Anexo 1: Mtodos Analticos

M t o d o s

A n a l t i c o s

Seleccin y validacin de los mtodos

analticos
Una de las etapas de la vigilancia de la seguridad qumica de los alimentos es la obtencin de datos acerca de los niveles de determinadas sustancias que pueden estar presentes en los alimentos (contaminantes, residuos, aditivos y nutrientes). La obtencin de estos datos es el resultado de un proceso que comienza con la seleccin y validacin de un mtodo analtico, cuya ejecucin ha de ser permanentemente controlada. El anlisis de residuos y contaminantes en los alimentos supone la determinacin de sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas (del orden de mg/kg o g/kg) en matrices muy complejas. Es preciso por tanto realizar en primer lugar una extraccin cuantitativa de la sustancia y purificar y/o concentrar el extracto obtenido antes de proceder a su deteccin y cuantificacin. Para la correcta seleccin de un mtodo analtico, entendiendo como mtodo el conjunto sucesivo de las fases indicadas de extraccin, purificacin y determinacin (deteccin y/o cuantificacin), es preciso considerar todos aquellos factores que pueden influir en la validez del resultado, en relacin a los motivos que han originado su demanda. Uno de estos factores es el lmite de deteccin y/o cuantificacin requerido. La propia naturaleza del estudio de dieta total que ha sido elegido (agrupacin de los alimentos y anlisis de los grupos), hace que las sustancias aportadas por uno de los alimentos puedan sufrir un efecto de dilucin importante dentro de su grupo. Es preciso conseguir lmites de determinacin muy bajos para realizar las cuantificaciones en estas circunstancias. Adems, el mtodo aplicado para evaluar las ingestas utiliza con frecuencia la aproximacin ms conservadora en la que los valores inferiores al lmite de deteccin son considerados iguales a ste. Si los lmites de deteccin no son lo suficientemente bajos se producira una sobreestimacin tal que podra invalidar las conclusiones de la evaluacin. En otros casos, como por ejemplo en el anlisis de residuos de medicamentos veterinarios para los que se ha establecido un Lmite Mximo de Residuos (LMR), el lmite de determinacin necesario estar condicionado por el LMR de la sustancia a analizar. Este factor no slo es fundamental en la seleccin del mtodo analtico, sino que es determinante en la dificultad que presentar la ejecucin posterior, ya que trabajar con lmites de determinacin muy bajos dificulta la obtencin de una precisin y exactitud adecuadas a esos niveles. Cualquier mtodo analtico antes de ser utilizado es validado; es decir, se realizan las comprobaciones que aseguran que el mtodo es cientficamente correcto en las condiciones en que va a ser aplicado. En el proceso de validacin se comprueban sus caractersticas tcnicas en cuanto a selectividad y especificidad, sensibilidad, linealidad, lmites de deteccin,

M
s m t o d o s a n a l t i c o

145

Mtodos Analticos

determinacin o cuantificacin, exactitud y precisin, siguiendo Normas internacionales y/o Directivas comunitarias 2,3,4,5. El proceso para determinar la exactitud de los mtodos se lleva a cabo con materiales de referencia certificados, si es posible, o con muestras enriquecidas artificialmente en el caso de no disponer de los materiales de referencia adecuados. La precisin del mtodo se calcula mediante el anlisis repetido de una misma muestra. Otro aspecto que interesa tener en cuenta es la practicabilidad del mtodo analtico, es decir, la capacidad de respuesta del mtodo en las condiciones de disponibilidad de recursos del laboratorio en el que se realiza. El nmero de muestras que se pueden analizar en un periodo de tiempo concreto, as como el tiempo de respuesta desde que la muestra entra en el laboratorio, pueden ser parmetros decisivos en aquellos casos en que la toma de muestras implica una retencin cautelar de productos hasta conocerse los resultados analticos. Una estrategia analtica que implique dos tipos de mtodos: criba y confirmacin es, en muchos casos, la mejor aproximacin. Por ltimo es preciso verificar da a da los resultados analticos obtenidos y, adems, comprobar que son comparables con los resultados de otros laboratorios. Para lograr ambos objetivos es preciso disponer de un programa sistemtico de control de calidad interno y participar en ensayos de aptitud e intercomparacin entre distintos laboratorios. Los procedimientos correspondientes a todas estas acciones, deben ir enmarcados en el sistema de aseguramiento de la calidad del laboratorio, que ha de ser implantado de acuerdo a normas internacionales. Los requisitos que deben cumplir los laboratorios que se dedican al control
6 oficial de alimentos se contemplan en el artculo 3 de la Directiva 93/99 sobre medidas

