ARTIGO AVALIAO QUANTITATIVA DE CARDENOLDEOS NO CULTIVAR EXPERIMENTAL DE DIGITALIS LANATA DO MACIO DO ITATIAIA E PERSPECTIVAS DE SEU EMPREGO INDUSTRIAL Ferno

Castro Braga Departamento de Qumica - Instituto de Cincias Exatas - UFMG - Av. Antnio Carlos, 6627 - 31270-010 - Belo Horizonte - MG Wolfgang Kreis Lehrstuhl fr Pharmazeutische Biologie - Friedrich-Alexander Universitt, Staudtstrae 5 - D-91058 - Erlangen - Alemanha Rubens Almeida Rcio Fundao Ezequiel Dias (FUNED) - R. Conde Pereira Carneiro, 80 - 30510-010 - Belo Horizonte - MG Alade Braga de Oliveira Faculdade de Farmcia - UFMG - Av. Olegrio Maciel, 2360 - 30180-112 - Belo Horizonte - MG Recebido em 28/11/96; aceito em 17/3/97

QUANTITATIVE EVALUATION OF CARDENOLIDES IN A BRAZILIAN DIGITALIS LANATA CULTIVAR AND PERSPECTIVES OF ITS INDUSTRIAL USE. The content of digoxin and lanatoside C (jointly quantified), lanatoside A, lanatoside B, glucoevatromonoside, odorobioside G, glucogitoroside, glucoverodoxine, glucodigifucoside and digitalinum verum was determined by HPLC in Digitalis lanata harvested in Brazil, as well as in clones industrially employed for the production of cardenolides. The Brazilian plants presented greater variation in the contents of cardenolides than the analyzed clones. Lanatoside C and digoxin concentrations were higher in the clones (6120640 nmol/g dry leaf) than in the Brazilian plants (1820 900 nmol/g dry leaf). The concentrations of these glycosides were found to be within the range described for native species and also were similar to an European cultivar, what makes possible its industrial use for the cardenolides production. Keywords: Digitalis lanata ; Brazilian cultivar; cardenolides evaluation; clones.

INTRODUO A Digitalis lanata (Scrophulariaceae), planta nativa do centro e sudeste europeus, popularmente conhecida como dedaleira, a fonte industrial dos cardenoldeos lanatosdeo C (3) e digoxina (4) (Figura 1), empregados no tratamento da insuficincia cardaca congestiva (ICC). A incidncia e prevalncia da ICC tm aumentado nos ltimos anos, estimando-se um crescimento deste quadro com o incremento da idade mdia da populao1. Os digitlicos, os

diurticos e os inibidores da enzima conversora da angiotensina preenchem alguns dos requisitos desejveis em agentes de primeira linha para a terapia da ICC. No entanto, nenhum destes frmacos possui todas as caractersticas desejadas e seu uso individual no adequado ao tratamento da ICC, justificandose a busca por novas substncias ativas2. No perodo entre 1978-1988, vrios frmacos foram desenvolvidos e testados em pacientes com ICC, a uma velocidade de uma nova substncia a cada ms2. Entretanto, o retorno de todo este investimento para a obteno de novos frmacos inotrpicos suplementares

Cardenoldeo (1 ) (2 ) (3 ) (4 ) (5 ) (6 ) (7 ) (8 ) (9 ) (10) (11) Lanatosdeo A Lanatosdeo B Lanatosdeo C Digoxina Glicoevatromonosdeo Odorobiosdeo G Glicogitorosdeo Glicoverodoxina Glicodigifucosdeo Digitalinum verum Digitoxina

*R Gl--Acdx-Dx-DxGl--Acdx-Dx-DxGl--Acdx-Dx-DxDx-Dx-DxGl-DxGl-DtlGl-DxGl-DtlGl-FucGl-DtlDx-Dx-Dx-

R1 H H OH OH H H H H H H H

R2 H OH H H H H OH O-CHO H OH H

*Gl=glicose; Dx=digitoxose; Dtl=digitalose; Fuc=fucose; -AcDx=-acetildigitoxose.

