Instituto tecnolgico de Oaxaca

Departamento de ingeniera qumica y bioqumica

Anlisis instrumental UNIDAD 3 Tema

Cromatografa de lquidos de alta resolucin

Integrantes del equipo:

Flores Santiago Andrea Alejandra Garca Vsquez Abigail Javier Ros Myela Soledad Matadamas Mndez Fany Violeta
Facilitador:

Dra. Minerva Donaj Mndez Lpez

Grupo:QA
Oaxaca de Jurez Oaxaca, 04 de mayo del 2013

Cromatografa de lquidos de alta eficacia

Los cuatro tipos bsicos de cromatografa en lo que la fase mvil es un lquido: o Cromatografa de reparto

o o o

Cromatografa de adsorcin o liquido-solido. Cromatografa inica. Cromatografa de exclusin por tamao, o cromatografa de geles.

La Cromatografa lquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) o Es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica.

El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.

Su historia En una primera etapa la cromatografa de lquidos se realizaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realiz Tswett sus trabajos originales. Con un dimetro de las partculas de la fase estacionaria solida de 150 a 200 m. los caudales eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de mililitro por minuto. los tiempos de separacin eran largos. Aplicacin de vaco, o por bombeo no resultaron efectivos. Menor eficacia

Campo de aplicacin de la HPLC HPLC es una tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizadas: Su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas. su idoneidad para la separacin de especies no voltiles. Su gran aplicabilidad a sustancias que son primordial inters en la industria.

Ejemplos de estos materiales: Aminocidos Protenas cidos nucleicos Hidrocarburos Carbohidratos Frmacos Antibiticos Esteroides Especies organometalicas Y una gran variedad de sustancias inorgnicas.

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Los distintos procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicacin se refiere. Clasificacin general Mtodo especifico Liquido-liquido, o reparto Liquido-fase unida qumicamente Cromatografa de lquidos (LC)(fase mvil: liquida) Fase estacionaria Liquido absorbido sobre un solido Especies orgnicas enlazadas a una superficie solida solido Tipo de equilibrio Distribucin entre lquidos inmiscibles Distribucin entre el lquido y la superficie enlazada adsorcin

Liquido-solido, o adsorcin Intercambio inico

Resina de cambio inico Liquido en los intersticios de un slido polimrico

Intercambio inico

Exclusin por tamao

Distribucin exclusin

Eficacia de la columna en la cromatografa de lquidos Ensanchamiento de banda El ensanchamiento de banda se produce como consecuencia de la velocidad finita con la que ocurren los distintos procesos de transferencia de masa durante la migracin de una especie a lo largo de la columna Eficacia de la columna en la cromatografa de lquidos Ensanchamiento de banda

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El ensanchamiento de banda se produce como consecuencia de la velocidad finita con la que ocurren los distintos procesos de transferencia de masa durante la migracin de una especie a lo largo de la columna Efectos del tamao de partcula. La eficacia de una columna HPLC debera mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamao de la partcula. Por ejemplo: Una reduccin del tamao de la partcula de 45 a 6m origina una distribucin de 10 o ms veces de la altura de plato. Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografa de lquidos El ensanchamiento proviene de las diferencias en las velocidades de flujo de las capas del lquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Por lo tanto la banda del soluto se mueve con ms rapidez perifrica. Cuando se utiliza columnas de pequeo dimetro, el ensanchamiento extra-columna puede hacer bastante importante.

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Funcionamiento de un cromatografo

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Instrumentacin para cromatografa de lquidos

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kg-fuerza por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo para HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa.

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Recipientes para la fase mvil y sistemas de tratamiento de los disolventes Un aparato moderno de HPLC est equipado con uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene de 200 a 1000 mL de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos que interfieren formando burbujas en la columna y en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos o tres disolventes con una polaridad significativamente distinta. Sistemas de bombeo

Bombas recprocas

Consisten, en una pequea cmara en la que el disolvente es desplazado por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Ventajas Pequeo volumen interno (35 a 400 L) Fcil adaptacin a la elucin con gradiente Caudales constantes (independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente) Desventajas Produce flujo pulsado (su presencia se manifiesta como un ruido en la base del cromatograma)

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Bombas de desplazamiento Consisten en unas grandes cmaras como una jeringa, equipadas con un mbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Ventajas Flujo constante Flujo libre de pulsaciones Desventajas Capacidad de disolvente limitada (250 mL)

Bombas neumticas La fase mvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en una vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Ventajas Son baratas Flujo libre de pulsaciones Desventajas Limitada a capacidad y presin de salida Caudal que depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin de la columna Limitadas presiones (menores de 2000 psi)

Sistemas de inyeccin de muestra En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra. Hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 7.000 psi.

