UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

MICROBIOLOGIA

PACHECO SALGADO CRISTIAN MICHEL

1

INDICE:
OBJETIVO.3 INTRODUCCION..3 RESUMEN.3 TINCION DE GRAM.8 MEDIOS DE CULTIVO....8 PRUEBAS Y MEDIOS DE CULTIVO9 MATERIALES..15 PROCEDIMIENTOS....16 RESULTADOS.....17 CONCLUSIONES.....19 REFERENCIAS....19
2

STREPTOCOCCUS

OBJETIVOS
Identificar al genero Streptococcus

META: Aislar, identificar, cuantificacin UFC de streptococcus

INTRODUCCIN
GENERO STREPTOCOCCUS El gnero Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos gram positivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas. La mayora de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen nicamente en una atmsfera enriquecida con dixido de carbono. Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar hidratos de carbono, proceso que produce cido lctico, y son catalasa-negativos, a diferencia de las especies del gnero Staphylococcus. Un gran nmero de especies estreptoccicas destacan pos su papel como patgenos humanos. Lamentablemente, la diferenciacin de las especies que componen este gnero es complicada debido a que se utilizan los tres sistemas diferentes parcialmente coincidentes enumerados a continuacin para clasificar a estos microorganismos: 1) propiedades serolgicas: grupo de Lancefield; 2) patrones hemolticos: hemlisis completa (beta), hemlisis incompleta (alfa) y ausencia de hemlisis, y 3) propiedades bioqumicas (fisiolgicas). Rebeca Lancefield desarroll en 1933 el sistema de clasificacin serolgica para diferenciar las cepas betahemolticas. La mayora de estas cepas y algunas de las alfa-hemolticas y no hemolticas poseen antgenos especficos de grupo, la mayora de los cuales son hidratos de carbono de la pared celular. Estos antgenos se pueden detectar fcilmente con pruebas inmunolgicas, y han sido tiles para identificacin rpida de algunos patgenos estreptoccicos. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes (clasificado como Streptococcus de grupo A) causa faringitis estreptoccica. El antgeno de grupo de este microorganismo se puede detectar en los exudados farngeos mediante inmunoanlisis rpido. La mayora (pero no todos) de los estreptococos alfa-hemolticos y no hemolticos carecen de los antgenos de la pared celular especficos de grupo. Estos microorganismos se deben identificar a travs de pruebas bioqumicas. No obstante, estos sistemas de clasificacin no son mutuamente excluyentes.

RESUMEN

ESPECIES DE STREPTOCOCCUS Streptococcus pyogenes. La especie ms importante de los estreptococos del grupo A es S. pyogenes originan diversas enfermedades supurativas y no supurativas. Aunque este microorganismo constituye la causa ms frecuente de faringitis bacteriana, la fama de estos microorganismos se debe a las llamativas enfermedades potencialmente mortales provocadas por bacterias necrosantes, como evidencia las publicaciones que han inundado tanto la literatura cientfica como la prensa sensacionalista. Fisiologa y Estructura.- Las cepas de S. pyogenes son cocos esfricos de dimetro comprendido entre 1 y 2 m que forman cadenas cortas en las muestras clnicas y cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivos. Su crecimiento es ptimo en el medio agar sangre enriquecido, pero se inhibe cuando contiene una concentracin elevada de glucosa. Despus de 24 horas de incubacin se observan colonias blancas de 1 a 2 mm con grandes zonas de -hemlisis. Cpsula.- Algunas cepas de S. pyogenes forman una cpsula externa de cido hialurnico que contiene molculas repetidas de cido glucurnico y N-acetilglucosamina. La cpsula no se diferencia a nivel antignico del cido hialurnico presente en los tejidos conjuntivos de mamfero, de modo que permite evitar la fagocitosis bacteriana. Es probable que las cepas encapsuladas de esta especie originen infecciones sistemticas graves. Patogenia e inmunidad.- La virulencia de los estreptococos del grupo A est determinada por la capacidad de las bacterias de adherirse a la superficie de las clulas del organismo anfitrin, invadir las clulas epiteliales, evitar la opsonizacin y la fagocitosis y producir una variedad de toxinas y de enzimas. Se ha demostrado que en la adherencia a las clulas del organismo anfitrin, median ms de 10 antgenos bacterianos distintos, siendo los ms importantes el cido teicoico, las protenas M y la protena F

ESTEPTOCOCOS IMPORTANTES. Microorganismo Origen histrico Streptococcus streptus, flexible; coccus, grano o baya (un grano o baya flexible; en referencia al aspecto de las largas y flexibles cadenas de cocos) S. agalactie agalactia, necesidad de leche (la cepa inicial [bautizada como S. mastitidis] originaba mastitis bovina) S. anginosus anginosus, relativo a la angina S. bovis bovis, bovino (asociado inicialmente a enfermedad en ganado bovino) S. constellatus constellatus, tachonado de estrellas (la cepa aislada inicialmente se encontraba inmersa en agar y la colonia de mayor tamao estaba rodeada de otras colonias ms pequeas; la formacin en satlite no tiene lugar alrededor de las colonias situadas sobre la superpie de una placa de agar) S. dysgalactiae dis, enfermo, duro; galactia, relativo de la leche (prdida de la secrecin de leche; las cepas causaban mastitis bovina) S. intermedius intermedius, intermedio (confusin inicial acerca de si se trataba de una bacteria aerobia o anaerobia) S. mitis mitis, leve (se pens, errneamente, que producia infecciones leves) S. mutans mutans, cambiante (cocos que pueden adoptar un aspecto bacilar, en especial cuando se aslan inicialmente de un cultivo) S. pneunomiae pneumon, los pulmones (causa neumona) S. pyogenes pyus, pus; gennaio, engendrar o producir (productos de pus; se asocia habitualmente a la formacin de pus en heridas) S. salivarius salivarius, salivar (se detecta en la saliva de la boca) CLASIFICACIN DE LOS PATGENOS ESTREPTOCCICOS MS FRECUENTES. Clasificacin bioqumica Clasificacin serolgica Patrn de hemlisis S. pyogenes A S. agalactiae B ; ocasionalmente no hemoltico S. dysgalactiae C, G Grupo S. anginosus A, C, F, G, no agrupables ; ocasionalmente o no hemoltico S. bovis D ; no hemoltico; ocasionalmente Grupo viridans No agrupable o no hemoltico S. pneumoniae No agrupable ENFERMEDADES POR ESTREPTOCOCOS: RESUMENES CLNICOS. Steptococcus pyogenes (grupo A) Infecciones supurativas Faringitis: faringe enrojecida con presencia frecuente de exudados; la linfadenopata cervical puede ser prominente. Escarlatina: exantema eritematoso difuso que comienza en el trax y se extiende posteriormente a las extremidades; complicacin de faringitis estreptoccica. Pioderma: infeccin cutnea localizada con vesculas que avanzan a pstulas; sin indicios de enfermedad sistmica. Erisipela: infeccin cutnea localizada con dolor, inflamacin, adenopata y sntomas sistemticos. Celulitis: infeccin cutnea que afecta a los tejidos subcutneos. Fascitis necrosante: infeccin profunda de la piel que provoca la destruccin de capas musculares y de tejido adiposo. Sndrome del shock txico: infeccin multiorgnica que remeda el sndrome del shock txico estafiloccico; no obstante, la mayor parte de los pacientes presentan bacteremia e indicios de fascitis. Otras enfermedades supurativas: se han reconocido otras infecciones, como la septicemia puerperal, la linfangitis y la neumona. Infecciones no supurativas Fiebre reumtica: caracterizada por alteraciones inflamatorias del corazn, articulaciones, vasos sanguneos y tejidos subcutneos. Glomerulonefritis aguda: inflamacin aguda de los glomrulos renales con edema, hipertensin, hematuria y proteinuria.