Figura 1. Estruturas qumicas dos cardenoldeos analisados nas folhas de Digitalis lanata do cultivar experimental do macio do Itatiaia e de clones.

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ou substitutos dos glicosdeos digitlicos foi desapontador3. Os cardenoldeos isolados de Digitalis, ainda hoje, representam os frmacos mais freqentemente prescritos para o tratamento de ICC, apesar de seu baixo ndice teraputico1. A Digitalis lanata cultivada com fins industriais nos Pases Baixos, Equador e Estados Unidos4. At o presente, a sntese de cardenoldeos digitlicos ou sua obteno atravs de cultura de clulas no compete, economicamente, com a produo destes a partir de cultivares agrcolas de D. lanata. Para o estabelecimento de cultivares agrcolas selecionam-se plantas, em populaes nativas, contendo teores elevados dos glicosdeos de interesse industrial. Exemplos diversos destas triagens, utilizando tcnicas de radioimunoensaio, esto descritos na literatura5,6,7. Um aumento considervel nos teores de digoxina obtido em cultivares desenvolvidos a partir dos espcimens selecionados6. O cultivo experimental de D. lanata, em estufa ou no campo, visando avaliar a produo de cardenoldeos, foi conduzido em pases diversos como ndia8,9, ustria10, Alemanha11 e Frana12. Os cardenoldeos digitlicos, consumidos no Brasil, so importados. A D. lanata vem sendo cultivada experimentalmente no macio do Itatiaia, Minas Gerais, local com condies climticas favorveis ao desenvolvimento da espcie, objetivando-se estabelecer um cultivar a ser utilizado para futura produo industrial de cardenoldeos. O cultivar experimental consta de aproximadamente 8.000 plantas, em uma rea de 7.500 m2. A adaptao da D. lanata neste cultivar experimental foi comprovada atravs do estudo da flutuao das concentraes de cardenoldeos diversos, durante o primeiro e segundo perodos vegetativos, obtendo-se resultados semelhantes queles descritos para plantas nativas13. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial do cultivar experimental do macio do Itatiaia para explorao industrial. Para tanto, procedeu-se determinao quantitativa, neste cultivar, dos cardenoldeos de interesse teraputico, lanatosdeo C (3), digoxina (4), e digitoxina (11), e, tambm, de outros glicosdeos, sem aplicao teraputica, lanatosdeos A (1 ) e B (2), glicoevatromonosdeo (5), odorobiosdeo G (6), glico-gitorosdeo (7), glicoverodoxina (8), glicodigifucosdeo (9) e digitalinum verum (10). As estruturas qumicas dos cardenoldeos analisados esto representadas na figura 1. Estes cardenoldeos tambm foram quantificados em clones de D. lanata cultivados em estufa. Estes clones, desenvolvidos pela Boehringer (Mannheim, Alemanha), resultaram de processos de seleo e melhoramento gentico, sendo utilizados industrialmente para a produo de cardenoldeos. Os dados obtidos foram comparados e forneceram um perfil do cultivar experimental do macio do Itatiaia, representando os clones uma situao modelo a ser atingida. RESULTADOS E DISCUSSO A determinao dos cardenoldeos digitlicos, no presente trabalho, foi feita por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), utilizando-se o mtodo do padro interno14. Este mtodo foi escolhido devido a possibilidade de se quantificar, individualmente, os cardenoldeos de interesse teraputico e os outros glicosdeos, ao contrrio das tcnicas de radioimunoensaio anteriormente utilizadas, onde determinava-se a totalidade dos glicosdeos da srie C5,6,7. Cromatogramas empregados para a quantificao de cardenoldeos, no presente trabalho, para plantas do cultivar experimental do macio do Itatiaia e clones de D. lanata, esto representados nas figuras 2 e 3, respectivamente. As concentraes mdias dos cardenoldeos analisados no cultivar experimental do macio do Itatiaia e nos clones de D. lanata constam da tabela 1. As concentraes so expressas em nmol/g em folha seca, com os respectivos desvios-padro. Os dois grupos de dados foram submetidos a um teste t, obtendo-se diferenas estatisticamente significativas (p < 0,01) entre

