Ejercicios de laboratorio El anlisis de una mutacin de p53 asociado con la susceptibilidad del cncer para los cursos de Laboratorio

de Bioqumica y Gentica *
Recibido para su publicacin el 18 de diciembre de 2008, y en forma revisada, 22 de abril 2009 Isabel Soto-Cruz y Martha Legorreta Herrera Desde el Laboratorio de Oncologa Molecular , Estudios de Postgrado y la Divisin de Investigacin, FES Zaragoza, Universidad Nacional Auto 'noma de Me' xico, Mxico Laboratorio de Inmunologa Molecular, Divisin de Estudios de Posgrado e Investigacin, FES Zaragoza, Universidad Nacional Auto 'noma de Me' xico , Mxico

Hemos ideado e implementado un mdulo para un laboratorio de divisin superior de grado basado en la amplificacin y el anlisis de un polimorfismo de p53 asociado con la susceptibilidad al cncer. En primer lugar, los estudiantes recogi una gota de sangre perifrica de clulas usando una picadura estril y luego se usa tarjetas FTA para extraer el ADN genmico. La regin p53 continuacin, se amplific por PCR, y los productos de la PCR se digiri con la enzima BstUI para detectar el polimorfismo del codn 72.Electroforesis en gel de poliacrilamida se utiliza para resolver la Productos de PCR, y los resultados se analizaron estadsticamente en el contexto de la gentica de poblaciones humanas.Las muestras de sangre en las tarjetas FTA tambin se recogieron de 50 mujeres para detectar la mutacin en un amplio rango de edades y evaluar su relacin con la susceptibilidad familiar r tancia.Este mdulo permite a los estudiantes a utilizar materiales y mtodos que se utilizan habitualmente por los investigadores cientficos para analizar polimorfismos. Por lo tanto, se puede utilizar para ejercicios de laboratorio en los programas de la bioqumica tradicional, as como en el creciente campo de la ciencia genmica y la educacin. Palabras clave: p53, mutacin, cncer, polimorfismo, ADN genmico, tarjetas FTA, PCR, la susceptibilidad.

El gen p53 es un conocido gen supresor de tumores que codifica una protena nuclear que en la detencin del crecimiento duces o apoptosis en respuesta al estrs celular [1].Cuando la ruta de p53 se inhibe, se acelera la progresin del cncer y la resistencia a la quimioterapia se desarrolla [2]. De hecho, p53 funcin est comprometida en la mayora de los cnceres humanos [3 -5].

Hay cada vez ms pruebas de que las variantes allicas en algunos oncogenes y genes supresores de tumores son candidatos para los factores de riesgo genticos que pueden alterar el resultado clnico de cncer.
La participacin de las alteraciones de p53, incluidas las mutaciones somticas y polimorfismos de lnea germinal, en el tumor de desarrollo ha sido bien documentado.Un polimorfismo en el codn 72 (Arg / Pro alelo) de p53 est ampliamente distribuido en var-ious poblaciones humanas [6, 7]. Uno de los sorprendentes e s Featur de este polimorfismo es la degradacin eficiente del producto del gen Arg-tipo de p53 por el humano papillomavi-rus (HPV) E6 oncognica; portadores del producto del gen Arg-tipo son aproximadamente siete veces ms susceptibles a cervical cncer [8].El alto riesgo d e cncer cervical asociado con el producto del gen Arg-tipo de p53 ha sido apoyada por varios estudios epidemiolgicos sobre

los individuos Europea [7, 9].Sin embargo, los estudios sobre el British [10], el japons [11] y Corea [12] poblaciones no han verificado esta r i sk.El

Este trabajo es apoyado por la UNAM (PAPIME PE204105). A quin debe dirigirse la correspondencia.E-mail: marthal@servidor.unam.mx.

