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CINETICA

Gli enzimi accelerano una reazione modificando, nella fattispecie abbassando, l’energia di attivazione.

Se il pH si dissocia dal PH ottimale, l’enzima si protona/deprotona provocando una modificazione conformazionali nell’enzima che abbassa la velocità della reazione.

A °t più alte aumenta la velocità di una reazione, ma a T troppo alte (>50 °C ) si rischia di denaturare un enzima Le reazioni chimiche possono essere :

1) Irreversibili S -> P caratterizzate da una velocità di:

2) Reversibili A <-> P caratterizzate da una velocità di:

All’equilibrio la Vi=Vd quindi

e la costante di eq. vale:

CINETICA ENZIMATICA

Uno dei fattori chiave che modificano la velocità di una reazione catalizzata da un enzima purificato è la concentrazione del substrato, [S]. Però lo studio degli effetti del substrato è complicato dal fatto che IS] varia durante il corso di una reazione, man mano che il substrato viene convertito in prodotto. Per eliminare questo problema in esperimenti di cinetica si può valutare la velocità iniziale, indicata con la sigla Vo quando IS] è in genere molto più grande della concentrazione dell'enzima [E] (reazioni di pseudoprimordine). A concentrazioni relativamente basse di substrato, Vo aumenta praticamente in modo lineare con l'aumento di [S]. A concentrazioni di substrato più elevate, V0 aumenta in misura sempre minore in funzione dell'aumento di IS]. Alla fine si arriva ad un punto in cui gli aumenti di Vo in funzione di IS] diventano estremamente piccoli. In questa regione più piatta della curva la velocità della reazione si avvicina alla velocità massima, Vmax. (la velocità smette di crescere quando tutti i siti degli n° enzimi sono occupati dal substrato) Il complesso ES è la chiave per la comprensione del comportamento cinetico degli enzimi come vedremo in seguito. L’effetto saturante del substrato è una proprietà caratteristica dei catalizzatori enzimatici ed è responsabile dell’appiattimento della curva.

ed è responsabile dell’appiattimento della curva. Il meccanismo per una reazione catalizzata è il seguente:

Il meccanismo per una reazione catalizzata è il seguente:

Quando l’enzima viene prima mescolato con un largo eccesso di substrato, vi è un periodo iniziale, chiamato stato pre-stazionario, durante il quale avviene la formazione di ES. In genere questo periodo è troppo breve per poter essere osservato, poichè dura solo microsecondi. La reazione raggiunge rapidamente lo stato stato stazionario, in cui [ES]

rimane approssimativamente costante nel tempo. La Vo misurata in genere riflette lo stato

stazionario, anche se Vo è limitata ai primi istanti della reazione.

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anche se Vo è limitata ai primi istanti della reazione. • LA RELAZIONE TRA CONCENTRAZIONE DEL

LA RELAZIONE TRA CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO E VELOCITÀ’ DELLA REAZIONE

Dato che in una reazione reversibile, la K4 è prossima allo zero, poichè se il prodotto restasse attaccato all’enzima diventerebbe un suo inibitore, possiamo scrivere la reazione come:

La velocità Vo dipende dalla demolizione di ES per dare origine al prodotto e quindi è direttamente proporzionale a [ES].

Dato che [ES] non è facilmente misurabile dobbiamo trovare un espressione alternativa. quella di michaelis-menten. Michaelis e Menten formularono questa relazione sull’ipotesi di base che la tappa limitante di una reazione enzimatica fosse la demolizione del complesso ES (in quanto è la reazione che ha una velocità più lenta). L’equazione è:

Passaggi matematici:

Bisogna fare ora una assunzione importante: la velocità iniziale della reazione riflette uno stato stazionario in cui [ES] è costante; in queste condizioni la velocità di formazione di ES diventa uguale a quella della sua demolizione. Questa assunzione si chiama assunzione dello stato stazionario. Allo stato stazionario, quindi, le espressioni delle Equazioni precedenti possono essere uguagliate:

Dall'equazione di Michaelis-Menten emerge un'importante relazione numerica nel caso particolare in cui V0 sia esattamente uguale a1/2 Vmax.

KM: è una misura dell’affinità dell’enzima per il substrato, la quale è valutata come una misura della [S] a cui si raggiunge metà della Vmax. Si considera come una misura inversa dell’affinità; Più bassa è Km, più alta è l’affinità e viceversa. Inversa nel senso che se E-S si legano bene, la velocità della reazione è bassa. Se si legano male è alta. In un grafico, più Km è a destra, meno è affine.

Per una reazione a due tappe Km è così espressa:

Se k3 è la costante che limita la velocità, si ha che k3 << k2 e Km si riduce a k2/k1, che viene detta costante di dissocia•zione del complesso ES. Quando si verificano queste condizioni, Km rappresenta una misura dell’affinità dell enzima per il suo substrato nel complesso ES.

Questa situazione non si applica però alla maggioranza degli enzimi. In alcuni casi si ha che k3 >> k2 e quindi Km = k3/k1. In altri casi ancora, i valori di k3 e k2 sono comparabili e quindi Km diventa una funzione più complessa che dipende dalle tre costanti di velocità.

E’ importante definire una costante di velocità più generale, detta KCAT, necessaria per descrivere la tappa che limita la velocità di una reazione catalizzata da un enzima in condizioni di saturazione. Se la reazione è costituita da diverse tappe e una di queste è chiaramente quella limitante, kcat diventa uguale alla costante di velocità della tappa limitante. Per la reazione semplice definita dall'Equazione:

la kcat è uguale a k3. La costante kcat è una costante di primo ordine espressa dal reciproco del tempo. Essa viene detta anche numero di turnover ed equivale al numero di molecole di substrato che vengono convertite' in prodotto nell'unità di tempo da una singola molecola enzimatica quando l’enzima è saturo con il substrato.

EFFICIENZA/POTERE CATALITICO.

Il modo migliore per confrontare l’efficienza catalitica di enzimi diversi, o dello stesso enzima con substrati diversi è di paragonare il rapporto KCAT/KM.