Figura 2. Cromatograma, obtido por HPLC, do extrato das folhas de Digitalis lanata do cultivar experimental do macio do Itatiaia. Condies cromatogrficas: vide parte experimental. Identificao dos picos: 1, digitalinum verum; 2, glicoverodoxina; 3, glicogitorosdeo; 4, glicodigifucosdeo; 5, odorobiosdeo G; 6, lanatosdeo C e digoxina; 7, glicoevatromonosdeo; 8, -metildigoxina (padro interno); 9, lanatosdeo B; 10, lanatosdeo A; 11, digitoxina.

Figura 3. Cromatograma, obtido por HPLC, do extrato das folhas de clones de Digitalis lanata, desenvolvidos pela indstria farmacutica para a produo de cardenoldeos. Condies cromatogrficas: vide parte experimental. Identificao dos picos: 1, digitalinum verum; 2, glicoverodoxina; 3, glicogitorosdeo; 4, glicodigifucosdeo; 5, odorobiosdeo G; 6, lanatosdeo C e digoxina; 7, glicoevatromonosdeo; 8, -metil-digoxina (padro interno); 9, lanatosdeo B; 10, lanatosdeo A; 11, digitoxina.

os teores dos cardenoldeos quantificados, com exceo das concentraes de glicoevatromonosdeo, glicoverodoxina e digitalinum verum (p > 0,05). Estes resultados indicam haver uma diferena significativa nas concentraes dos cardenoldeos avaliados, entre as plantas do cultivar experimental e os clones de D. lanata. A variabilidade qumica intra-especfica de cada grupo tambm pode ser avaliada pela tabela 1, atravs dos valores percentuais dos desvios-padro. De uma forma geral, as plantas do cultivar experimental apresentaram maior variabilidade qumica intraespecfica do que os clones de D. lanata, evidenciado pelos valores mais elevados dos desvios-padro percentuais, com exceo do lanatosdeo B. A grande variao individual nas concentraes de cardenoldeos no cultivar experimental j era esperada, uma vez que estas plantas no foram submetidas a nenhum processo de seleo, sendo constitudas por indivduos com uma ampla base gentica. Avaliaes anteriores em populaes nativas e cultivares de D. lanata, de diferentes origens, indicaram uma alta variabilidade intra-especfica nos teores dos cardenoldeos quantificados5,6,7,12,15, de forma similar aos resultados descritos neste trabalho. Os clones de D. lanata, por sua vez, apresentaram uma maior homogeneidade qumica, representada pelos menores valores dos desvios-padro percentuais, uma vez

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Tabela 1.Concentraes mdias de cardenoldeos em folhas de Digitalis lanata do cultivar experimental do macio do Itatiaia e em clones empregados industrialmente para a produo de cardenoldeos da srie C. Cardenoldeo Lanatosdeo A Lanatosdeo B Lanatosdeo C + digoxina Glicoevatromonosdeo Odorobiosdeo G Glicogitorosdeo Glicoverodoxina Glicodigifucosdeo Digitalinum verum Digitoxina Total
a a

Cultivar Itatiaia 1080710 0290220 1820900 0240200 009090 1860690 0280130 2170740 0580340 002040 84501640

desvio-padro % 66 76 49 83 100 37 46 34 59 200 19

Clones 0080 20 0030 40 6120 640 0290 50 0170 40 0790 110 0320 60 1250 340 0600 110 0070 40 9730960

desvio-padro % 25 133 10 17 24 14 19 27 18 57 10

Valor p p p p p p p p p p p p < < < > < < > < > < < 0,01 0,01 0,01 0,05 0,01 0,01 0,05 0,01 0,05 0,01 0,01