distribucin del codn 72 genotipo polimrfico vara segn el origen tnico [6], y es t en lugar de generar dificul-Alize conclusiones obtenidas de una poblacin dada.No obs-tante, consideramos que es muy importante que nuestros estudiantes aprendan una tcnica fcil de detectar este polimorfismo ya que el cncer cervical es el cncer principal en la poblacin mexicana. Nuestro objetivo era aprender a ensear a los estudiantes los principios bioqumicos que estn en la raz de la deteccin de polimorfismos de ADN y para proporcionar una mayor apreciacin y comprensin de sus beneficios y extensas ciones aplicaciones en hoy 's diagnstico clnico.Un segundo objetivo de aprendizaje o Ndary era ensear a los estudiantes la importancia de las tcnicas de laboratorio apropiadas y cuidado que son esenciales para la aplicacin exitosa de este mtodo y para el correcto anlisis estadstico de los datos generados.Creemos que los materiales actan UAL y protocolos utilizados por las investigaciones de laboratorio oratorios podra aplicarse en estudios de licenciatura curso de laboratorio en beneficio de nuestros estudiantes. Nuestro enfoque se basa en la desarrollada previamente los protocolos seguidos en nuestros laboratorios de investigacin, muchos de estos protocolos se puede completar con reactivos preparados por nosotros en el laboratorio. Con los mtodos aqu presentados, el polimorfismo del codn 72 de p53 se amplific, se digiri, y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y estndar tico-Dium protocolos de tincin de bromuro.
Nuestros estudiantes utilizaron los mismos mtodos y procedimientos utilizados por los laboratorios de investigacin de todo el mundo para detectar un polimorfismo asociado con la susceptibilidad al cncer.

Traduccin 10.1002/bmb.20304

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Este ejercicio de laboratorio ensea a los estudiantes cmo utilizar los mtodos estriles para recoger la sangre humana LLS Ce, extraer el ADN genmico de las clulas de una manera sencilla, amplificar el locus que contiene el polimorfismo del codn 72 del gen p53 supresor de tu-mor, y realizar de agarosa y poliacrilamida electroforesis en gel y tincin con bromuro de etidio del gel.Estudiante s recibieron instrucciones de cmo analizar stat-istically los resultados en el contexto de humanos ulacin emergente gentica y cmo se relacionan con la susceptibilidad de desarrollar cncer. Se espera que los estudiantes trabajan en equipos para analizar los resultados y elaborar un informe final que deber incluir el anlisis de datos y la discusin.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Materiales introductorios
El laboratorio requiere un mnimo de tres periodos completos de laboratorio para completar, y comprende una conferencia antes del perodo de laboratorio en primer lugar, una conferencia entre las actividades de laboratorio y otro al final para la discusin de los resultados y las cuestiones ticas. Causa B e de la complejidad de los pasos, el

laboratorio debe ser lo suficientemente grande para acomodar el nmero de estudiantes que utilizan el equipo.Las conferencias cubren la teora bsica de los temas si-guientes: p53 codon 72 polimorfismo y su relacin con el desarro llo de cncer, utilizando electroforesis en gel de acrilamida, PCR, fragmentos de restriccin polimrficos (RFLP), el aislamiento de ADN genmico utilizando Whatman tarjetas FTA y sus propiedades qumicas que permiten la recogida de muestras y anlisis sis-, as como la prevencin de la contaminacin de la muestra durante colleccin. Para completar con xito este protocolo, los estudiantes deben ser capaces de pipetear con precisin volmenes especficos, tener conocimiento de los antecedentes obrantes en el gen p53, y entender los procesos de PCR, digestin con endonucleasas de restringir ion, y la electroforesis en gel de acrilamida.Una comprensin adecuada de los conceptos anteriormente mencionados es necesario, por lo tanto, se sugiere que estos mdulos se reservar para cursos superiores genticos o bioqumica. Adems, de laboratorio nts ASSISTA son especialmente alentados a proporcionar la orientacin adecuada cuando se trabaja con bromuro de acril-amida y de etidio, con el fin de asegurar una manipulacin cuidadosa y la disposicin adecuada de este material.

.
Los siguientes materiales son necesarios para analizar la mutacin p53: batas de laboratorio, guantes, Pipetman (p2 nmeros de modelo, P20, P200, y P1000), estriles y UV-irradiados puntas de pipeta estriles, picaduras, termociclador con tubos de PCR, que acompaan a una electroforesis en gel unidad de alimentacin, aparato que consiste en gel de poliacrilamida de placas de vidrio (20 cm 3 20 cm 3 0,5 mm), abrazaderas, cintas, y espaciadores, Whatman FTA tarjetas, Taq polimerasa (Applied Biosystems, EE.UU.), dNTPs (Invitrogen, EE.UU.), los cebadores: 0 0 0 0 (20 lM p53 oligo 5 3 CCCGGACGATATTGAACA adelante; 5 3 AGAAGCCCAGACGGAAAC inversa [13], 25 mM de MgCl 2 (Sigma), acrilamida y bisacrilamida (Sigma).