Streptococcus agalactiae (grupo B) Enfermedad neonatal de comienzo precoz: en el transcurso de los 7 das siguientes al nacimiento, los neonatos infectados desarrollan signos y sntomas de neumona, meningitis y septicemia. Enfermedad neonatal de comienzo tardo: ms de 1 semana despus del nacimiento, los neonatos presentan signos y sntomas de bacteriemia con meningitis. Infecciones en mujeres gestantes: ms a menudo, se manifiestan con infecciones del aparato urinario; pueden provocar bacteriemia y complicaciones diseminadas. Infecciones en otros pacientes adultos: las enfermedades ms frecuentes son la bacteriemia, la neumona, las infecciones seas y articulares y las infecciones cutneas y de partes blandas.

Otros estreptococos -hemolticos. Formacin de abscesos en tejidos profundos: asociada al grupo de S. anginosus. Faringitis: asociada a S. dysgalactiae; la enfermedad remeda la causada por S. pyogenes; pueden complicarse con glomerulonefritis aguda. Estreptococos del grupo viridans Formacin de abscesos en tejidos profundos: asociada al grupo S. anginosus. Steptococcus pneumoniae Neumona: inicio agudo con escalofros intensos y fiebre mantenida, tos productiva con esputo teido de sangre; consolidacin lobular. Meningitis: infeccin grave que afecta a las meniges y cursa con cefalea, fiebre y septicemia; elevada mortalidad y graves deficiencias neurolgicas en los supervivientes.

Bacteriemia: ms frecuente en pacientes aquejados de meningitis que en aquellos con neumona, otitis media o sinusitis; septicemia fulminante en pacientes asplnicos. 1

Streptococcus agalactiae CARACTERSTICAS GENERALES Streptococcus agalactiae, o estreptococo -hemoltico del grupo B (EGB), es un coco gram positivo, catalasa y oxidasa negativo, anaerobio facultativo, que se presenta formando cadenas de longitud variable. El EGB puede crecer en medios simples, aunque los medios suplementados con sangre o suero favorecen su crecimiento. Tras 1824 h de incubacin en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de dimetro, lisas y rodeadas por un halo de hemlisis, aunque existen algunas cepas no hemolticas. El empleo de medios selectivos favorece la recuperacin del EGB. Como agentes selectivos se emplean, gentamicina, cido nalidxico, colistina o cristal violeta. El EGB presenta, adems del antgeno polisacrido comn que le caracteriza como perteneciente al grupo B de Lancefield, antgenos polisacridos especficos y antgenos proteicos, que permiten su clasificacin en serotipos. IDENTIFICACIN Las pruebas bioqumicas ms utilizadas son el CAMP-test, la hidrlisis del hipurato y la resistencia a discos de bacitracina y cotrimoxazol, aunque ninguna de ellas es especfica. En medios de cultivo especiales, el EGB produce un pigmento de color rojo naranja, que es caracterstico, y que permite su identificacin directa, sin necesidad de otras pruebas. Las cepas no hemolticas no producen pigmento. La identificacin definitiva de EGB requiere la demostracin del antgeno especfico de grupo, por ejemplo mediante la aglutinacin con partculas de ltex. EPIDEMIOLOGA Y TRANSMISIN El EGB forma parte de la flora normal del tracto gastrointestinal desde donde coloniza la vagina y, a veces, el tracto urinario. La colonizacin del tracto genital puede ser intermitente y es un hecho importante en las gestantes, por la posibilidad de transmisin del EGB al recin nacido. Las tasas de colonizacin en las gestantes oscilan entre el 5 y el 35 %, dependiendo de la poblacin en estudio, de los medios y tcnicas de cultivo y de las reas anatmicas de las que se toma la muestra. En nuestro medio, del 11 al 13% de las gestantes son portadoras vaginales o rectales del EGB. En adultos, fuera del perodo postparto, las infecciones por el EGB se presentan, generalmente, como formas que complican otras patologas; en particular, la diabetes, las hepatopatas, el cncer, las alteraciones neurolgicas y la insuficiencia cardaca o renal. Las manifestaciones clnicas ms frecuentes son las infecciones de piel y tejidos blandos, la bacteriemia sin foco sptico evidente, la endocarditis, las infecciones del tracto urinario, la meningitis y las infecciones osteoarticulares.
1

Microbiologa Mdica. Quinta Edicin. Murray, Rosenthal, Pfaller. Pag:238-242.