Valores correspondentes mdia de 49 plantas analisadas em triplicata; bvalores correspondentes mdia de 25 clones analisados em triplicata. Os espcimens analisados, em ambos os grupos, tinham 12 meses de idade. As concentraes de cardenoldeos esto expressas em nmol/g em folha seca desvio-padro. A fim de se estimar a possibilidade de emprego industrial do cultivar experimental do macio do Itatiaia, a curto prazo, compararam-se os teores dos cardenoldeos determinados com aqueles descritos na literatura para D. lanata nativa ou cultivada em estufa. Para tanto, os teores dos cardenoldeos determinados no cultivar experimental e em clones de D. lanata, expressos em nmol/g em folha seca, foram convertidos em concentraes percentuais de cardenoldeos em folha seca, para comparao com dados da literatura. Na tabela 2 esto dispostos os resultados obtidos no presente estudo, as concentraes de plantas europias cultivadas em estufa16,17, os teores descritos para D. lanata nativa18 e para plantas nativas e cultivares15. A comparao destes valores no indica diferenas acentuadas entre as concentraes de cardenoldeos do cultivar experimental do macio do Itatiaia e teores de cultivares europeus e de plantas nativas. Os teores de lanatosdeo C e digoxina foram determinados em conjunto, no presente trabalho, porque estes so os cardenoldeos de interesse industrial. O teor mdio de digoxina, descrito na literatura para plantas nativas e cultivadas, bastante baixo (0,0050,02%)15, justificando-se, deste modo, a comparao dos teores conjuntos de digoxina e lanatosdeo C, no presente estudo, com as concentraes de lanatosdeo C em D. lanata de origens diversas (Tabela 2). A concentrao mdia de lanatosdeo C (determinada em conjunto com digoxina) do cultivar do macio do Itatiaia encontra-se dentro da faixa descrita para plantas nativas e prximas do teor de um cultivar europeu (Tabela 2), indicando a possibilidade, no estgio atual, de sua utilizao para a produo industrial de cardenoldeos. A melhoria da qualidade do cultivar deve ser buscada em um estgio posterior, a partir da multiplicao e micropropagao de plantas com altos teores, selecionadas dentro da populao avaliada13. O isolamento destes cardenoldeos, em escala industrial, uma tarefa laboriosa, devido ao grande nmero de cardenoldeos existentes nas folhas de D. lanata , e s concentraes reduzidas de lanatosdeo C e digoxina. No entanto, encontra-se descrito um processo de baixo custo para o isolamento de lanatosdeo C, cuja aplicao seria vivel em uma produo piloto 19 . Em resumo, verificou-se no trabalho relatado que o cultivar experimental de D. lanata do macio do Itatiaia apresenta uma concentrao mdia de lanatosdeo C (em conjunto com digoxina) comparvel quelas de plantas nativas e de um cultivar europeu, sendo, portanto, vivel a sua utilizao para a produo industrial de cardenoldeos.

que este material resultou da clonagem de plantas selecionadas, sendo constitudo por uma base gentica estreita. Os teores mdios de lanatosdeo C e digoxina, determinados em conjunto, nas plantas do cultivar experimental do macio do Itatiaia so inferiores queles dos clones (Tabela 1). O grfico da figura 4 representa os teores destes glicosdeos na concentrao total de cardenoldeos analisados, em ambos os grupos. Enquanto nas plantas do cultivar experimental lanatosdeo C e digoxina constituem 22% do total, este percentual atinge 62% nos clones. Esta considervel diferena fruto da triagem de milhares de plantas nativas, ao longo de anos, e pesquisas de inter-cruzamento e micropropagao para a obteno de espcimens com uma base gentica estreita. Deve-se salientar, mais uma vez, que as plantas do cultivar experimental do macio do Itatiaia no foram submetidas a qualquer processo de seleo ou aprimoramento gentico. A concentrao de alguns cardenoldeos como glicodigifucosdeo, glicogitorosdeo e lanatosdeo A bastante elevada nas plantas do cultivar experimental. Estes glicosdeos no possuem aplicao teraputica e seus teores foram substancialmente reduzidos nos clones, como resultado do processo de melhoramento.