mtod
Notas para los Estudiantes-precauciones de seguridad deben seguirse estrictamente para la seguridad de los estudiantes y los instructores.Cuando se trabaja con las clulas, o bien lneas celulares o clulas sanguneas, es ess preferencial a trabajar en condiciones estriles.Adicional apropiada precauciones de ejemplo tambin se deben seguir para evitar externo-y la contaminacin cruzada despus se extrae el ADN. Para el manejo de la sangre, los estudiantes deben usar guantes de ltex durante todos los procedimientos. Diantes Stu deben usar lentes de proteccin y guantes de ltex para

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evitar daos a la piel con productos qumicos potencialmente txicos y reactivos. Los estudiantes deben usar proteccin para los ojos para bloquear completamente la radiacin UV en la visualizacin de etidio manchadas geles de acrilamida (un UV-rated toda la cara cubierta de plstico que es fuertemente recomendado). Peligros potenciales-acrilamida y bisacrilamida en polvo y lquido son neurotoxinas y deben ser manejados en consecuencia.Una mascarilla facial hermtico deben utilizar para la b e pesando acrilamida.El bromuro de etidio es un agente carcingeno sospechoso y debe ser manejado con cuidado con el uso de guantes.

Lneas celulares y muestras de sangre

Lneas de clulas (T47D, MDA231, 293T) fueron una especie de regalo del doctor Alejandro Zentella del Instituto de Investigaciones Bioma d-icas, UNAM. La lnea celular se obtuvo de INBL cervical mues-tras y estableci como se describe [14].ADN de la lnea celular MDA231 tumor se utiliz como control positivo. Estas clulas se muestra por digestin enzimtica y q se uencing para albergar la mutacin.Como control negativo, una reaccin de PCR se llev a cabo sin molde de ADN. Las clulas sanguneas se obtuvieron por pegar la punta del dedo con la picadura de una estril. Dos gotas se recogieron directamente en las tarjetas FTA y se dej secar a tem-peratura ambiente. Las muestras de sangre se obtuvieron tambin de 49 estudiantes sanos y profesoras en la escuela. Se les inform sobre los procedimientos de uso y experimental de este estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo. Este estudio fue Aprobacin ed por el Comit de tica y Acadmico de la FES Zaragoza, UNAM.

Para garantizar la seguridad y privacidad de los sujetos, se estableci el siguiente protocolo: los resultados nunca son publicados conjunta-mente con las iniciales, nombres o nmeros de estudio. Un cdigo de barras nmero, para w hich estudiantes no tienen acceso, se utiliza para identificar cada muestra. Las muestras de sangre se manejan por el instructor que corta los discos y los transfiere a tubos Eppendorf marcados con un nmero de cdigo de barras. Las muestras de sangre marcadas se redistribuye a los padres del poste, que no saben de quien origin la muestra.Los datos confidenciales obtenidos en este estudio se mantienen en un archivo cifrado de ordenador electrnico.

Cultivo de clulas y Recuento celular

Las lneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% fetal suero bovino (SFB) (Gibco, 5 BRL). Las clulas se subcultivaron semanalmente en 0,5 a 1,0 3 10 clulas / ml en FBS al 10% y se mantuvo a 37 8C en un ambiente humidificado con 5%

CO2

Las clulas se suspendieron en medio y una pequea alcuota se evalu en una cmara de Neubauer bajo un microscopio de luz (Carl Zeiss, Alemania) para determinar el nmero de clulas y la densidad.

Extraccin de ADN utilizando Whatman FTA Cards

Un total de 3 3 10 clulas se colocaron en las tarjetas FTA y se dej secar a temperatura ambiente.Diez discos de 1,2 mm se cortaron de las tarjetas FTA y se lav en 400 LL de reactivo TLC (Whatman, EE.UU.) mientras se agitaba a 300 rpm durante 5 min. Este procedimiento se repiti dos veces con agua estril e destilada.Los discos se dejaron secar a temperatura ambiente. Una vez seco, un disco se utiliz para la amplificacin por PCR.
6

P
El polimorfismo gentico p53 se evalu mediante PCR. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: 5 CCCGGACGATATTG AACA3 adelante; 5
0 0 0

AGAAGCCCAGACGGAAAC inversa [13].