DIAGNSTICO MICROBIOLGICO El diagnstico requiere la demostracin del microorganismo en sangre, lquido cefalorraqudeo (LCR) u otras muestras significativas, mediante cultivo. Las muestras de sangre pueden inocularse en cualquiera de los sistemas de hemocultivo habituales. En los recin nacidos, el aislamiento del EGB en las mucosas, aspirado gstrico, orina o superficies cutneas, por s solo, no tiene significado diagnstico, ya que no permite distinguir entre colonizacin e infeccin. La deteccin de antgeno en la sangre, LCR u orina, se ha empleado en el diagnstico precoz de la sepsis neonatal pero, en general, con poca especificidad, lo que no permite su empleo como nica prueba para el diagnstico etiolgico de este cuadro clnico. Sin embargo, el valor predictivo negativo de estas pruebas, prximo al 100%, las hace tiles, en algunos casos, para excluir a este microorganismo. TRATAMIENTO La penicilina G es el antibitico de eleccin para el tratamiento de las infecciones por este microorganismo. Tambin se utiliza habitualmente la combinacin de penicilina ms un aminoglucsido, generalmente la gentamicina, en el tratamiento de las infecciones graves, dada la sinergia que estos antibiticos presentan in vitro. La duracin del tratamiento es variable, segn la edad, gravedad, localizacin de la infeccin y respuesta clnica inicial. Algunos estudios recientes ponen de manifiesto un aumento de la resistencia del EGB a la eritromicina y la clindamicina (16 y 15% respectivamente), lo que puede plantear problemas a la hora de elegir la profilaxis antibitica ms adecuada en las gestantes alrgicas a los -lactmicos. En el tratamiento de la bacteriuria del embarazo, tambin suelen emplearse antibiticos de este grupo, manteniendo el tratamiento durante tres a siete das.2 Streptococcus pneumoniae Reino: Eubacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Streptococcaceae Gnero: Streptococcus Especie: S. pneumoniae El Steptococus pneumoniae fue identificado como causa de neumona entre los aos 1880-1890. En 1926 se le asigno el nombre de diplococus pneumoniae basndose en al tincin de Gram. Recin en 1974 se le dio el nombre de Streptococus pneumoniae debido a que crece en el medio liquido. Desde ah en adelante tambin se han identificado 90 serotipos lo cual se da ya que cada uno se estos serotipos posee una capa de polisacrido especifico. Streptococcus pneumoniae, es un microorganismo patgeno capaz de causar diversas infecciones y procesos invasivos severos. Se trata de una bacteria Gram. Positiva que presenta una forma oval y el extremo distal lanceolado. Es inmvil, no forma endosporas, y es un miembro alfa hemoltico del gnero Streptococcus. Generalmente, se presenta en forma de diplococo, aunque existen algunos factores que pueden inducir la formacin de cadenas. Neumococo es un patgeno casi exclusivamente humano causante de un gran nmero de infecciones como neumona, endocarditis y de procesos invasivos severos como meningitis, septicemia, etc. particularmente en ancianos, nios y personas inmunodeprimidas. El hbitat natural de neumococo es la faringe. Concepto y clasificacin. Son cocos gram positivos, lanceolados o dispuestos en cadenas y con una capsula de polisacrido que permite su tipificacin con antisueros especficos. Estos son caractersticos por ser solubles en las sales biliares, esto se debe a la accin de los agentes tensoactivos, los cuales probablemente retiran o inactivan los inhibidores de las autolisinas de la pared celular, dando paso a la lisis. El estreptococo pneumoniae se puede diferenciar del estreptococo viridans en que solo el primero es soluble en bilis, el viridans no. Y la otra diferencia es que el estreptococo pneumoniae se inhibe en la presencia de optoquina. El estreptococo viridans no se inhibe con la optoquina.

http://www.seimc.org/control/revi_Bacte/agalac.htm

A)

B)

En la imagen (A) tenemos un estreptococo viridans resistente a la optoquina, en la imagen (B) hay estreptococo pneumonae sensible a la optoquina. Estos microorganismos son muy difciles de cultivar ya que presentan una gran sensibilidad a agentes externos. . Microbiologa En el laboratorio se le identifica como cocos gram positivos que crecen en cadenas y ademas que son catalasanegativos. El Streptococus pneumoniae sintetiza la toxina neumolisina la cual degrada la hemoglobina a un producto verdoso de degeneracion y causa hemolis en agar de sangre, por lo que se le clasifica como -hemolitico. Estas cepas de neumococos en su mayoria (98%) son sensibles a etilhidrocupeina (optoquina) y ademas casi todas se disuelven por accion de sales biliares. Los principales componentes de su pared celular son el peptidoglican y el acido teicoico y la integridad de la pared esta dado por la prescencia de cadenas laterales peptidicas entrelazadas entre si por accion de enzimas como las transpeptidasas y carboxipeptidasas. Estas enzimas son inactivadas por los antibioticos -lactamicos. El S. pneumoniae contiene una sustancia especifica, la sustancia C y esta presente en todas las cepas. Su virulencia esta dada entre otros por proteinas de union a colina como la PspA que impide la fagocitosis, ademas que todas las cepas poseen una capsula polisacarida. Respecto a las cepas que producen mayor incidencia son las primeras descubiertas por lo que estas tiene un numero mas bajo, esto segn el sistema norteamericano. Pero el sistema danes que es el mas aceptado lo agrupo basandose en sus similitudes antigenicas. Epidemiologa S. pneumoniae coloniza al nasofaringe y se aisla entre el 5-10% de los adultos sanos y del 20-40% de los nios. Luego de su colonizacin pueden persistir de 2-4 semanas y an algunos casos hasta 6 meses. El contagio se produce por contacto proximo prolongado y este aumenta si se da en espacios cerrados. Tambien las salas cuna son lugares de diseminacin para los nios y para los adultos, las aglomeraciones como albergues, prisiones hogares de ancianos, entre otros. El riesgo no aumenta en colegios, lugares de trabajo e incluso hospitales. La insidencia es elevada en lactantes de hasta 2 aos y baja en adolescentes y adultos jvenes y asi la tasa se eleva luego de los 55 aos. La mayoria de los casos de neumona se debe al S.pneumoniae. aproximadamente 20/1000000 de los casos en adultos jvenes y 280/100000 en adultos mayores.Esta insidencia alcanza el maximo en invierno y desciende en verano

TINCIN DE GRAM

La tcnica de la tincin de Gram fue desarrollada por el bacterilogo dans Christian Gram en 1884. Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin de contraste: 1. Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta, que tie de violeta. 2. Se aade el mordiente, iodo. 3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de acetona o etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante. 4. Como colorante de contraste se aade safranina, que tie de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta ms intenso. El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en sus superficies externas. Las clulas Gram negativas poseen una capa de peptidoglicano delgada y una membrana ex-terna. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de membrana externa. La tincin de Gram es extraordinariamente til en clnica. Esta tcnica es, casi siempre, la primera prueba que se lleva a cabo en la identificacin de un microorganismo causante de una enfermedad, aislado de un paciente. Con slo un microscopio y unos cuantos botes de colorante podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram negativo, su morfologa celular y su agrupacin tpica. Esto, a veces, es suficiente para determinar con qu tipo de bacteria estamos trabajando. Es ms, el tratamiento de una infeccin depende de que el agente sea Gram positivo o Gram negativo, ya que algunos antibiticos actan Slo sobre los primeros, y otros sobre los segundos. La penicilina, por ejemplo, es ms efectiva contra bacterias Gram positivas; mientras que la estreptomicina v la tetraciclina acta sobre ambas.3

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

El tipo de medio que utiliza un microbilogo depende del microorganismo que est cultivando y el porqu de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mnimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rpida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composicin y uso. Medios definidos: es aquel del cual conocemos su composicin qumica exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos qumicos puros. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. As, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen ms despacio en ellos. Adems, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse. Medios complejos: Se desconoce la composicin qumica exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, casena (la protena de la leche), levaduras o soja. Un medio lquido complejo se denomina caldo. La casena u otras protenas que se aaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio cido, para hacerlas ms solubles y, por tanto, ms fciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrlisis parcial rompe las protenas en pptidos. Una hidrlisis total las degrada hasta aminocidos. A las protenas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas.