Figura 4 . Concentraes mdias de lanatosdeo C e digoxina no teor mdio total de cardenoldeos analisados em Digitalis lanata, em plantas do cultivar experimental do macio do Itatiaia (n = 49) e clones desenvolvidos pela indstria farmacutica (n = 25). Cada amostra foi determinada em triplicata; as barras verticais representam o desvio-padro.

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Tabela 2. Teores mdios percentuais de cardenoldeos em Digitalis lanata de origens diversas. Glicosdeos Cardacos LA LB LC* Gev OG Ggr Gvdx Gdf DV Dt
a

Cultivar Itatiaiaa 0,105 0,029 0,179 0,016 0,060 0,127 0,020 0,152 0,040 0,005

Clonesb 0,008 0,003 0,603 0,019 0,011 0,054 0,022 0,087 0,041 0,006

Cultivar16 0,172 0,061 0,222 0,051 0,061 0,116 0,168 0,094 0,058 0,011

Cultivar15 0,110 0,033 0,194 0,007 0,117 0,045 0,125 0,152 0,073 nr

Nativas + Cultivadas14 00,08 00,01 00,08 00,02 0,001 00,02 00,02 00,01 00,02 0,005 0,24 0,05 0,24 0,06 0,003 0,12 0,10 0,03 0,12 0,02

Plantas Nativas17 0,05 0,01 0,10 0,01 - 0,25 - 0,05 - 0,30 - 0,05 nr 0,02 - 0,10 0,01 - 0,14 0,01 - 0,15 0,02 - 0,12 nr

n = 49, determinadas em triplicata; b n = 25, determinadas em triplicata. *Calculado em conjunto com digoxina para as plantas do cultivar experimental e os clones. nr: Valores no relatados. LA, lanatosdeo A; LB, lanatosdeo B; LC, lanatosdeo C; Gev, glicoevatromonosdeo; OG, odorobiosdeo G; Ggr, glicogitorosdeo; Gvdx, glicoverodoxina; Gdf, glicodigifucosdeo; DV, digitalinum verum; Dt, digitoxina. eludos com MeOH (2 mL). O eluato foi levado a resduo em bloco de aquecimento (40C) e, ento, retomado com MeOH (700 L). Esta soluo, aps centrifugao a 12.000 r.p.m., durante 10 min, foi empregada nas anlises por HPLC. Empregouse MeOH LiChroSolv (Merck) em todas as etapas, com exceo da extrao inicial. Cada amostra de D. lanata foi extrada e analisada em triplicata. Anlises por HPLC. As anlises foram realizadas em um cromatgrafo Hewlett-Packard 1090 srie II com detetor de diodearray (Walbronn, Alemanha). Empregou-se uma coluna ODS C18 (100 2.1 mm d.i.) (Hewlett-Packard, Grom, Alemanha) com temperatura de 40C, fluxo de 0,2 mL/min e comprimento de onda de 220 nm. Um gradiente de H2O (A) e 84% CH3CN (B) foi empregado para eluio: 0-5 min 85% A, 15% B; 5-10 min 80% A, 20% B; 10-12 min 80% A, 20% B; 12-25 min 73% A, 27% B; 25-35 min 55% A, 45% B; 35-50 min 40% A, 60% B; 50-52 min 5% A, 95% B. Acetonitrila grau LiChroSolv foi obtida da Merck (Darmstadt, Alemanha); a gua foi purificada atravs do sistema Milli-Q50 (Millipore, Eschborn, Alemanha). Identificao dos cardenoldeos. Os cardenoldeos foram identificados pela comparao dos tempos de reteno com aqueles de padres de cardenoldeos e pelos seus espectros no UV, obtidos no detetor de diode-array. Padres de cardenoldeos. Digoxina e lanatosdeos A, B e C foram obtidos da Roth (Karlsruhe, Alemanha); digitalinum verum, glicogitorosdeo, glicodigifucosdeo, glicoevatromonosdeo, odorobiosdeo G, glicoverodoxina e digitoxina foram obtidos da Boehringer (Mannheim, Alemanha). -metildigoxina (padro interno) foi uma doao do Prof. Kreis, da Universidade de Erlangen, Alemanha. Anlise estatstica. A anlise de varincia entre os dois grupos de plantas (teste t) foi realizada em computador, empregando-se o programa SigmaPlot, verso 4.02 (Jandel Co., EUA). AGRADECIMENTOS Ao CNPq pelas bolsas de especializao (RHAE) e doutorado (F. C. B.), e de pesquisador IA (A. B. O.). REFERNCIAS 1. Yusuf, S.; Garg, R.; Held, P.; Gorlin, R.; Am. J. Cardiol. 1992 , 69, 64G. 2. Packer, M.; Circulation 1989, 79, 198.

