Ensino de Biologia e Geologia Princpios de Microbiologia

Quinta-feira 11h-13h00

ANTIBITICOS
Relatrio P9

RESUMO

Os antibiticos so substncias qumicas produzidas por microorganismos que em concentraes muito baixas inibem selectivamente outros microorganismos. Neste trabalho experimental testar-se-o os efeitos de alguns antibiticos sobre trs estirpes bacterianas. Os resultados obtidos permitiram-nos concluir que

OBJECTIVO
O objectivo deste trabalho verificar a susceptibilidade de E.coli, de Rhizobium e Actinomices aos antibiticos inibidores de sntese proteica.

INTRODUO
As estirpes microbianas frequentemente inibem o crescimento umas das outras. Para alm de excretarem produtos finais resultantes do metabolismo como lcoois e cidos, que podem limitar o crescimento de alguns microorganismos, produzem substncias qumicas mais complexas e bastante diferentes das restantes, tambm com efeito inibidor do crescimento: os antibiticos. Os antibiticos so produtos microbianos ou seus derivados que em concentraes muito baixas matam ou inibem selectivamente outros microorganismos. Ao contrrio dos desinfectantes e anti-spticos, que so aplicados a matrias inertes ou nos tecidos externos, os antibiticos podem ser aplicados internamente. Alguns antibiticos so produzidos por bactrias como actinomicetas do gnero Streptomyces e outros por fungos, particularmente estirpes de Penicillium e Aspergillus. Os antibiticos constituem um grupo diversificado de compostos que se podem agrupar em famlias com estrutura qumica semelhante. Assim, antibiticos do mesmo grupo, normalmente tm tipos de actividade semelhante e so usados na prtica para fins semelhantes. Em traos gerais os antibiticos podem dividir-se quanto ao seu modo de aco em trs grupos: Inibio da sntese da parede celular (penicilina), danificao da membrana citoplasmtica, inibio da sntese proteica (estreptomicina), inibio da sntese dos cidos nucleicos, inibio do metabolismo celular. A sensibilidade dos microorganismos a antibiticos varia bastante. As bactrias Gram positivas so normalmente mais sensveis a antibiticos do que as Gram negativas, embora existam antibiticos que s actuem nestas

ltimas. Um antibitico que actue contra estes dois tipos de bactrias um antibitico de largo espectro, normalmente mais usado para fins clnicos. Neste trabalho experimental, para verificar a susceptibilidade de um microorganismo a antibiticos, utilizou-se o mtodo do disco em placa (mtodo de difuso). Neste mtodo colocam-se discos de papel de feltro impregnados com vrios tipos de antibitico, superfcie de um meio onde foi inoculado o microorganismo que se pretende estudar. Os discos de antibitico so colocados na superfcie do meio com o auxlio de uma pina esterilizada. Atravs de um antibiograma possvel avaliar a susceptibilidade do microorganismo ao antibitico. O microorganismo ir crescer durante a incubao, mas volta do disco embebido em antibitico no se observar crescimento caso seja sensvel ao antibitico. O tamanho da zona de inibio (Halo de inibio) causada pela difuso de um antibitico no meio, est directamente relacionada com o grau de susceptibilidade do microorganismo ao antibitico em causa. Quanto maior for o Halo de inibio maior a susceptibilidade do microorganismo ao antibitico. O dimetro do halo depende outros factores como a concentrao inicial de antibitico, a quantidade de inoculo, tempo de incubao, taxa de difuso do antibitico atravs do Agar, entre outros. Assim, os antibiticos devem ser incubados nas mesmas condies. Outro aspecto a ter em conta, o facto de substncias qumicas diferentes difundirem-se a taxas diferentes podendo ser inactivadas em graus diferentes pelo meio de cultura. Portanto no se pode analisar o dimetro da zona de inibio para comparar directamente a eficcia de dois antibiticos diferentes. A concentrao mais baixa de um frmaco que impede o crescimento de um determinado agente denominado por concentrao mnima inibitria (CMI). Assim, cada disco deve ter uma concentrao especfica de acordo com o antibitico que possui . A concentrao mais baixa de um frmaco que destri o agente designa-se por concentrao mnima letal (CML). No trabalho experimental realizado, utilizou-se soluo salina para controlo positivo e utilizaram-se como antibiticos a Kanamicina, a Estreptomicina e a Espectinomicina, todos eles antibiticos aminoglicosdeos inibidores de sntese proteica. Estes antibiticos actuam ao nvel dos ribossomas, provocando um erro na leitura do RNA mensageiro, ou seja bloqueiam a etapa inicial do processo de traduo, conduzindo morte das clulas. As bactrias utilizadas para estudar a sua sensibilidade aos antibiticos supra referidos, foram a E.coli, Rhizobium e Actinomices. A Escherichia coli uma bactria que est presente na nossa flora intestinal, Gram negativa e trata-se de um microorganismo anaerbio facultativo. O Rhizobium uma bactria do solo, Gram negativo

e aerbio estrito. Por fim, Actinomices um microorganismo presente no solo, Gram positivo e anaerbio. Palavras-chave: Antibitico, Estreptomicina, Espectinomicina, Kanamicina.