Medios selectivos: favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto qumico, como la azida sdca, el telurito potsico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. Ejemplo: agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina). Otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comun. Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras especies.Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+). Medios diferenciales Se utilizan para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hemates. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemlisis (muerte y lisis de los hemates). Algunas bacterias se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metablicos cidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Se emplean para demostrar alguna propiedad bioqumica de la bacteria como degradacin de hidratos de carbono, protenas, hidrlisis de la urea, etc., contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias el estudio en estos medios debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de este tipo, de uso preferencial en la bioidentificacin de bacilos Gram(-) ya que ellos no tienen caractersticas muy distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso ms corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azcar (TSI agar Medio de SIM, Caldo glucosado fosfatado, VogesProskauer o del rojo de metilo, Medio agar-citrato de sodio (Medio de Simmons- Medio caldo urea, etc.4 Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar bacterias entricas (del intestino) que causan disenteras. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey acta como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificacin. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas. Medios de enriquecimiento: Se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una poblacin mixta de gran tamao. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirn el tratamiento y podrn crecer. Las bacterias lijadoras de nitrgeno pueden seleccionarse cultivando el inculo de suelo en un medio libre de nitrgeno, donde slo ellas podrn crecer porque obtienen el nitrgeno de la atmsfera. Los eclogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto qumico txico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la nica fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en l podr ser utilizado en biorremediacin4

PRUEBAS Y MEDIOS DE CULTIVO

PRUEBA DE HEMOLISIS POR PICADURA En esta prueba se corrobora la hemlisis producida por los Streptococcus que pueden ser de tres tipos: la alfa, beta y gamma. La hemlisis alfa es color verdoso caf por que tiene estreptolisinas O, S que degrada el potasio dentro del eritrocito Hemlisis beta es un halo transparente por que se expresa una estreptolisina Hemlisis gamma es ninguna hemlisis, ni verde ni transparente PRUEBA DE QUELLUNG La prueba de Quellung consiste en mezclar un antisuero anticapsular con el esputo o cualquier otra muestra problema, lo que provoca la hinchazn de la cpsula bacteriana, puede verse al microscopio. Es una de las pruebas de identificacin para los Streptococcus.

43

http://209.85.173.104/search? q=cache:sp3LvVkZIIMJ:www.ucol.mx/acerca/coordinaciones/cgd/DGEMS/archivos/microbiologia.doc+gelosa+san gre&hl=es&ct=clnk&cd=11&gl=mx 4 http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap310.htm

PRUEBA DE CAMP Principio: A.- Sirve para determinar la capacidad de un microorganismo para producir y elaborar el dfactor CAMP que acta de manera sinrgica con la -hemolisina estafiloccica ( -lisina) sobre eritrocitos ovinos o bovinos para producir un fenmeno ltico en la unin de los 2 microorganismos. B.- Alternativas: Determinar el fenmeno de hemlisis sinrgica con el factor CAMP y la -hemolisina ( -toxina) de Clostridium perfringens. Determinar la produccin de fosfolipasa D, la que inhibe la reaccin de la prueba de CAMP. Objetivo: A.- Prueba de CAMP 1) Diferenciar e identificar de manera presuntiva cepas humanas o animales cepas de Streptococcus agalactiae del grupo B (+) de otras especies de Streptococcus (-) cuando se incuban en aerobiosis o condiciones reducidas de oxgeno (jarra para extincin de la vela). 2) Verificar o identificar especies patgenas hemolticas de Listeria junto con la produccin de cido a partir de D-Xilosa, L- ramnsido y -metil-D-mansido. a) Con Staphylococcus aureus subes. Aureus Determinar reacciones -hemolticas dudosas o dbiles (+d) de Listeria monocytogenes (+) y Listeria seeligeri (+d) Ayuda a distinguir Actinomyces neuii subes. Anitratus (+) y A. neuii subesp. Neuii (+) de otras especies Actinomyces(-) Ayuda a distinguir Corynebacterium Boris, Corynebacterium coylae (fuertemente+) y Corynebacterium glucoronolyticum de otras especies de Corynebacterium (-). Corynebacterium subesp. Afermentans y Corynebacterium striatum son variables en la prueba CAMP. La positividad CAMP es una caracterstica importante para Turicella otitidis. Mycobacterium arborescens es CAMP variable. b) Con Rodhococcus equi para identificar Listeria inanovii (+) B.- Prueba CAMP inversa 1) Para distinguir de manera presuntiva C. perfirgens (+) de otras especies de Clostridium formadoras de esporas y reductoras de sulfitos (-): altamente especfica para C. perfringens. 2) Para ayudar a distinguir Arcanobacterium haemolyticum (+) de Arcanobacterium pyogenes (-) y Arcanobacterium bernardiae (-) C.- Produccin de fosfolipasa D (PLD): Para distinguir Corynebacterium pseudotuberculosis (+) y Corynebacterium ulcerans (+) de otras especies Corynebacterium (-). Bioqumica: La prueba (reaccin) CAMP se basa en el hecho de que los estreptococos del grupo B producen un factor (CAMP) que acta de manera sinrgica con la -hemolisina de S. aureus subesp. Aureus en un medio agar con sangre ovina o bovina. El sinergismo es una accin coordinada o correlacionada por 2 o ms microorganismos; el sinergista, factor CAMP, es un adyuvante de la accin de otro microorganismo. (Macfaddin 33-34) Los estreptococos producen una protena termoestable difusible (factor CAMP) que aumenta la hemlisis de S. aureus produciendo esfingomielasa C que se une a las membranas del eritrocito por que el K+ que se extraiga (si se exponen al factor como el grupo B) sufra hemlisis en forma de flecha. Se produce en el grupo B 8estimula la hemlisis) y tambin a veces en los grupos C, F y G. PRUEBA DE CATALASA Principio: Probar la presencia de la enzima Catalasa Objetivo: (H2O2 al 3%) Principalmente para diferenciar entre los gneros Streptococcus (-) de Micrococcus (+) o de Staphylococcus (V+) o de ambos. Bacillus (+) de Clostridium (V-)