PARTE EXPERIMENTAL Condies de cultivo da Digitalis lanata no macio do Itatiaia. A multiplicao da D. lanata no cultivar experimental do macio do Itatiaia vem sendo feita pelo sistema de semeadura em estufas (viveiros), usando bandejas Plantmax contendo substrato estril (matria orgnica e vermiculita). O transplante das mudas para o campo ocorre quando as plantas tm de 6 a 8 folhas. A distncia entre as plantas no campo de 25 a 30 cm. Aps o transplante das mudas para o campo, as plantas so cultivadas sem nenhum processo de irrigao ou adubao. Condies de cultivo dos clones de Digitalis lanata. Os clones foram cultivados em estufa na Universidade de Tbingen, Alemanha, com fotoperodo de 16 horas, e temperaturas diurnas de 20C e noturnas de 15C. Coleta e secagem do material vegetal utilizado nas anlises. Quarenta e nove (49) espcimens de D. lanata do cultivar experimental e vinte e cinco clones (25) foram selecionados ao acaso. As plantas foram amostradas no perodo anterior florao, com 12 meses de idade. Cerca de 20 (vinte) folhas da poro intermediria da roseta foram coletadas para anlise. Aps a coleta, as folhas foram lavadas em gua e secas em estufa a 40C, durante 72 horas. Em seguida, as folhas foram pulverizadas em moinho de facas e o p obtido foi submetido extrao para a determinao quantitativa dos cardenoldeos. Extrao dos cardenoldeos para determinao quantitativa. A extrao dos cardenoldeos foi feita de acordo com o mtodo descrito na ref. 14, introduzindo-se algumas modificaes. Foram pesados, exatamente, cerca de 300 mg de p das folhas secas de D. lanata, adicionando-se, em seguida, 100L de uma soluo metanlica de -metildigoxina a 1,00 mg/mL, como padro interno. O material vegetal foi extrado com MeOH 70% (20,0 mL), sob refluxo, a 80 C, durante 10 minutos. Aps resfriamento, o extrato foi transferido para um tubo de centrfuga, adicionando-se gua bidestilada (40,0 mL). Em seguida, adicionou-se soluo aquosa a 15% de Pb(OAc)2 (5,0 mL) para precipitao de clorofilas, sendo o excesso deste reagente eliminado pela adio de soluo aquosa a 10% de Na2HPO4 (5,0 mL). A mistura foi centrifugada a 8.000 r.p.m, durante 10 min. Uma alquota do sobrenadante clarificado (10,0 mL) foi filtrada em coluna de Adsorbex-Polyspher RP-18 (Merck), previamente condicionada com MeOH (2 mL) e H2O (2 mL). A eluio da coluna foi efetuada sob presso reduzida produzida por trompa de vcuo. Em seguida, a coluna foi lavada com H2O (2 mL), para eliminao de impurezas polares, e os cardenoldeos foram

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