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Un disco de TLC con la plantilla de ADN de cada lnea celular se amplific por PCR en un volumen final de 20 l, que contiene 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 0,2 mM dNTPs, 0,2 lM d e cada cebador y la polimerasa Taq 0.5U (Applied Biosys-mas).Despus de una desnaturalizacin inicial a 94 8C durante 5 min, 29 ciclos de desnaturalizacin (94 8C durante 1 min), hibridacin (55 8C durante 1 min), y extensin (72 8C durante 2 min) se llevaron a cabo en un E Master-ciclador p pendorf sistema de PCR.La extensin final fue por-formado en 72 8C durante 7 min. Los productos de PCR se visualizaron por ac-rylamide electroforesis en gel (4%) en tampn TBE 13. El gel se ti con bromuro de etidio (1 mg/200 ml TBE tampn 13) y las imgenes de los geles se OBT un INED usando un analizador UV-imagen (Bio-Rad GelDoc 1000, EE.UU.).Los productos de PCR se analizaron en una seccin del laboratorio separado de donde el trabajo se realiza la PCR.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Las placas de vidrio se reunieron de acuerdo con las instrucciones del fabri-cante 's.Brevemente, un sello impermeable se forma entre las placas (16 3 20 cm) y los separadores (0,5 - 0,75 mm) para evitar que la solucin de gel no polimerizado de fugas.El volumen requerido de solucin ac ilamida r se calcula teniendo en cuenta las dimensiones de las placas de vidrio y el espesor de los separadores.Los siguientes volmenes son para 100 ml de un 4% acril-amida solucin. En un matraz Erlenmeyer, 13,3 ml de acrilamida / bisacrilamida (30%), 76 ml de agua illed dist, 0,7 ml de persulfato de amonio al 10%, y 35 LL de TEMED (N, N, N N ) (Sigma, St. Louis, MO) se aadieron.A continuacin, la solucin se mezcl por agitacin. La solucin de acrilamida se vierte en el espacio entre las placas de vidrio. Inmediatamente, el peine apropiado se insert, con cuidado de no dejar burbujas de aire se quede atrapado debajo de los dientes. Si es necesario, la solucin de acrilamida restante se utiliza para llenar el molde de gel completamente. Compruebe que no haya solucin de acrilamida es leakin g del molde de gel.La acrilamida se dej polimerizar durante 60 min a temperatura ambiente. El peine se retir
0, 0-tetrame-thylethylenediamine

cuidadosamente y los pocillos se enjuagaron inmediatamente con agua destilada, de otro modo, pequeas cantidades de solucin de acrilamida atrapadas por el wil l peine polimerizar en los pocillos, la produccin de superficies de forma irregular, que pueden distorsionar la resolucin de las bandas de ADN.El gel fue fijado al depsito de electroforesis y los depsitos se llenaron con 13 TBE. Los productos de PCR digeridos fueron mezcladas con una cantidad iate parmetro adecuado de tampn de carga de gel 53.La mezcla se carg en los pocillos utilizando una jeringa Hamilton (generalmente 10 lL se carga en el gel). Los electrodos se conectaron a una fuente de alimentacin y el gel se hizo funcionar a 120 V hasta que los colorantes marcadores migrado el medio longitud del gel.La energa elctrica se apag, los cables se desconectaron, y el tampn de electroforesis de los embalses se descart. Las placas de vidrio se coloca plana sobre la superficie de trabajo y una esquina de la placa de vidrio superior se levant una fina esptula.La placa superior se sac sin problemas de distancia y los separadores fueron retirados.

Tincin con bromuro de etidio

Suavemente sumergir el gel y su placa de vidrio adjunta en tincin con solucin (0,5 lg / ml de bromuro de etidio en agua destilada). Teir durante 5 min a temperatura ambiente t y lavar el gel con 400 ml de agua destilada durante 2 min. El bromuro de etidio es un mutgeno potente y es moderadamente txico. Se deben usar guantes cuando se trabaja con soluciones del tha t contienen este colorante.Para fotografiar el gel, el gel se invierte y se coloca cuidadosamente en el transiluminador UV. La placa de vidrio se elimin y el gel se fotografi usando el sistema de gel Bio-Rad documentacin.

BAMBED, vol. 37, No. 4, pp 236-242, 2009

F 1:La presencia de la p53 codon 72 polimorfismo en lneas celulares diferentes. Los productos de PCR se analizaron en un 4% de gel de acrilamida y se visualizaron por tincin con bromuro de etidio. Los carriles 1 -4 Mostrar los productos PCR de p53 fro m lneas celulares: T47D, MDA231, 293T, y INBL, respectivamente.Carriles 5 a 8 muestran los productos de la PCR despus de digestin con BstUI: T47D, MDA231, 293T, y INBL, respectivamente.Carril 9 es el control negativo y el carril 10 contiene los marcadores moleculares (50-bp de ADN escalera de mano f rom Promega).La digestin de la enzima produce dos fragmentos de 125 y 78 pb. El fragmento sin digerir es de 203 pb.