10

 Listeria monocytogenes (+) de Khurthia (+), Corynebacterium (+) de otros microorganismos que pueden ser similares morfologicamente: Erysipelothrix (-) de Lactobacillus (V-), espcies de Enterococcus (-) y Streptococcus del grupo B(-) Microorganismos grampositivos - Aerococcus urinae(+) de Aerococcus viridans (-) - Staphylococcus aureus subesp. Anaerobius (-); por lo general solo crece em anaerobiosis y S. saccharolytica (-) de otras espcies de Staphylococcus (+). (Macfaddin 74) Prueba de - LACTAMASA Principio: Establecer la sensibilidad de microorgansimos especficos a penicilinas sensibles a penicilinasa o a cefalosporinasa, determinada por su capacesidad de elaborar una enzima -lactamasa que hidroliza el anillo lactmico para producir cido penicilonico o cido cefalosporoico. Objetivo: Las -lactamasas se encuentran em uma variedad de gram+ y gram-. La importancia de las enzimas producidas por muchas bacterias entricas (Enterobacteriaceae) es menos clara y estas bacterias no deben probarse para la produccin de - lactamasa; su escaso valor se debe a la diversidad de enzimas con especifidades de sustrato diferentes que pueden producirse dentro de las especies o incluso por una sola cepa. (Macfaddin 236) Prueba del disco de OPTOQUINA Principio: Determinar la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina probando la fragilidad de la membrana celular bacteriana. Objetivo: El disco de optoquina se utiliza de manera especfica para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae (sensible; S) y otras especies de Streptococcus -hemolticos (viridans) (resistente; R); Mtodo fenotpico. Bioqumica: La optoquina es una sustancia qumica, clorhidrato de etilhidrocuprena. La etilhidrocuprena, base del disco de optoquina es completamente insoluble en agua. Sin embargo, el clorhidrato de etilhidrocuprena es completamente hidrosoluble. La optoquina es un derivado del alcaloide hidroquinina. Cuando el disco est impregnado con alrededor de 0.2ml de una disolucin acuosa 1:4.000 de la sustancia qumica, secada a 37C sirve para la diferenciacin de S. pneumoniae (las clulas se lisan debido a los cambios en la tensin superficial y se produce una zona de inhibicin por contacto con la optoquinona) y es bacteriosttica a una concentracin 1:500.000 a 1:100.000. Las otras especies de -Streptococcus requieren una concentracin 1:500 (o mayor) para inhibir el crecimiento. (Macfaddin 339) Prueba de la OXIDASA: Principio: Determinar la presencia de las enzimas oxidasas. (Ej de Reactivo: Clorhidrato de tetrametil fenilendiamina) Objetivo: A.- Diseada originalmente para identificar Neisseria; posteriormente para distinguir la familia Pseudomonadaceae de la familia Enterobacteriaceae oxidasa negativos (Slo Plesiomonas shigelloides es +). B.- La mayora de las bacterias gram+ son oxidasa negativas. Bioqumica: Se basa en la produccin bacteriana de una enzima oxidasa intracelular que se debe a un sistema de citocromo oxidasa (transporte de electrones y fijacin del N) que activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular, el que a su vez acta como aceptor de electrones en la fase Terminal del sistema de transferencia de electrones. (Macfaddin 344-345) Prueba de OXIDACIN FERMENTACIN (HUGH Y LEIFSON) O/F Principio: Determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilizacin. Objetivo: A.- Ayuda a la identificacin de bacterias anaerobias y aerobias facultativas. Para diferenciar bacilos gram- entricos y no entricos, aerobios a anaerobios facultativos de la familia Enterobacteriaceae, cuyos miembros son todos los fermentadores (F). Ayudar a la diferenciacin de los gneros Staphylococcus y Micrococcus. Especies de Staphylococcus: fermentadores de glucosa; excepto S. saprophyticus, fermentador dbil o no reactivo. Espcies de micrococcus; por lo comn oxidadoras de glucosa.

11

 Determinar movilidad y produccin de gas (CO2 y H2) debido al medio semislido. Bioqumica: Las bacterias utilizan carbohidratos ya sea por fermentacin u oxidacin. Algunas pueden metabolizar un hidrato de carbono (como se muestra por la produccin de cido) slo en condiciones aerobias; mientras que otras producen cido en ambos casos. La mayora de importancia mdica son anaerobias facultativas. (Macfaddin 354-355) Con sello + Sin sello + + Identificacin Metabolismo Fermentativo Oxidativo (Ej. Pseudomona) Ni F ni O (Ej. Streptococos) El medio de HUGH Y LEIFSON es un medio diferencial: la glucosa lo vuelve enriquecido ya que esta se desdobla y produce cido lctico acidificando el medio) que contiene azul de bromotimol (en medio cido vira a amarillo).

AGAR MUELLER HINTON Pruebas de sensibilidad a antibiticos y cultivo de Neisseria En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. Tambin se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas) Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar chocolote, previa adiccin de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en bao Mara a 80C 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningn momento. Usos: Es un medio til para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35C, en atmsfera de CO2. El medio deber mantenerse hmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodn hmedo y una vela encendida, cerrando luego hermticamente. Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse despus de 12 a 18 horas de incubacin. Despus de este tiempo se tendrn que revisar peridicamente las zonas de inhibicin ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentracin del agente antimicrobiano comienza a disminuir. Se obtiene mejores resultados para aislar Neisserias patgenas preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adicionndole a cada 100 ml del medio terminado y fluido 1.0 ml de la suspensin VCN, mas 1.0 ml del polienriquecimiento. (MANUAL BIOXON 28) BASE DE AGAR GC La Base de Agar Gelosa Chocolate es un medio utilizado con varios suplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria gonorrhoeae y otros microorganismos fastidiosos. Este medio tambin es conocido como Base de Agar GC. Diseada especialmente para aislar Neisserias patgenas, gonococo y meningococo cuando se le agrega hemoglobina, antimicrobianos y factores de crecimiento. En 1945 Jhonston describi un medio adecuado para observar las colonias de Neisseria gonrrhoeae en 24 horas en lugar de las 48 horas generalmente requeridas. El crecimiento acelerado fue debido a una reduccin en la concentracin de agar. Investigando el crecimiento de algunas cepas de neumococcos se observ que el medio conteniendo los factores de crecimiento glutamina y cocarboxilasa permiti una mejor recuperacin. A partir de esta observacin se desarrollaron suplementos de enriquecimiento que junto con la hemoglobina hacen a la Base de Agar GC un medio superior. La Base de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa Chocolate cuando es suplementada con hemoglobina al 2% que provee la hemina (Factor X) requerida para el crecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de Neisseria, as como suplementos (disponibles comercialmente) que proveen glutamina, cocarboxilasa, levadura, glutamina, coenzimas, hemina, vitaminas, aminocidos, dextrosa y otros factores de crecimiento, todos ellos necesarios para el mejor desarrollo de Haemophilus y Neisseria. Cuando a esta base se le adiciona adems inhibidores selectivos como el VCN o VCNT se prepara el Agar Thayer Martn y Thayer Martn Modificado. Tanto el polienriquecimiento como la mezcla VCN (Vancomicina, Colistin y Nistatina) son preparados liofilizadamente.