adicionales de control oficial de productos alimenticios. En el punto 3.1 se seala, entre otras medidas, la necesidad de cumplir con la norma europea EN 45001 7. Esta Directiva fue incorporada al ordenamiento jurdico espaol mediante el Real Decreto 1397/19958. El control de calidad interno se lleva a cabo a travs del anlisis de blancos, duplicados de muestras y muestras de control en cada una de las tandas analticas. Estas muestras de control pueden ser materiales de referencia certificados, muestras evaluadas respecto a materiales de referencia o muestras enriquecidas artificialmente. Los datos analticos obtenidos se revisan en relacin a los resultados de esas muestras de control y teniendo en cuenta, cuando existen, los criterios establecidos por la Unin Europea para la identificacin y cuantificacin de residuos
3,4,5

Respecto al control de calidad externo, el Laboratorio de Salud Pblica del Departamento de Sanidad del Gobierno Vasco considera que es fundamental participar en los ejercicios de intercomparacin y ensayos de aptitud que se organizan a nivel nacional e internacional en las reas analticas de trabajo habitual del laboratorio. Entre los ensayos de aptitud relacionados con la seguridad qumica de alimentos, el laboratorio participa sistemticamente en FAPAS
R 9

en las siguientes reas: serie II: residuos de

medicamentos veterinarios; serie IV: aflatoxinas; serie V: plaguicidas organoclorados; serie VII:

146

elementos traza; serie IX: plaguicidas organofosforados y serie XV: nitratos. En 1990-91 particip en Smalley Check Sample para aflatoxina M1, organizado por la American Oil Chemists Society (AOCS). En 1991 y 1994 particip en Aflatoxin Check Sample Survey Programme organizado por la OMS y en 1993 tom parte en los ejercicios de aptitud organizados por GEMS/FOOD-EURO para anlisis de aflatoxinas, elementos traza, nitratos y plaguicidas. Respecto a ejercicios de intercomparacin, el laboratorio ha participado en los ensayos organizados en 1990, 1991, 1992 y 1993 por la Sociedad Espaola de Qumica Analtica para trazas de metales pesados y plaguicidas. Ha tomado parte en Pesticides (N,P-compounds) in cereals. Intercomparison studios organizado en 1995 por el Community Bureau of Reference (BCR) y participa en el Collaborative study of CEN multiresidue methods for the enforcement of EU-MRLs for pesticides in fruit, vegetables and grain previsto para 1996. Tambin participa habitualmente en los ensayos organizados por el Centro Nacional de Alimentacin (CNA) del Instituto Carlos III para anlisis de residuos de medicamentos veterinarios.

Metales pesados y arsnico

El mercurio y el arsnico se analizaron inicialmente en todos los grupos de la dieta. La destruccin de la materia orgnica se realiz por va hmeda con cido ntrico y sulfrico, excepto en el grupo de pescado. El arsnico total se cuantific por espectrofotometra de absorcin atmica con generacin de hidruros (HAAS) y el mercurio por espectrofotometra de absorcin atmica con la tcnica de vapor fro. Los lmites de cuantificacin para ambos elementos oscilaron entre 1 y 5 g/kg, segn los grupos de la dieta. Una descripcin detallada de los parmetros de validacin del mtodo (materiales de referencia utilizados, precisin,
10 exactitud, etc.) ha sido previamente publicada .