Restriccin de longitud de fragmentos de PCR Polimorfismo

Anlisis RFLP del codn 72 del gen p53 se realiz para los genotipos determinantes p53 ne.Cinco microlitros de cada pro-ducto de PCR fueron digeridos con 10 U de la enzima de restriccin BstUI (New England Biolabs) a 608C durante 6 horas. Los fragmentos de ADN se resolvieron en un gel de poliacrilamida y se tieron con bromuro de etidio bro-mide como se describe e un rlier.El alelo Arg es escindido por BstUI para producir dos pequeos fragmentos (125 pb y 78). El alelo Pro no es escindido por BstUI y existe como una sola banda de 203-pb. El heterozygote contiene tres bandas (203, 125, y pb 78). La in-instructor debe hacer cl e ar que estos resultados representan slo un polimorfismo de un gen asociado con una enfermedad multifactorial en la que varios genes necesitan ser alterados.Por lo tanto, el resultado no es el diagnstico del cncer, sino que significa slo un aumento de la susceptibilidad a desarrollar la enfermedad.

RESULTADOS

Antes de implementar este experimento de laboratorio en un laboratorio de la divisin superior gentica y bioqumica, queramos asegurar su viabilidad.Por lo tanto, hemos realizado dos ejecuciones de prueba: uno con las lneas celulares de cncer utilizando los primers previamente diseados y otra wi t h muestras de sangre de donantes sanos femeninos.El objetivo de la prueba se ejecuta era asegurar el experimento podra ser completado en el momento oportuno y que todos los aspectos tcnicos asociados no eran demasiado exigentes para un laboratorio universitario. El e intentos wer seguida de una real aplicacin en una divisin superior bioqumica clnica gentica en laboratorio oratoria curso impartido aqu en FES Zaragoza, UNAM. Este experimento demostr ser un mecanismo muy exitoso para lograr nuestros objetivos de aprendizaje. El primer ensayo implicaba la aplicacin del anlisis de ADN y se llev a cabo en el laboratorio de la Dra. Martha Legorreta en FES Zaragoza, UNAM. Whatman tarjetas FTA y reactivos de purificacin se utilizaron para aislar el ADN a partir de diferentes lneas celulares de cncer y detectar el polimorfismo de p53 codon 72 (vase la fig. 1). El segundo ensayo se ejecutan implica la recoleccin de clulas sanguneas perifricas con tarjetas FTA de 49 mujeres de un amplio rango de edades que no se asociaron con el laboratorio. El objetivo principal de la carrera segundo juicio

ABLA

La frecuencia de p53 codon 72 polimorfismos en muestras de sangre Los(as) estudiantes (N = 20) 3 10 7

grupo. Genotipo Pro / Pro Genotipo Pro / Arg Genotipo Arg / Arg

Maestros (N = 29) 2 11 16

Frecuencia (%) 10 44 46

era examinar la viabilidad de la recogida fuera del lugar seguido de un anlisis directo del ADN en el laboratorio a la recepcin de las muestras. Tambin hemos querido determinar la viabilidad de susceptibilidad al cncer explorar mediante el anlisis de una mutacin en p53 como funcin de la edad y el desarrollo de cncer familiar.Las muestras de sangre y el ADN genmico demostr ser tan viables como las recogidas directamente en el laboratorio y dio lugar a productos de PCR viables que podran ser sometidos a tratamiento BstUI para un polimorfismo nlisis.La aparicin de polimorfismos es fcilmente evidente al ver la banda de patrones en el gel (Fig. 1) y en la Tabla I. De las muestras de 49 analizados, el alelo p53-Arg se identific en 68% y la p53-Pro alelo se identific en el 32%, 23 mujeres (46%) fueron Arg / Arg homocigosis, 5 mujeres (10%) eran de Pro / Pro homocigosis, y 22 mujeres (44%) eran de Pro / Arg heterocigotos (Tabla I).