12

Usos: El espcimen se debe estriar en la superficie de la placa, de tal manera que una zona relativamente pequea se inocule masivamente. A partir de esta, continuar estriando suavemente y ligera a fin de lograr colonias aisladas. Se pueden identificar colonias de N. gonorrhoeae (blanco-grisceas opacas de 1-2mm) (BIOXON 38-39) Composicin: Mezcla de Peptonas 15.0 Fosfato Dipotsico 4.0 Almidn de Maz 1.0 Fosfato Monopotsico 1.0 Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriolgico 10.0 pH 7.2 0.2 La morfologa tpica colonia se describe: Haemophilus influenzae Colonias pequeas, hmedas, perladas con caracterstico olor hmedo Neisseria gonorrhoeae Colonias pequeas grisceas o incoloras, mucoides Neisseria meningitidis Colonias medianas a grandes, de color azul grisceo, mucoides. Streptococcus pneumoniae Colonias pequeas, planas, pueden aparecer verdes por la decoloracin del medio5 BASE DE AGAR SANGRE Aislamiento, cultivo y actividad hemoltica de grmenes difciles La base de Agar Sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difcil crecimiento. Al aadir sangre es adecuada para aislar bacilos tuberculosis. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. Usos: Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana de banco de sangre y 100 unidades de penicilina por mililitro ha dado resultados comparables con los del medio de Lowenstein-Jensen. La base de agar Sangre tambin puede usarse para la preparacin de antgenos.(BIOXON 39) Para el aislamiento, cultivo y deteccin de actividad hemoltica de Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de consistencia butircea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta hemlisis. Las colonias en medio slido son redondeadas, uniformes, Estos crecen rpidamente a 37 C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20 C). MEDIO CTA El medio Cistina-Tripticasena es empleado para conservar cepas, deteccin de movilidad y adicionado con carbohidratos para estudios de fermentacin de microorganismos muy exigentes y desarrollo difcil, tanto aerobios como anaerobios. Ideal para estudios bioqumicos de Neisserias patgenas. Usos: Repicado y mantenimiento de cepas: Los microorganismos exigentes y de cultivo difcil como Neisserias patgenas, Neumococcos, Estreptococos, Brucillas, Pasteurella, Corynebacterium, Vibrios y algunos otros, se reproducen fcilmente en el medio TCA sin que sea necesario agregarles suero o cualquier otro factor de crecimiento, ni colocar los cultivos en atmsfera de CO2. Es preferible usar este medio para anaerobios esporulados. Las cepas repicadas sin azcar duran bastante tiempo. La mayor parte de las veces se recomienda inocular el tercio superior de la columna del medio. Determinacin de la movilidad: Sembrar el medio semislido por picadura central sin llegar al fondo del tubo. Los microorganismos mviles, crecen a lo largo de la puncin y se difunden a todo lo largo de la masa del medio adquiriendo este un aspecto turbio. En cambio si el germen es mvil, el desarrollo slo se observa a lo largo y en el sitio de picadura, permaneciendo el resto del medio claro y transparente. Empleo en las reacciones de fermentacin y degradacin: Este medio carece de azcares y como es rico en nutrientes no es necesario agregarle suero sanguneo, suprimiendo as una fuente de carbohidratos indeseables. Los azcares pueden agregarse en polvo o impregnados en disco de papel.

http://www.mcd.com.mx/pdfs/BASE%20DE%20AGAR%20GC.pdf

13

El medio CTA no siempre da reacciones de fermentacin bien definidas con las enterobacterias ni con los clostridios. Estos grmenes tienden a reducir la Cistina presente en el mismo, dando a veces reacciones de interpretacin dudosa. (BIOXON 54) POLIENRIQUECIMIENTO La accin de VCN se refuerza decididamente al agregar al medio polienriquecimiento que se prepara de forma liofilizada, por lo que su estabilidad es indefinida, sobretodo en refrigeracin. Se reconstruye agregando el contenido (10ml) de un vial de lquido diluyente a un vial de producto liofilizado. Agitar en seguida unos cuantos minutos hasta que el material slido se disuelva. Agregar 1.0ml en la solucin de polienriquecimiento a 100ml de medio de cultivo, slido o lquido, que se desee enriquecer. Si se trata de un medio slido, por ejemplo Agar chocolate , base de agar Casman, este deber an estar fluido a una temperatura entre 45 y 50C. En general se utiliza para enriquecer con sus 12 factores y cofactores de desarrollo, a determinados medios de cultivo especialmente a aquellos diseados para aislar y multiplicar grmenes exigentes y delicados. Es indispensable para aislamiento de gonococos y meningococos.(BIOXON 71) Frmula aproximada en g/L Vitamina B-120.010 L-Glutamina...10.00 Adenina..1.000 Clorhidrato de Guanina0.030 cido p-aminobenzico0.013 L-Cstina.1.100 Glucosa..100.0 Nucletido de difosforitridina.. Oxidasa (Coenzima 1) 0.250 Cocarboxilasa0.100 Nitrato frrico.0.020 Clorhidrato de tiamina..0.003 Clorhidrato de cistena.25.90 BASE DE AGAR CASMAN Medio de enriquecimiento para el cultivo de Neisseria Gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus vaginalis y estreptococos patgenos; Microorganismos exigentes. Casman describi un medio enriquecido con sangre para microorganismos exigentes incubados en un ambiente anaerobio. Casman ajust el medio despus de que varios experimentos revelaran que la nicotinamida interrumpa la accin de una enzima sanguinea que inactivaba el factor V (NAD). Con posterioridad, la concentracin de nicotinamida se rebaj para favorecer el crecimiento de Neisseria. La proteosa peptona n 3, triptona y extracto de carne proporcionan nitrgeno, vitaminas y aminocidos. La nicotinamida favorece el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus influenzae impidiendo la liberacin de la coenzima (factor V) por medio de nucleotidasas procendentes del enriquecimiento con sangre. La dextrosa se aade para favorecer el crecimiento de cocos patgenos. El Cloruro sdico mantiene el balance osmtico en el medio. El almidn tiene como funcin asegurar que cualquier metabolito txico producido sea absorbido, neutralizar la inhibicin de betahemlisis por la glucosa y favorecer el crecimientode Neisseria. El agar bacteriolgico es el agente gelificante. Por su alto contenido en peptonas y otros factores nutritivos, da excelentes resultados para cultivar microorganismos exigentes; siendo especialmente empleado para aislar Haemophilus vaginalis del tracto urogenital. El medio base de agar casman funciona perfectamente tanto como GS y GC. Los resultados mejoran notablemente si se incuban en atmsfera de CO2 (tcnica de la vela). El almidn de maz y el uso de agar muy purificado incrementa notablemente el crecimiento de N. gonorrhoeae. La morfologa colonial tpica se describe as: Neisseria Gonorrhoeae: Crecimiento satisfactorio. Haemophilus influenzae: Crecimiento satisfactorio. Streptococcus pneumoniae: Crecimiento con alfa hemlisis.

