3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de reactores enzimticos con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, las cuales mantienen su actividad durante ms tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtencin de productos con mayor pureza (Arroyo, 1998). Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son: 1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte. 3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin. 4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa (Arroyo, 1998). Se trata que la enzima quede retenida por una matriz slida, lo que permite recuperarla al trmino de la operacin. La enzima se puede as reutilizar. Hay varios tipos de inmovilizacin: Entrecruzamiento fsico (floculacin). Entrampamiento fsico en materiales porosos. Encapsulamiento. Por adsorcin sobre soportes adecuados (por ejemplo, perlas de vidrio). Por unin covalente a polmeros naturales o artificiales o por encapsulacin en una matriz que permita el acceso a sustratos y productos e impida la salida de la enzima (Franco, 2007).

En cualquier caso, hay que evitar que la inmovilizacin impida la aproximacin de los sustratos al centro activo. Cuando se emplea la unin covalente, suelen usarse reactivos bifuncionales, que se unen por un extremo a la enzima y por otro al polmero, de longitud de cadena suficientemente larga, para que la enzima quede a distancia del polmero. La inmovilizacin tiene la ventaja adicional de que aumenta la estabilidad de la enzima (Franco, 2007). Segn la ruta seguida para su preparacin los sistemas pueden clasificarse en cuatro: 1. Inmovilizacin sin carrier: es el caso de clulas unidas con otras clulas, tanto por adsorcin o por uniones covalentes. La floculacin de clulas, durante su fermentacin o por procesos secundarios mediante variacin

en parmetros fisicoqumicos (pH, fuerza inica) es un proceso de unin por adsorcin. Este proceso puede ayudarse por el agregado de pequeas cantidades de agentes de floculacin (polmeros). Es tambin comn el uso de agentes qumicos bifuncionales, tal como el glutaraldhedo para unir clulas mediante entrecruzamiento qumico (UNQ, 2005). El caso tpico es la floculacin de algunas cepas de Zymomonas mobilis, empleadas en la produccin de etanol. El mtodo de inmovilizacin es sencillo, pues espontneamente se producen flocs cuando se crecen clulas en un medio adecuado sin agitacin. Los flocs as formados se utilizan como inculo de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la produccin de etanol a partir de glucosa en reactores especialmente diseados. Las clulas inmovilizadas son retenidas dentro del reactor (UNQ, 2005). Este mtodo permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva a cabo en condiciones de reaccin suaves, que no perjudican la estabilidad del biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia mecnica frente a la agitacin y a la compresin, hay limitaciones difusionales al transporte de nutrientes, y est limitado a pocas clases de microorganismos (UNQ, 2005). 2. Inmovilizacin del biocatalizador en carriers preformados: es la estrategia tpica en la inmovilizacin de enzimas, especialmente por medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones en condiciones fsicas y qumicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las caractersticas de estabilidad mecnica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el caso de clulas, el problema estriba en cmo favorecer la adhesin de las clulas (relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor dimetro que la clula para permitir la penetracin a las superficies internas. Se emplean carriers porosos, que son embebidos por inmersin en suspensiones celulares. En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la generacin de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o carboxilo libres presentes en la enzima (UNQ, 2005). 3. Inmovilizacin durante la preparacin del carrier: es la estrategia ms comn en la inmovilizacin de clulas enteras. Si bien hay dos mtodos, entrampamiento y encapsulamiento, este ltimo es de limitada importancia debido al tamao de las clulas enteras, es relativamente