La destruccin de la materia orgnica para determinar el arsnico total en el grupo de pescado se lleva a cabo por calcinacin de las muestras a 450C utilizando Mg (NO3)2.6H2O y MgO como agente calcinante. La cuantificacin se realiza por HAAS con un lmite de cuantificacin de 2 g/kg. La determinacin de mercurio en pescado se realiza por espectrofotometra de absorcin atmica con vapor fro utilizando un sistema de inyeccin de flujo, cuantificando con un mtodo de adicin de patrones. Previamente se digiere la muestra con cido ntrico y perxido de hidrgeno, en recipientes cerrados a presin dentro de un sistema de microondas. Los mtodos analticos para ambos elementos en el grupo del pescado fueron validados utilizando los materiales de referencia certificados (CRM) por el BCR nmeros 422 y 278. La exactitud, expresada como porcentaje de recuperacin, es superior al 99% en el caso del arsnico y al 96% en el del mercurio. La imprecisin, expresada como coeficiente de variacin, es inferior al 8% para el mercurio y del 6% para el arsnico, calculada en este caso para concentraciones superiores a 1000 g/kg.

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Mtodos Analticos

La especiacin de arsnico fue realizada en el Department of Environmental Sciences, University of Plymouth, Reino Unido. El mtodo utilizado11 consiste en la digestin de la muestra con tripsina, seguida de la dilucin y sedimentacin de la mezcla digerida para separar en el sobrenadante las distintas formas de arsnico. Esta separacin se realiza por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en columna de intercambio aninico, utilizando como detector un sistema de plasma de acoplamiento inductivo asociado a espectrometra de masas (ICP-MS). La cuantificacin de las formas reducibles de arsnico se realiza por HAAS con un mtodo de adiciones, previa digestin con cido ntrico y perxido de hidrgeno. El cadmio y el plomo se analizan por espectrofotometra de absorcin atmica con ionizacin en horno de grafito. La materia orgnica se destruye previamente en un horno de mufla con un gradiente de temperatura. El lmite de cuantificacin del mtodo de anlisis de cadmio oscila entre 0.5 y 3 g/kg segn los grupos de alimentos de la dieta. Para el plomo este lmite se sita entre 3 y 5 g/kg. Una descripcin ms detallada de los mtodos ha sido previamente
10 publicada .

Plaguicidas
La determinacin de los plaguicidas organoclorados se lleva a cabo por cromatografa de gases con detector de captura electrnica. La extraccin y purificacin previas se realizan mediante diferentes procedimientos segn el tipo de muestra. En los grupos de huevos, leche y derivados lcteos la extraccin se realiza por el mtodo de Stijve and Cardinale12 con algunas modificaciones. En los grupos de carne, derivados crnicos y pescado la extraccin se lleva a cabo de acuerdo al mtodo de la AOAC edicin 1984 sec. 29.01213 y en el resto (excepto aceites
14 y grasas) por el procedimiento referido en la sec. 29.011 . Las muestras del grupo de aceites y

grasas se someten directamente a la purificacin. Los extractos de todos los grupos excepto los de bebidas alcohlicas se purifican por cromatografa de gel de permeacin (GPC). Los lmites de cuantificacin se sitan entre 1 y 5 g/kg excepto para el grupo de aceites y grasas que es 10 g/kg. Los porcentajes de recuperacin obtenidos varan segn las diferentes combinaciones plaguicida/grupo de alimentos pero siempre se mantienen en el intervalo 80-120%. Los coeficientes de variacin, calculados sobre adiciones a nivel del lmite de cuantificacin, oscilan entre 4 y 19%. Todos los residuos superiores al lmite de determinacin se confirman por espectrometra de masas. La extraccin para el anlisis de los plaguicidas organofosforados se realiza de acuerdo al
15 mtodo AOAC 985.22, edicin 1990 . El extracto se purifica por GPC segn el mtodo S19

descrito en DFG Manual of Pesticide Residue Analysis16, adaptado a los plaguicidas que se determinan. La cuantificacin en los extractos purificados se lleva a cabo por cromatografa de gases capilar con detector fotomtrico de llama. El lmite de cuantificacin es de 10 g/kg. Las

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recuperaciones estimadas sobre muestras enriquecidas al nivel del lmite de determinacin oscilan entre el 80 y el 120% segn la sustancia analizada, con coeficientes de variacin inferiores al 12%. Al igual que en el caso de plaguicidas organoclorados todos los residuos superiores al lmite de determinacin se confirman por cromatografa de gases espectrometra de masas (GC-MS).