14

 Streptococcus pyogenes: Crecimiento con beta hemlisis.6 Perxido de hidrgeno al 3% Uso de la sustancia o preparado: Para usos de laboratorio, anlisis, investigacin y qumica fina. Propiedades fsicas y qumicas Aspecto: Lquido transparente e incoloro. Olor: Caracterstico. Discos de penicilina La actividad delos discos de la penicilina primaria incluye no productores de -lactamasa, grampositivos y algunos bacterias gramnegativas fastidiosas, y. Las acilamina penicilinas (ampicilina y amoxicilina) tienen actividad especfica contra ms especies de gramnegativos, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras de Lactamasa. Carboxi- penicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina) tienen un amplio y considerable espectro contra gramnegativos, incluyendo actividad contra Pseudomonas spp.y Burkholderia spp. Penicilinas penicilinasa resistentes (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) que tienen un espectro predominantemente grampositivo, incluyendo Staphylococcus spp. productor de penicilinasas.El mtodo de difusin con un disco de penicilina no es un mtodo fiable para la deteccin de la resistencia a dicho antibitico, debido a la ausencia de correlacin entre los halos de inhibicin del disco de penicilina y la CMI correspondiente. As, las cepas con resistencia intermedia o de bajo nivel a la penicilina (CIM entre 0,12 g/ml y 1 g/ml) pueden presentar halos de inhibicin con el disco de penicilina relativamente grandes. Reactivo para oxidasa (Clorhidrato de tetrametil fenilendiamina) El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil- pfenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso. Sacarosa Sacarosa est regulada principalmente en tres pasos, los catalizados por la fructosa-1,6-bisfosfatasa, sacarosa-6fosfato sintasa y sacarosa fosfato fosfatasa. Cuando la luz incide por primera vez sobre la hoja por la maana, aumentan los niveles de triosa fosfato en el citosol (provenientes de la fijacin de carbono en el cloroplasto). Las triosas fosfato inhiben la actividad de la fosfofructoquinasa-2 disminuyendo los niveles de fructosa-2,6-bisfosfato. Esto libera la inhibicin de la fructosa-1,6-bisfosfatasa, lo que permite la sntesis de fructosa-6-fosfato y as de otras hexosas fosfato, incluida la glucosa-6-fosfato. La glucosa-6-fosfato es un activador alostrico de la sacarosa-6-fosfato sintasa. La sacarosa fosfato fosfatasa cataliza el paso final en la sntesis de sacarosa a medida que dispone de sustrato.7

MATERIAL

40 cajas petri estriles 2 mecheros fisher 1 pizeta 1 agitador magntico 30 tubos de tapa de rosca chicos 2 gradillas 4 matraces Erlenmeyer 1L 1 esptula 4 asa y portasa 1 probeta 500ml Papel craft Papel encerado 2 pipetas estriles 5 y 10ml Gasa Algodn REACTIVOS
6 7

http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_casman.pdf Microbiologa de Prescott, L.M y Harley, J.P y Klein, D.A, Mac Graw Hill, Madrid Espaa 4 edicin (2001) p.p 39, 198-201)

15

 Base de agar Casman Perxido de hidrgeno al 3% Discos de penicilina Discos de optoquina Reactivo para oxidasa (Clorhidrato de tetrametil fenilendiamina) Medio de Hugh y Leifson Agar Mueller Hinton Base de agar Sangre Base de agar GC Polienriquecimiento liofilizado y su diluyente Sorbitol 70% sacarosa EQUIPO Autoclave Refrigerador Parrilla Balanza semianaltica Estufa Microscopio MATERIAL BIOLGICO S. agalactiae S. pyogenes Sangre de carnero desfibrinada

PROCEDIMIENTO

Primera sesin 1. Se procede a preparar los medios que se van a utilizar para la identificacin de posibles microorganismos. Como son: Base de Agar Sangre Preparacin: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Despus de esto enfriar a 4 50C y aadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estriles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo.

Tambin es posible inocular el fondo de una caja petri estril con un pequeo inculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50C; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra. En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapn de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estriles

Base de agar chocolate

Suspender 7.2 g del medio en 100 mL de agua purificada para obtener una base de doble concentracin, mezclar y dejar reposar durante 5 minutos, calentar con agitacin frecuente hasta completar la disolucin del polvo y hervir durante un minuto. Por otro lado, preparar 100 mL de una solucin de hemoglobina al 2% adicionando gradualmente agua a 2 g de hemoglobina seca para obtener una solucin uniforme. Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar las soluciones a una temperatura de 4550 C, mezclar y agregar los dems ingredientes dependiendo del medio que se desee preparar. Homogenizar y vaciar en placas Petri estriles. Procedimiento: 1. Procesar las muestras y sembrar las placas inicialmente en forma de Z y posteriormente estriando. 2. Incubar en atmsfera aerbica enriquecida con CO2 a 35 2C por 18 a 24 y hasta 48 horas y observar el crecimiento.

16

Agar Mueller Hinton Preparacin: Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121C por un tiempo no mayor de 15 minutos.

Enfriar a 40-45C y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar chocolote, previa adiccin de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en bao maria a 80C 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningun momento. Segunda sesin 2. Se siembra los medios de GS y GC inoculando por estra cruzada las cepas de S. pyogenes y S. agalactiae 3. En el medio de CASMAN se hace la prueba de CAMP haciendo una estra de S. aureus vertical e inocular perpendicular S. pyogenes y S. agalactiae. 4. En el medio de Muller-Hinton se realiza la prueba de sensibilidad de Optoquina despus de la estra masiva de la bacteria. 5. Incubacin de las placas a 35C, durante 24 a 48 hrs. Tercera sesin: 6. Observacin de las caractersticas macroscpicas en cada medio sembrado 7. Realizacin de frotis al Gram de colonias. Observacin a inmesrsin 8. Medir el halo de inhibin (si se present) con un regla y determinar posible tratamiento. 9. Realizacin y lectura de la prueba de coagulasa, oxidasa y catalasa. 10. Identificacin de microorganismo a partir de los resultados obtenidos.

RESULTADOS
CARACTERSTICAS Con sello: negativo Sin sello: negativo Por lo tanto: Ni oxidativo ni fermentativo Observaciones: Se observ crecimiento turbio en ambos tubos por lo que se deduce que es anaerobio facultativo IMAGEN

MEDIO DE CULTIVO Y/O BACTERIA O/F Streptococcus agalactiae

MUELLER- HINTON (2 discos de penicilina Y 2 discos de optoquina) Streptococcus agalactiae

No hubo crecimiento en el medio

MUELLER- HINTON (1 disco de penicilina Y 1 disco de optoquina) Streptococcus pyogenes

Slo hubo crecimiento en la optoquina Por lo tanto es: resistente a la optoquina Y sensible a la penicilina Halo de inhibicin: 1cm.

