CINETICA

Gli enzimi accelerano una reazione modicando, nella fattispecie abbassando, lenergia di attivazione. Se il pH si dissocia dal PH ottimale, lenzima si protona/deprotona provocando una modicazione conformazionali nellenzima che abbassa la velocit della reazione. A t pi alte aumenta la velocit di una reazione, ma a T troppo alte (>50 C ) si rischia di denaturare un enzima Le reazioni chimiche possono essere : 1) Irreversibili S -> P caratterizzate da una velocit di: 2) Reversibili A <-> P caratterizzate da una velocit di: Allequilibrio la Vi=Vd quindi e la costante di eq. vale:

CINETICA ENZIMATICA

Uno dei fattori chiave che modicano la velocit di una reazione catalizzata da un enzima puricato la concentrazione del substrato, [S]. Per lo studio degli effetti del substrato complicato dal fatto che IS] varia durante il corso di una reazione, man mano che il substrato viene convertito in prodotto. Per eliminare questo problema in esperimenti di cinetica si pu valutare la velocit iniziale, indicata con la sigla Vo quando IS] in genere molto pi grande della concentrazione dell'enzima [E] (reazioni di pseudoprimordine). A concentrazioni relativamente basse di substrato, Vo aumenta praticamente in modo lineare con l'aumento di [S]. A concentrazioni di substrato pi elevate, V0 aumenta in misura sempre minore in funzione dell'aumento di IS]. Alla ne si arriva ad un punto in cui gli aumenti di Vo in funzione di IS] diventano estremamente piccoli. In questa regione pi piatta della curva la velocit della reazione si avvicina alla velocit massima, Vmax. (la velocit smette di crescere quando tutti i siti degli n enzimi sono occupati dal substrato) Il complesso ES la chiave per la comprensione del comportamento cinetico degli enzimi come vedremo in seguito. Leffetto saturante del substrato una propriet caratteristica dei catalizzatori enzimatici ed responsabile dellappiattimento della curva.

Il meccanismo per una reazione catalizzata il seguente: Quando lenzima viene prima mescolato con un largo eccesso di substrato, vi un periodo iniziale, chiamato stato pre-stazionario, durante il quale avviene la formazione di ES. In genere questo periodo troppo breve per poter essere osservato, poich dura solo microsecondi. La reazione raggiunge rapidamente lo stato stato stazionario, in cui [ES]

rimane approssimativamente costante nel tempo. La Vo misurata in genere riette lo stato stazionario, anche se Vo limitata ai primi istanti della reazione.

LA RELAZIONE TRA CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO E VELOCIT DELLA REAZIONE Dato che in una reazione reversibile, la K4 prossima allo zero, poich se il prodotto restasse attaccato allenzima diventerebbe un suo inibitore, possiamo scrivere la reazione come:

La velocit Vo dipende dalla demolizione di ES per dare origine al prodotto e quindi direttamente proporzionale a [ES].

Dato che [ES] non facilmente misurabile dobbiamo trovare un espressione alternativa. quella di michaelis-menten. Michaelis e Menten formularono questa relazione sullipotesi di base che la tappa limitante di una reazione enzimatica fosse la demolizione del complesso ES (in quanto la reazione che ha una velocit pi lenta). Lequazione :

Passaggi matematici:

Bisogna fare ora una assunzione importante: la velocit iniziale della reazione riette uno stato stazionario in cui [ES] costante; in queste condizioni la velocit di formazione di ES diventa uguale a quella della sua demolizione. Questa assunzione si chiama assunzione dello stato stazionario. Allo stato stazionario, quindi, le espressioni delle Equazioni precedenti possono essere uguagliate:

Dall'equazione di Michaelis-Menten emerge un'importante relazione numerica nel caso particolare in cui V0 sia esattamente uguale a1/2 Vmax.

KM: una misura dellafnit dellenzima per il substrato, la quale valutata come una misura della [S] a cui si raggiunge met della Vmax. Si considera come una misura inversa dellafnit; Pi bassa Km, pi alta lafnit e viceversa. Inversa nel senso che se E-S si legano bene, la velocit della reazione bassa. Se si legano male alta. In un graco, pi Km a destra, meno afne. Per una reazione a due tappe Km cos espressa: Se k3 la costante che limita la velocit, si ha che k3 << k2 e Km si riduce a k2/k1, che viene detta costante di dissociazione del complesso ES. Quando si vericano queste condizioni, Km rappresenta una misura dellafnit dell enzima per il suo substrato nel complesso ES. Questa situazione non si applica per alla maggioranza degli enzimi. In alcuni casi si ha che k3 >> k2 e quindi Km = k3/k1. In altri casi ancora, i valori di k3 e k2 sono comparabili e quindi Km diventa una funzione pi complessa che dipende dalle tre costanti di velocit. E importante denire una costante di velocit pi generale, detta KCAT, necessaria per descrivere la tappa che limita la velocit di una reazione catalizzata da un enzima in condizioni di saturazione. Se la reazione costituita da diverse tappe e una di queste chiaramente quella limitante, kcat diventa uguale alla costante di velocit della tappa limitante. Per la reazione semplice denita dall'Equazione:

la kcat uguale a k3. La costante kcat una costante di primo ordine espressa dal reciproco del tempo. Essa viene detta anche numero di turnover ed equivale al numero di molecole di substrato che vengono convertite' in prodotto nell'unit di tempo da una singola molecola enzimatica quando lenzima saturo con il substrato. EFFICIENZA/POTERE CATALITICO. Il modo migliore per confrontare lefcienza catalitica di enzimi diversi, o dello stesso enzima con substrati diversi di paragonare il rapporto KCAT/KM.