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Columnas para cromatografa de lquidos

Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Columnas analticas La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen:

o o o o o o o

una longitud entre 5 y 30 cm. las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m. la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro.

Precolumnas Para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. En cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin. Termostatos En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. Para poder controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante.

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Tipos de rellenos de la columna En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos: Pelicular y de partcula porosa.

Pelicular
Consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analticas.

Partcula porosa.
Formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrn en unas condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy uniformes. Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie

Detectores A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. Un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda. Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos.

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detectores basados en una propiedad de la disolucin Responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste,

detectores basados en una propiedad del soluto Responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.

Detectores de absorbancia

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos contrastados. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de esas longitudes de onda. Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores. La mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan a la radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. o Por ejemplo, se puede obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen estn suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de onda en cada caso.
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Cuando se desean los espectros completos con fines de identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa. Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes son los instrumentos de series de diodos.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. o El primero con barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares. o El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier. Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiacin ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden trabajar a una o ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera anloga a los instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta. Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones. Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los fluormetros espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente. Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separacin determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.

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Detectores de ndice de refraccin Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente que en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma. Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en cromatografa de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con gradiente. Detector de dispersin de luz Detector de dispersin de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de conduccin a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil, lo que origina unas finas partculas de analito. La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin. Detectores electroqumicos Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra y la conductimetra.

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Columnas para cromatografa con fases unidas qumicamente En cromatografa de reparto, los soportes para casi todos los rellenos con fases unidas qumicamente se preparan con slice rgida o composiciones constituidas bsicamente por slice. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y uniformes, con dimetros de 3, 5 o 10 m. La superficie de la slice totalmente hidrolizada est constituida por grupos SiOH qumicamente reactivos. Las superficies de slice caractersticas contienen cerca de 8 mol/m2 de grupos SiOH. Los recubrimientos de fase enlazada ms utilizados son los siloxanos, que se forman por reaccin de la superficie hidrolizada con un organoclorosilano. Rellenos de fase inversa y de fase normal. Se distinguen dos tipos de cromatografa de reparto: cromatografa en fase normal. cromatografa en fase inversa. En cromatografa en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el ms soluble en la fase mvil y un aumento de la polaridad de la fase mvil provoca una disminucin del tiempo de elucin. Por contraste, en los mtodos en fase inversa, los componentes ms polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin. Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido qumicamente tiene un carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Tal vez las tres cuartas partes de toda la cromatografa de lquidos de alta resolucin se llevan a cabo normalmente con rellenos de fase inversa. Por lo general, el grupo R del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C 18 (n-octadecilo). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partcula, dando una estructura semejante a una brocha o a un cepillo. La Figura 4.7 ilustra el efecto de la longitud de la cadena del grupo alquilo sobre la eficiencia. Como se esperaba, las cadenas ms largas originan rellenos que muestran una mayor retencin. Adems, una mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad de muestra.

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Aplicaciones de la cromatografa de reparto

Como aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de alimentacin : Aditivos en bebidas refrescantes Colorantes
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Aminocidos Protenas Carbohidratos lpidos.

Formacin de derivados En algunos casos, es conveniente transformar los componentes de una muestra en unos derivados antes, o a veces despus, de proceder a la separacin cromatografa. Este tratamiento puede ser necesario para: Reducir la polaridad de las especies y de este modo poder utilizar columnas de reparto y no de adsorcin o de intercambio inico.

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Aumentar la respuesta del detector y, por tanto, la sensibilidad para todos los componentes de la muestra. Aumentar la selectividad de la respuesta del detector para determinados componentes de la muestra.

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