MATERIAL E REAGENTES
Material: - Rolhes de algodo estril - Discos de papel esterilizado - Placas de Petri com agar nutritivo (3) - Estufa de incubao

Reagentes: - Cultura de E. coli - Cultura de Rhizobium - Cultura de Actinomices - Soluo de Kanamicina - Soluo de Estreptomicina - Soluo de Espectinomicina - Soluo salina

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Inoculao em massa 1. Transferimos 10 ml de soluo salina estril sobre a placa com crescimento bacteriano de E. coli 2. Espalhmos com uma pipeta de Pasteur 3. Suspendemos as bactrias com auxilio de um rolho de algodo estril e inoculmos, humedecendo uniformemente, a superfcie do agar de uma placa nova com o rolho. 4. Deixmos secar na estufa durante cerca de 10 minutos Teste de susceptibilidade

5. Retirmos um disco de papel embebido de cada soluo de antibitico,

assim como de soluo salina e colocmo-los, identificando-os, na placa. 6. Repetimos os cinco passos anteriores para a cultura de Rhizobium e de Actinomices 7. Deixmos a incubar na estufa com as seguintes temperaturas: a. E. coli 37C b. Rhizobium e Actinomices 30C 8. Observmos e medimos os crculos de inibio, registando os resultados

RESULTADOS

Kan- kanamicina STR- Estreptomicina EPC- Espectinomicina Salino- soluo salina estril

Disco

Zona de inibio de crescimento E.coli

Actinomices

Rhizobium

ANTIBITICO
Kanamicina Estreptomicina Espectinomicina Soluo salina

E. coli 2,9 2,8 3,3 2,2

Dimetro de inibio [cm] Rhizobium Actinomices 3,3 2,8 3,5 3,4 2,8 2,7 1,0 1,5

Tabela 1: Registo de resultados dos crculos de inibio Grau de sensibilidade Intermdia Resistncia ? ? ?

Maior

Menor

E. coli Espectinomicina Kanamicina Estreptomicina Rhizobium Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina Actinomices Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina
Tabela 2: Registo de sensibilidade aos antibiticos

Discusso dos resultados e concluso

Os halos de inibio, so como o prprio nome indica, zonas onde no se verifica crescimento de microorganismos. Nesta actividade verificou-se a formao de halos de inibio, ou seja o antibitico difundiuse prevenindo o crescimento de bactrias. Em alguns casos observaram-se dois halos (Rhizobium). O halo interior corresponde a uma zona onde no h crescimento bacteriano, o halo exterior corresponde a uma zona em que houve algum crescimento devido ao aparecimento de bactrias mutantes. Para uma melhor compreenso dos resultados convm relembrar que a E. coli e a Rhizobium so Gram + e a actinomices Gram -, sendo a primeira anaerbia facultativa, a segunda aerbia restrita, e a ltima anaerbia. Os trs antibiticos utilizados so antibiticos aminoglicosdeos inibidores de sntese proteica. Estes antibiticos actuam ao nvel dos ribossomas, provocando um erro na leitura do RNA mensageiro, ou seja bloqueiam a etapa inicial do processo de traduo, conduzindo morte das clulas. Embora os nossos resultados estejam por vezes incorrectos, devido a contaminaes, mau manuseamento do material, e outros erros aos quais fomos alheios, recorremos comparao com valores de outros grupos e podemos chegar a algumas concluses. O SPC um antibitico de pequeno espectro, o STR de grande espectro, porque conseguiu penetrar na camada de peptidoglicano das Gram + como nas Gram -. Em toda a experincia a soluo salina deveria ter funcionado como controlo positivo, mas tal no foi possvel porque num dos grupos anteriores ocorreu contaminao contudo ainda apresentava um halo de inibio pequeno em relao aos outros antibiticos. Conclumos que a E. coli mais susceptvel ao SPC e menos susceptvel ao STR. Rhizobium e Actinomices apresentaram maior sensibilidade ao STR e menor sensibilidade ao SPC . como j foi referido o Rhizobium apresentava contaminao, pois era possvel observar crescimento filamentoso tpico de fungos filamentosos. Embora no tenha sido observado, era de esperar que o Actinomices fosse o mais sensvel, visto tratar-se de uma bactria Gram +, como explicado na introduo. Para finalizar convm relembrar que todas estas concluses s foram possveis atravs da comparao de resultados dos vrios grupos, visto que os dados tericos no se concretizaram na prtica.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Brock Biology of Microorganisms. Madigan, Martinko e Parker. Prentice Hall, 8th ed., 1997 Manual da disciplina e apontamentos da aula Microbiology- Concepts and Applications. Pelczar, Chan e Krieg. McGraw-Hill, 1993. Microbiology. Prescott, Harley e Klein. WCB, 5th ed., 2002. Protocolo experimental Condies ambientais de crescimento microbiano (P9) http://soils.(ses.ut.ede/ch/biol4684/microbes/rizobium.html www.fmv.utl.pt/democ/sft/toxicelogia/toxclin.PDF

www.epa.gov/opptintr/biotech/fra/fra002.htm www.micro.msb.le.ac.uk/video/Gram.html