17

Prueba de CAMP Streptococcus agalactiae Y Streptococcus pyogenes (en medio S. aureus ATCC 25923)

Formacin de hemlisis en forma De flecha para: S. agalactiae Hemlisis para: S. pyogenes

GELOSA SANGRE (Por picadura) Streptococcus pyogenes

Hemlisis Colonias pequeas, en puntillos Entre blancas y grises

GELOSA SANGRE Streptococcus agalactiae

Hemlisis Colonias muy pequeas Entre blancas y transparentes

GELOSA CHOCOLATE Streptococcus pyogenes

Hemlisis Colonias muy pequeas redondeadas y uniformes transparentes

GELOSA CHOCOLATE Streptococcus agalactiae

Hemlisis Colonias muy grandes, convexas y abundantes; de consistencia butircea, con bordes regulares, cremosas y blancasgrisceas

DISCUSIN DE RESULTADOS

La primer prueba que se realiz fue en el medio O/F con S. agalactie en el cul la prueba nos dio que su metabolismo no es ni oxidativo ni fermentativo ya que esta es una caracterstica de este gnero en este medio. Tambin se logr comprobar la forma de respiracin de aporte de oxgeno de esta bacteria que es anaerobia facultativa ya que hubo crecimiento en ambos tubos. La segunda prueba que se realiz fue en el medio Mueller Hinton ( con 2 discos de penicilina y 2 discos de optoquina) con Streptococcus agalactiae en el cul no hubo crecimiento; para la penicilina este gnero es sensible debido a que no tiene la enzima -lactamasa; sin embargo debi de haber dado crecimiento para la optoquina ya que

18

es resistente a este antibitico, por lo cual se deduce que no se realiz adecuadamente la siembra del microorganismo en el medio. La tercer prueba se realiz tambin en el medio Mueller Hinton ( con 1 disco de penicilina y 1 disco de optoquina) con Streptococcus pyogenes en el cul no hubo crecimiento a un halo de 1cm de halo del disco de penicilina debido a que es sensible a este antibitico debido a que no tiene la capacidad de elaborar la enzima -lactamasa que hidroliza el anillo -lactmico para producir cido penicilonico, razn por la cul la bacteria es inhibida; sin embargo si hubo crecimiento en la prueba del disco de optoquina demostrando as su resistencia a esta sustancia qumica ya que el nico streptococo que da positivo es Streptococcus pneumoniae. En la prueba de CAMP se observ que dio positivo para S. agalactiae dando una hemlisis en forma de flecha (ya que tiene la capacidad de producir y elaborar el factor CAMP que acta de manera sinrgica con la -hemolisina estafiloccica ( -lisina o esfingomielinasa C de S. aureus ATCC 25923) sobre eritrocitos para producir un fenmeno ltico en la unin de los 2 microorganismos que se observa con la flecha amarilla que se produce; esta es una reaccin comn de los streptococos del grupo B, con lo que se puede deducir que si se trata de este microorganismo ya que por ejemplo para S. pyogenes nos dio la prueba negativa ya que no produce el factor de CAMP que es una protena termoestable difusible que aumenta la hemlisis de S. aureus. En la siembra de GS por picadura de S. pyogenes se puede observar la actividad hemoltica ms clara de este microorganismo ya que se observ una hemlisis caracterstica de este grupo ya que normalmente posee los 3 tipos de hemlisis. Para S. agalactiae se observ una hemlisis tambin la cual siempre es su patrn hemoltico. En GC para S. pyogenes, se observ crecimiento y hemlisis ; hubo crecimiento de las colonias; para S. agalactiae tambin se observ crecimiento pero ms abundante y con hemlisis ; en este medio al agregar el polienriquecimiento se asegur el crecimiento de los microorganismos ya que este contiene 12 factores y cofactores de desarrollo que sirven para aislar y multiplicar microorganismos exigentes como es el caso de estos 2 microorganismos.

CONCLUSIONES

En esta practica se realizaron diferentes prueba para poder identificarlos al genero Streptococcus. Pruebas como fueron la de CAMP, de Optoquina y hemlisis por picadura. En la prueba de CAMP se coloco una estra de S. aureus vertical, inoculando perpendicularmente a S. agalactiae y S. pyogenes, dando positivo (formacin de una hemlisis en forma de flecha) S. agalactiae esto demuestra la produccin de la protena termoestable (factor K) que aumento la hemlisis de S.aureus que produce la esfingomilasa que ayuda a la estreptolisina que ayuda a la estreptolisina a que sea di fusible a travs del medio. En la prueba de Optoquina que se utiliza para poder descartar la presencia de S. pneumoniae y demostrar la presencia de los grupo A y B, ya que ambos grupos son resistentes a este. Sin embargo al hacer esta prueba tambin se utilizo Penicilina donde se demostr sensibilidad (de un halo de 1 cm) en S. pyogenes, lo que no ocurri con S. agalactiae. Se realizo tambin la hemlisis por picadura en esta prueba se inocularon S. pyogenes y S. agalactiae donde efectivamente se formaron hemlisis en las picaduras realizadas al medio. Donde S. pyogenes realiza su actividad hemoltica caracterstica de ella ya que normalmente posee los 3 tipos de hemlisis ( , y ). Y en S. agalactiae la hemlisis presentada es su patrn hemoltico. En las caractersticas culturales del desarrollo de las bacterias se observa que en S. agalactiae se efectu una hemlisis dada por que se expresa una estreptolisina y crecimiento abundante. En S. pyogenes se observo un crecimiento muy abundante y hemlisis en agar GS y en GC se produjo una hemlisis lo cual se da por que no tiene estreptolisina O,S, degradando el potasio que se encuentra dentro de los eritrocitos. Demostrando con esto las diferencias para identificarlos entre S. pyogenes y S. agalactiae que cada uno tiene. Aunque se relacionan mucho existen este tipo de pruebas las cuales nos ayudan mucho en la diferenciacin y no son las nicas existen muchas mas.

REFERENCIAS

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm http://209.85.173.104/search? q=cache:sp3LvVkZIIMJ:www.ucol.mx/acerca/coordinaciones/cgd/DGEMS/archivos/microbiologia.doc+gelosa+sangr e&hl=es&ct=clnk&cd=11&gl=mx Mac Faddin J. F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. ED Panamericana 3ra edicin 2003, Buenos Ares Argentina. Pp. 33, 34, 74, 236, 339, 344, 345, 354 y 355

19

 Manual BIOXON pp. 28, 38, 39, 54 y 71 http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_casman.pdf

http://www.mcd.com.mx/pdfs/BASE%20DE%20AGAR%20GC.pdf Microbiologa Mdica. Quinta Edicin. Murray, Rosenthal, Pfaller. Pag:238-242. http://www.seimc.org/control/revi_Bacte/agalac.htm http://s-pneumoniae.blogspot.com/ Brock, Biologa de los Microorganismos. Sptima edicin. Madigan, et al. ED. Pearson educacin. Madrid, Espaa. P.p. 160-163 Microbiologia. Cuarta edicin. Prescott, L.M et al. ED. Mac Graw Hill. Madrid, Espaa. P.p 39, 198-201.

20