sencillo preparar redes de porosidad tal que garanticen la completa retencin de las clulas, y que los procesos de transporte de sustratos y productos sean suficientemente rpidos para obtener alta eficiencia en la actividad cataltica. La dificultad se encuentra en la bsqueda de condiciones de preparacin de carriers que cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad del biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el mtodo de inmovilizacin ms usado, debido a su flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones de reaccin (en el caso de polmeros naturales) (UNQ, 2005). 4. Inmovilizacin por crecimiento de clulas previamente inmovilizadas: en realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es utilizada para aumentar la concentracin de clulas dentro del carrier, por lo que, evidentemente, slo sirve para inmovilizacin de clulas. Permite inmovilizar clulas que contienen sistemas multienzimticos, ya sea en estado estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en caso de clulas libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas. Generalmente se realiza por entrampamiento en redes inicas. Es posible restaurar la actividad cataltica, e inclusive aumentarla. Es un mtodo til para obtener clulas difciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio celular. La tcnica en este caso consiste en la inmovilizacin de esporos en matrices insolubles, los cuales originarn micelio una vez inmovilizados en la matriz (UNQ, 2005). La inmovilizacin permite el uso repetitivo de la enzima lo que significa un ahorro significativo en los costos. La seleccin de los mtodos de inmovilizacin debern estar basados en los requerimientos tcnicos especficos y en el marco global de su aplicacin comercial. Objetivo Desarrollar un sistema de tratamiento de aguas residuales inmovilizando enzimas (lacasas) en una matriz polimrica, alginato. Metodologa 1. Se disolvi un gramo de lacasa comercial (enzima) en 100 ml. de alginato al 2% (primero se disolvi la enzima en agua, luego se agreg el polmero y se dej reposar). 2. Utilizando jeringas con aguja de diferente calibre, se formaron las esferas de alginato de calcio de tres tamaos diferentes.

3. Se depositaron las esferas de alginato (al momento en que se estn formando) en 30 ml. de CaCl2 al 2%. 4. Se procedi al montaje de los biorreactores utilizando tres buretas graduadas en las que se colocaron de manera separada las esferas de alginato. 5. Se hizo pasar el colorante Rojo RD81 a concentracin 1:10 por los tres biorreactores, monitoreando cada 20 minutos la remocin del mismo mediante la medicin de absorbancia en espectrofotmetro. Este proceso se realiz en 5 ocasiones consecutivas. 6. Adems se midi la velocidad de flujo, es decir, el tiempo que tardaba 100 ml. de colorante en pasar a travs de un volumen conocido de esferas dentro de la bureta. El tiempo fue medido para los tres diferentes tamaos de esfera. 7. Con la informacin obtenida se realizaron los clculos pertinentes para obtener el volumen total del biorreactor (volumen de las esferas + volumen de los huecos entre las esferas) as como el porcentaje de remocin, y con las absorbacias se realiz un anlisis de la actividad de la lacasa como inmovilizadora de partculas de colorante. Clculos Volumen total

Porcentaje de remocin

Meta Inmovilizacin de enzimas en una matriz polimrica y empacar en un biorreactor diseado ex profeso para el tratamiento de efluentes lquidos. Diseo experimental

1. Se utilizaron tres diferentes tamaos de esfera (se medi el rea de cada una de ellas). 2. Se utiliz una sola concentracin del colorante RD81 (1:10). 3. Con lo anterior, se observ el porcentaje de remocin del colorante, por medio de los cambios en la absorbancia, medida a cinco tiempos diferentes: 0, 20, 40, 60, 80 y 100 minutos. Teniendo as, dos factores distintos en el experimento: concentracin de colorante, tamao de esfera y tiempo. Resultados
Tabla 1. Promedio en mm del dimetro de 10 esferas medidas por cada tamao.

Tamao de esferas Chicas Medianas Grandes

Dimetro de esferas (promedio en mm) 1.9 2.15 3.7

Tabla 2. Absorbancia del colorante antes de la prueba a tres longitudes de onda distintas.

Contro l

Tiempo (min) 0

Longitud de onda (nm) 280 385 505

Absorbanc ia 1.45 0.834 1.763

Tabla 3. Absorbancias obtenidas tras la prueba realizada a cinco diferentes tiempos y a distintas longitudes de onda por cada tamao de esfera.