El anlisis de ditiocarbamatos se realiza a travs de la cuantificacin por espacio de cabeza y cromatografa de gases con detector de captura de electrones del sulfuro de carbono generado
17 con la hidrlisis de los compuestos . El lmite de determinacin se estableci en 0.1 mg/kg de

CS2. La recuperacin del mtodo, obtenida sobre muestras enriquecidas, se sita entre el 70 y el 100% segn la sustancia. La imprecisin, expresada como coeficiente de variacin oscila entre el 6 y el 17%.

Los N-metil carbamatos se analizan segn el mtodo descrito por de Kok et al.18, con algunas modificaciones. El lmite de cuantificacin se estableci en 6 g/kg. La recuperacin, calculada sobre muestras enriquecidas, es superior al 78% para todos los compuestos. Los coeficientes de variacin oscilan entre el 2 y el 18%. Todos los residuos detectados por encima del lmite de cuantificacin se confirman por GC-MS, con inyeccin directa en el caso de algunos compuestos o tras derivatizacin con anhdrico heptafluorobutrico en el de otros19.

Dibenzodioxinas y dibenzofuranos
policlorados (PCDDs y PCDFs) y Bifenilos policlorados (PCBs)
Las Dioxinas y los PCBs se analizaron en el Central Science Laboratory (CSL) del Ministry of Agriculture, Fisheries and Food del Reino Unido. El mtodo utilizado (Krokos et al.20) consiste en una extraccin y fraccionamiento integrados, mediante una columna de carbn activo acoplada a otra de slice modificada. Las distintas fracciones se purificaron en columna de slice y tras la adicin de los estndares internos conteniendo 13C12, se analizaron por cromatografa de gases espectrometra de masas de baja resolucin (GC-LRMS). En la determinacin de los PCBs ortosustituidos y debido a la presencia de interferencias qumicas en el extracto, se llev a cabo tambin el anlisis por espectrometra de masas de alta resolucin. Los lmites de determinacin de la tcnica son 0.01 ng/kg para PCDDs y PCDFs (excepto para el grupo de grasas y aceites), 0.1 ng/kg para los PCBs no orto sustituidos y 10 ng/kg para el resto de los PCBs analizados. Todos los datos se evalan en relacin con el cumplimiento de los criterios de aceptacin de datos analticos publicados para PCDDs y PCDFs21, y de acuerdo a criterios anlogos para PCBs.

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Mtodos Analticos

Micotoxinas: Aflatoxinas
El anlisis de Aflatoxina M1 en leche y derivados lcteos y de Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 en frutos secos se realiza por cromatografa lquida de alta resolucin con detector de fluorescencia tras la purificacin de las muestras con una columna de inmunoafinidad. La aflatoxina M1 se extrae de la leche de acuerdo al procedimiento descrito por Mortimer et al. 22. En el grupo de derivados lcteos se utiliza para la extraccin el procedimiento de Sharman
23 et al. . Los lmites de cuantificacin son 0.010 g/kg en leche y 0.025 g/kg en derivados

lcteos. El mtodo ha sido validado utilizando los materiales de referencia certificados por el BCR CRM-282, 283, 284 and 285. Los resultados de los ejercicios de validacin han sido previamente publicados24. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se extraen de los frutos secos con una mezcla de metanol:agua, excepto en los pistachos, donde se utiliza una mezcla de cloroformo y agua, y posteriormente se realiza una particin en hexano:tampn fosfato . Los lmites de deteccin son de 1 g/kg para aflatoxina B1, 2 g/kg para aflatoxina G1 y 0.1 g/kg para las aflatoxinas B2 y G2. El mtodo fue validado en cacahuetes pelados utilizando los materiales de referencia certificados por el BCR nmeros 385 y 401. En el resto de alimentos (pistachos, maiz, higos secos...) la validacin se realiz con muestras enriquecidas. Las recuperaciones obtenidas se sitan entre 63 y 78% para aflatoxina B 1, entre 85 y 101% para aflatoxina G1 y entre 52 y 71% para las aflatoxinas B2 y G2, segn la matriz analizada. Los coeficientes de variacin del mtodo oscilan entre un 8 y un 15%, en funcin de la matriz y de los niveles de cuantificacin.
25

