Universidad Mayor Curso de Bioqumica General y Oral Carrera de Odontologa Espectrofotometra La espectrofotometra se basa en la capacidad que tienen las

molculas de absorber o emitir selectivamente ondas electromagnticas de una longitud de onda especfica, o mejor dicho, en un rango limitado del espectro de radiacin electromagntica. El principio bsico de la espectrofotometra es que las propiedades de absorcin de energa de las molculas pueden ser usadas para medir la concentracin de stas en solucin. Para la mayora de las aplicaciones de laboratorio se utilizan longitudes de onda en el rango ultravioleta (200-400 nm), visible (400-700 nm) o el rojo cercano (700-800 nm).

Rayos X Visible 10-11 10-9 10-7 10-5 10-3

Microondas 10-1 101 103

, cm
Rayos gamma Infrarrojo Ultravioleta Radio

Regiones del espectro magntico

Un fotmetro es un equipo que nos permite hacer mediciones a una longitud de onda () fija. Un espectrofotmetro adems de hacer lecturas a fijos nos permite hacer barridos, esto es hacer mediciones a distintas en una sola operacin y presentar el resultado como un grfico de la absorbancia versus . Los componentes bsicos de un espectrofotmetro son: Fuentes Lmparas de deuterio e hidrgeno. La excitacin elctrica de deuterio o hidrgeno a baja presin produce un espectro continuo en la regin UV, que es utilizable en la regin de 160 a 375 nm. Puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes de onda menores que 350 nm, las lmparas de deuterio requieren la utilizacin de cubetas de cuarzo. Lmparas de filamento de tungsteno. Es la fuente ms comn de radiacin visible e infrarrojo cercano, se utiliza en la regin de longitud de onda de 350 a 2500 nm.

Selectores de longitud de onda. Es la parte ms importante del equipo, determinando en gran parte su calidad. Son dispositivos que filtran el espectro producido por la fuente, dejando "pasar" slo radiaciones en un rango de longitud de onda determinada. Filtros de absorcin. Sirven para la regin visible del espectro y funcionan absorbiendo ciertas zonas de ste. El tipo ms usual es un vidrio coloreado o una suspensin de gelatina entre dos placas de vidrio. El ancho de banda proporcionado por este tipo de filtros es bastante ancho(30-250 nm). Filtros de interferencia. Proporciona bandas de radiacin bastante ms estrechas que el filtro de absorcin. Su funcionamiento se basa en la interferencia ptica, esto es, la interferencia destructiva entre la radiacin que se quiere eliminar. Monocromadores. Son superiores en calidad a los filtros. Existen dos tipos, los de red y los de prisma. Los principios de su funcionamiento estn fuera de los alcances de esta gua. Recipientes para la muestra Las celdas o cubetas que contienen la muestra deben fabricarse de un material que no interfiera con la radiacin que estamos utilizando. Para la regin del ultravioleta(bajo de 350nm) necesitamos cubetas de cuarzo. Tales cubetas son sumamente costosas, por lo tanto se deben manipular con extremo cuidado. En la regin entre 350 y 2000 nm se utilizan cubetas de vidrio de silicato. El plstico se puede utilizar para el visible(400-800nm). El ancho ms comn de una cubeta es de un centmetro. La calidad de los datos de absorbancia depende de manera crtica de la forma en que se usen y mantengan las cubetas. Las huellas dactilares, la grasa o la suciedad en las paredes alteran de forma notable las caractersticas de transmisin de una cubeta. La superficie de las ventanas no debe tocarse durante su manipulacin. Las cubetas no se deben frotar ni limpiar con abrasivos. Detector de radiacin y procesador de seales El detector es un transductor que convierte la energa radiante en una seal elctrica. El procesador es un dispositivo que amplifica la seal electrnica que recibe del detector. Algunos pueden realizar operaciones matemticas con la seal, tales como diferenciar, integrar o convertir en logaritmo.

La ley de Beer
Si hacemos incidir un haz de luz paralela sobre una solucin de una especie absorbente de concentracin c contenida en una cubeta de b cm de grosor(ver figura), el haz se atena de P0 hasta P. Donde P0 y P es la cantidad de energa radiante que incide en el detector por unidad de superficie y por unidad de tiempo(potencia radiante o intensidad de radiacin). La transmitancia T de la solucin es la fraccin de radiacin incidente transmitida por la solucin:

T= P/Po

P0
Solucin absorbente de concentracin c

La absorbancia A o densidad ptica de una solucin se define por la ecuacin

A = - log10 T = log P0/P

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud b que recorre la radiacin a travs de la solucin y a la concentracin de la especie absorbente. Como la longitud no varia y a es una constante de proporcionalidad tenemos una relacin lineal entre absorbancia y concentracin. De esta manera, si medimos la absorbancia de una solucin y conocemos el valor de a y el grosor de la cubeta (b) estamos en condiciones de calcular la concentracin c de la especie en solucin. Esta relacin se conoce como la ley de Lambert-Beer y se escribe usualmente como:

A= a b c
Donde A es la absorbancia de la muestra a es la absortividad o coeficiente de extincin, propio de cada compuesto. Su magnitud depende de las unidades utilizadas para b y c. Si b esta en centmetros y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de L g -1 cm-1 b es el grosor de la cubeta (cm) c es la concentracin del analito (g/L) Cuando c se expresa en moles por litro (mol/L o M), entonces a se cambia por , que es la absortividad molar o coeficiente de extincin molar. Entonces la ley de Beer queda as:

A= b c
Donde tiene unidades de L mol cm-1. La linealidad de la ley de Lambert-Beer esta limitada por factores qumicos e instrumentales. Estos pueden ser: Variaciones en la absortividad a altas concentraciones (>0.01M) debido a interacciones electrostticas de molculas muy cercanas entre s. Dispersin de la luz debido a la presencia de material particulado en la muestra. Fluorescencia o fosforescencia de la muestra. Cambios en el equilibrio qumico dependientes de la concentracin. Por ejemplo s el analito se asocia, disocia o reacciona con el disolvente en funcin de su concentracin.

Bibliografa A.D.Skoog, J.L.Leary, Anlisis Instrumental, cuarta edicin, McGraw-Hill, 1994