Tamao de la esfera Chica

Tiempo (min) 20 40 60

80

100 Mediana 20 40 60

80

100

Grande

20 40 60

80

100

Longitud de onda (nm) 280 385 505 280 385 505 280 385 400 505 280 385 400 505 280 385 505 280 385 505 280 385 505 280 385 400 505 280 385 400 505 280 385 400 505 280 385 505 280 385 505 280 385 400 505 280 385 400 505 280 385 505

Absorbanc ia 1.028 0.819 1.671 1.019 0.809 1.657 1.031 0.813 0.810 1.671 1.028 0.815 0.812 1.675 1.044 0.825 1.691 1.039 0.819 1.662 1.038 0.813 1.651 1.023 0.798 0.791 1.623 1.033 0.807 0.802 1.644 1.082 0.838 0.832 1.671 1.033 0.815 1.657 1.030 0.807 1.646 1.027 0.802 0.801 1.638 1.030 0.807 0.804 1.645 1.035 0.807 1.637

Tabla 4. Velocidad de flujo del colorante a travs de los biorreactores con diferentes tamaos de esferas de alginato.

Tamao de la esfera Chicas Medianas Grandes

Velocidad de flujo 240 102.3 48.46

Clculos Volmenes totales

Tamao de la esfera Chica Mediana Grande Volumen total (ml) 52.34 29.60 34.12

Porcentajes de remocin Tamao de la esfera Chicas Medianas Grandes Longitud de onda (nm) 280 385 505 280 385 505 280 385 Porcentaje de remocin (%) 0.0028 0.000108 0.000408 0.0025 -0.000048 0.000521 0.00286 0.000323

505

0.000714

Figura 1. Elaboracin de esferas de alginato con la enzima lacasa.

Figura 2. Esferas grandes de alginato con lacasa.

Figura 3. Montaje del biorreactor.

Figura 4. Montaje de biorreactores.

Figura 5. Biorreactores montados.

Figura 6. Detalle del empaquetamiento de las esferas pequeas de alginato.

Figura 7. Detalle del empaquetamiento de esferas medianas de alginato.

Figura 8. Detalle del empaquetamiento de esferas grandes de alginato.

Figura 9. Paso del colorante Rojo RD 81 (1:10) a travs del biorreactor con esferas de alginato y lacasa.

Figura 9. Medicin de la absorbacia a seis diferentes tiempos y toma de datos.

Discusin Como la obtencin de las enzimas puede ser cara y a veces difcil, para evitar prdidas innecesarias del material enzimtico se recurre a la inmovilizacin de enzimas en soportes slidos que permitan su reutilizacin en los procesos industriales. Esto es posible gracias a que las enzimas son catalizadores y, por lo tanto, no se consumen durante los procesos en los que son utilizadas. La inmovilizacin consiste en fijar o atrapar la enzima en un material insoluble (gel, membrana, perlas de vidrio, etc.) de forma que no pierda la actividad y permita su recuperacin. En otras palabras, se trata de usar un sistema de dos fases fcilmente separables, una que tenga la enzima y se pueda reutilizar o utilizar de forma continua, y otra, que contenga al producto. La inmovilizacin puede realizarse por mtodos fsicos, como la adsorcin de la enzima sobre un soporte insoluble, la retencin o atrapado de la enzima en un gel poroso (agarosa, alginato, slice, etc.) o el confinamiento de la enzima en una membrana que permita el paso del sustrato y evite la prdida de la enzima, o qumicos, mediante la formacin de enlaces covalentes entre la enzima y una matriz activada o copolimerizando las molculas de enzima y soporte (Castillo et al., 2005). En el proyecto se realiz la inmovilizacin de la enzima lacasa en una matriz polimrica, que en este caso fue alginato, mediante las cuales se pretenda degradar el colorante Rojo RD81 al pasar el lquido coloreado por las esferas de