Radionucleidos
La determinacin de la actividad especfica de los radionucleidos 89Sr y 90Sr se llev a cabo en el Laboratorio Ambiental-Nuclenor, situado en Medina de Pomar, Burgos. El mtodo utilizado determina cuantitativamente cada uno de los istopos radiactivos mediante una separacin radioqumica y contaje de sus emisiones con un contador de anticoincidencias, de bajo fondo. El lmite inferior de deteccin es 0.12 Bq/kg. El anlisis isotpico de emisores g se realiz en el Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y Tecnolgicas (CIEMAT) de Madrid. La identificacin y cuantificacin de los istopos 134Cs, 137Cs y 40K se llev a cabo por espectrometra g. El lmite de deteccin de la tcnica oscila entre 0.01 y 0.15 Bq/kg.

150

Nitrato y nitrito
Los iones nitrato y nitrito se analizan por HPLC con columna de intercambio aninico y deteccin ultravioleta, previa extraccin en caliente, desproteinizacin y purificacin del extracto con fase slida C18, de acuerdo al mtodo descrito por Dennis et al.26. El lmite de cuantificacin es de 5 mg/kg. La recuperacin, calculada sobre muestras enriquecidas, se sita entre el 98 y el 106%. La imprecisin, expresada como coeficiente de variacin, es inferior al 5%.

Aditivos
La determinacin de sulfito se realiza por el mtodo de Monier-Williams27, con un lmite de cuantificacin de 10 mg/kg. La exactitud, expresada como porcentaje de recuperacin calculada sobre muestras enriquecidas, es superior al 88% con un coeficiente de variacin inferior al 6%.
28 El cido brico se determina mediante el mtodo de la quinalizarina en aquellas muestras con

resultado positivo al test del papel de crcuma. El lmite de cuantificacin es de 20 mg/Kg.

Nutrientes
El hierro y el zinc se determinan por espectrofotometra de absorcin atmica con ionizacin por llama tras la obtencin de cenizas en un horno de mufla. Los lmites de cuantificacin del mtodo son 0.5 mg/kg para hierro y 0.2 mg/kg para zinc. Para validar el mtodo se utilizaron los materiales de referencia certificados por el BCR, CRM-184,185,189,191 y el certificado por el National Institute of Standards and Technology (NIST), SRM-1568 (Standard Reference Material). En el caso del hierro se utilizaron tambin los CRM-150 y 151. La exactitud, expresada como porcentaje de recuperacin, se sita entre el 97 y el 106% para el hierro, y entre el 100 y el 106% para el zinc segn los grupos de la dieta. La imprecisin, expresada como coeficientes de variacin oscil entre el 2 y el 11% en el anlisis de hierro y entre entre el 1 y el 11% en el caso del zinc. La tcnica analtica para la determinacin de selenio comienza con la digestin de la muestra por va hmeda con una mezcla de cidos ntrico, sulfrico y perclrico, seguida de la reduccin
29 con cido clorhdrico y cuantificacin por HAAS . Los lmites de cuantificacin oscilan entre 0.3

y 2 g/kg segn los grupos de alimentos de la dieta. El mtodo fue validado utilizando los materiales de referencia certificados por el BCR-CRM-183,185,186,189,281,287 y los SRM

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Mtodos Analticos

1577 y 1568 certificados por NIST. Las recuperaciones obtenidas oscilaron entre el 95 y el 115% segn la matriz, con coeficientes de variacin inferiores al 10%.

Residuos de medicamentos de uso

veterinario
Para la determinacin de tiouracilos y mercaptoimidazol en tiroides se utiliza la tcnica descrita por Verbeke y Brabender30, que consiste en una extraccin con metanol, seguida de purificacin con una columna selectiva mercuriada. La deteccin se realiza por cromatografa en capa fina de alta resolucin (HPTLC) previa derivatizacin con NBD-Cl (7-cloro-4-nitrobenzofurano). El lmite de deteccin es de 100 g/kg para cada una de las sustancias analizadas. Los estilbenos dietilestilbestrol (DES) y dienestrol (DE), la trenbolona, la nortestosterona y el zeranol se analizan en orina con la tcnica recomendada por el CNA . La tcnica consiste en la hidrlisis enzimtica con glucuronidasa, la extraccin mediante fase slida C18 y la purificacin con fraccionamiento por HPLC. Finalmente los anabolizantes se detectan por HPTLC bidimensional. Los lmites de deteccin son 5 g/L para DES, 10 g/L para DE, 0.5 g/L para trenbolona y 5 g/L para zeranol y nortestosterona, partiendo de 10 ml de orina. A partir de 1993 la identificacin y cuantificacin de los estilbenos (DE, DES y hexestrol-HEX) se lleva a cabo por cromatografa de gases espectrometra de masas, previa hidrlisis de la orina y
R extraccin en fase slida (columnas Bond Elut Certify ). El lmite de deteccin es 2 g/L para 31