la matriz con la enzima, y determinar si la enzima era capaz de degradar en cierta medida el colorante. Al analizar los resultados obtenidos, se observ que las absorbancias obtenidas comenzaron a disminuir gradualmente en el primer y segundo tiempo de medicin (20 y 40 minutos), sin embargo, a partir de la tercera medicin (a los 60 minutos) la absorbancia, y por tanto la concentracin del colorante volvi a aumentar gradualmente, hasta completar las cinco mediciones previstas. Esto puede deberse a que la enzima lacasa comenz a transformar el RD81 en un colorante ms obscuro en lugar de eliminarlo. En el estudio realizado por Amzquita et al. (2008) se observ que la concentracin de colorante que utilizaron, el ndigo carmn, haba bajado de una manera considerable, lo que significa que la enzima lacasa primero obscureci la solucin y despus la empez a decolorar. Otra posible explicacin a los resultados obtenidos es que la enzima se saturo al tercer tiempo de medicin, y esto impidi que siguiera degradando ms colorante, por ello es que aument gradualmente la absorbancia en vez de disminuirla. Los porcentajes de remocin obtenidos son muy bajos, incluso se obtuvo un resultado negativo. Esto puede explicarse porque el tiempo de exposicin del colorante a la enzima fue sumamente corto, nicamente de 100 minutos. En la revisin bibliogrfica se encontr que en estudios como el de Amzquita et al. (2008) el colorante ndigo Carmn se expuso a la enzima por un periodo de tres semanas, y an as obtuvo un porcentaje de remocin de 1.6229% de la solucin original, mientras que con el colorante Azul cido se tuvo una decoloracin del 63.0284% de la solucin original, durante el mismo periodo de tiempo. El factor que vari en ambos casos fue el pH, ya que para el ndigo Carmn el proceso se llev a cabo en un buffer con pH de 5, mientras que para el Azul cido ste fue de 4.5. El proceso realizado en este proyecto no se tom el cuenta el pH. Para obtener resultados ms significativos deben tomarse en cuenta otros parmetros como pH, conductividad, la adicin de un buffer con pH controlado, adems de realizar el proceso durante un periodo de tiempo ms largo. Es fundamental medir la actividad enzimtica de manera cuantitativa, con lo que se puede determinar mejor si el proceso es efectivo y costeable para realizarlo a una mayor escala. Conclusiones La inmovilizacin de enzimas en una matriz polimrica es una tcnica eficaz que permite la remocin/degradacin de sustancias qumicas manteniendo a la enzima estable y funcional con la posibilidad de recuperarla una vez pasado el proceso en el que se requiera. Es importante considerar la cantidad de enzima requerida para un cierto volumen de colorante, as como las propiedades del ltimo, con la

finalidad de que la enzima acte especficamente sobre l y evitar la saturacin de la misma durante el proceso. Es posible realizar una remocin/degradacin efectiva de colorantes con la enzima lacasa, siempre y cuando se controlen condiciones como pH, conductividad, tiempo de remocin, etc. as como realizar la valoracin cuantitativa de la actividad enzimtica de la enzima, de tal manera, que si se obtienen resultados favorables, el proyecto puede llevarse a escalas mayores.

Referencias Amzquita, M.; Angulo, A.; Pastrana, L.; Carranza, J. y Ampudia, P. 2008. La aplicacin de la enzima Laccasa para la eliminacin del colorante ndigo Carmn de las aguas residuales en Morelos. Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Monterrey Campus Cuernavaca. 7 p. Arroyo M. 1998. Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Ars Pharmaceutica, Universidad Complutense de Madrid, 38:2; 23-39. http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf fecha de consulta: 30 de octubre del 2011. Castillo, F.; Roldn, M.; Blasco, R.; Huertas, M.; Caballero, F.; Moreno, C. y Martnez, M.2005. Biotecnologa Ambiental. TBAR. Espaa. pp. 305, 306. Franco V. L. 2007. Enzimas: qu son y para qu sirven. Rev. R. Acad. Cienc. Exact. Fs. Nat. Vol 101. No. 2: 399-417 pp. http://www.rac.es/ficheros/doc/00552.pdf fecha de consulta: 30 de octubre del 2011. Universidad Nacional de Quilmes. 2005. Biocatalizadores inmovilizados. http://bioprocesos.unq.edu.ar/Biopro%20II/Celulas%20inmovilizadas%20TP.pdf fecha de consulta: 30 de octubre del 2011.