todos los estilbenos. Una descripcin detallada del mtodo ha sido previamente publicada32. Las hormonas naturales se determinan en suero mediante radioinmunoanlisis competitivo con marcador
125

I. Los lmites de deteccin son de 0.2 g/L para la testosterona, 0.1 g/L para la

progesterona y 0.02 g/L para el 17-estradiol. Para la determinacin de agentes inhibidores se utiliza la tcnica microbiolgica de cribado de las cuatro placas
33,34

. Esta tcnica se basa en la determinacin del halo de inhibicin de un

cultivo bacteriano debido a la difusin de los antibiticos presentes en una muestra de tejido animal que se pone en contacto con el agar de la placa. El cloranfenicol en msculo se analiza por HPLC con detector visible-UV, previa extraccin con acetato de etilo y purificacin en fase slida-slice, siguiendo el mtodo recomendado por el CNA35. El lmite de deteccin es de 10 g/kg, partiendo de 10 g de muestra. La recuperacin estimada sobre muestras enriquecidas al nivel del lmite de cuantificacin (20 g/kg) es superior al 73%, con un coeficiente de variacin inferior al 10%. Durante 1992 y 1993 la determinacin de sulfamidas en tejidos animales se realiz por HPLC
36 con detector de diodos, siguiendo el mtodo de extraccin recomendado por el CNA . En 1994

152

se desarroll un nuevo mtodo de extraccin por dispersin de matriz en fase slida (MSPD)

37

que permite la determinacin simultnea de sulfamidas (14 sustancias) y cloranfenicol, con un lmite de determinacin de 50 g/kg. Una descripcin detallada del mtodo ha sido previamente publicada38.
39 El clenbuterol se analiza en orina por HPTLC, siguiendo el mtodo recomendado por el CNA .

La cuantificacin se lleva a cabo por densitometra. El lmite de deteccin es de 1 g/L, partiendo de 10 ml de orina. Cuando el nmero de muestras es grande, se realiza una criba previa mediante enzimoinmunoanlisis. Para el anlisis de clenbuterol en hgado se realiza una extraccin con tampn acetato pH 4.8. Posteriormente se alcaliniza el extracto y se purifica mediante fase slida C18. La determinacin se lleva a cabo por HPTLC como en el caso del anlisis en orina. El lmite de deteccin es 1 g/kg cuando se parte de 5 g de muestra. La determinacin de clenbuterol en retina se realiza en los mataderos con un mtodo de criba mediante enzimoinmunoanlisis de lectura visual. Las muestras positivas se analizan en el laboratorio por HPTLC, siguiendo el mtodo de anlisis de clenbuterol en hgado, simplificando algunos de los pasos de la purificacin. El clenproperol se analiza en orina con la misma tcnica que el clenbuterol. El lmite de deteccin es de 1g/L. La tcnica multiresiduo para el anlisis de -agonistas en orina (mabuterol, cimaterol, salbutamol, terbutalina, clenproperol y clenbuterol) se realiza por GCMS. Previamente la muestra de orina se somete a una hidrlisis enzimtica, se purifica en columna (Bond Elut Certify ) y se derivatiza para transformar los -agonistas en trimetilsililderivados. El desarrollo del mtodo se verifica con la adicin de estndares internos deuterados. Los lmites de deteccin son de 2 g/L para mabuterol, salbutamol, terbutalina y clenbuterol, 1.5 g/L para clenproperol y 4 g/L para el cimaterol.
R

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Mtodos Analticos

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