Las frecuencias genotpicas se calcularon utilizando los datos recuperados de las mujeres 49 sanos analizados para el gen p53 (Tabla I).Ajuste de la frecuencia del genotipo Pro / Pro como P, Pro / Arg como H, y Arg / Arg como Q, la frecuencia de cada alelo es: Frecuencia Pro p P 1 = 2H; y FrequencyArg Q q 1 = 2H: Dependiendo de las frecuencias allicas, calculamos las frecuencias genotpicas esperadas para comprobar si la poblacin muestreada fue de Hardy-Weinberg (Tabla II). El principio de Hardy-Weinberg que las frecuencias allicas y genotpicas en una poblacin se mantienen constantes a travs del tiempo ofrecer a la poblacin es grande en 239 tamao y el apareamiento es aleatorio. Apareamiento aleatorio implica que compaeros de seleccionar entre s sin tener en cuenta el genotipo en el locus p53. Otras condiciones son necesarios para el principio de Hardy-Weinberg para aplicar, Ly nombre de la ausencia de otras fuerzas de la evolucin (por ejemplo, la seleccin natural, muta-cin, y la migracin) que afectan a ese locus particular.A poblacin en equilibrio de Hardy-Weinberg no est evolucionando para ese locus particular (que no se refiere a otros loci que co uld ser afectados, por ejemplo, la seleccin). La frecuencia de la p53 mutante Arg alelo se encontr que era 0,6836, mientras que el alelo p53-Pro era 0,3163. Despus de calcular las frecuencias genotpicas esperadas para el locus p53, los resultados mostraron casi un partido perfe ct, a las observadas (Tabla II).Con el fin de investigar si una diferencia 2) estadstica entre las frecuencias observadas y esperadas genotpicas existe, una chi-cuadrado (v prueba se calcula como:

v2

Xk

hacer ETH

i1

donde S y E son la observada y esperada frecuencias, respectivamente, y k es el nmero de clases genotpicas (en este caso, tres).Para el anlisis estadstico, las frecuencias esperadas se debe traducir 2 en un valor que representa el nmero de individuos (clculo de v con proporciones dara un nmero muy pequeo), multiplicando las frecuencias esperadas por el tamao de la muestra total (N). 2 El valor observado de V se compara con el terico obtenido a partir de tablas de probabilidad.Nuestra hipte-sis nula (Ho) afirma que la poblacin est en equilibrio de Hardy-Weinberg para el locus p53 (esto implica que las frecuencias genotpicas esperadas y observadas son iguales).Por el contrario, nuestra hiptesis alternativa (H A) indica que la poblacin no est en equilibrio de HardyWeinberg. Con el fin de rechazar el o H, se calcul un valor de v debe ser mayor que el valor de v obtenido a partir de las tablas estadsticas acompaados por los correspondientes grados de libertad y nivel de probabilidad.Por lo tanto, es necesario
2 2

TABLA II

Frecuencias genotpicas y allicas del locus p53 de 49 mujeres de la Ciudad de Mxico Genotipo Pro / Pro Individuos observados en la muestra Frecuencia genotpica observada P = 0,1020 Frecuencia allica
n
1

Pro / Arg
n
2

Arg / Arg
n
2

Total
3

5
1

21

23

N 49 1

P= N

H N

Q N Q p53 1-Arginina qQ 2 H

H 0,4285
P = 1-p53 Proline pP 2 H

Q 0,4693

0,3163 Frecuencia genotpica esperada Nmero esperado de individuos de cada genotipo v

2

0,6836 2pq 2pq 0,4325 n 2 2pq 3 N 21,1938 0,00177

1 1 49 0.004100

<P2>
p
2

Trimestre2
q
2

0,10006 2

0,4674 2

n 1 p3N 4,9030 0,00191

n 3 q3N 22,9030 0,00041

Valores observados y esperados de cada celda se dan junto con las frmulas para el clculo de los valores. El valor de la 2) Chi-cuadrado (v estadstica se calcul, y se compara con el valor correspondiente de distribucin de probabilidad, que se da a continuacin. 2 v (con un grado de libertad en un 0,05) 3,8414. Por lo tanto, la hiptesis nula (H 0) es aceptada; las frecuencias observadas y esperadas son estadsticamente similares y la poblacin se dice que est en equilibrio de Hardy-Weinberg.

240

BAMBED, vol. 37, No. 4, pp 236242, 2009

T ABLA III Presencia del polimorfismo relacionado con la edad o el entorno familiar

Los(as) estudiantes (N = 20) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

- Polimorfica. Pro / Arg Arg / Arg Arg / Arg Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Pro / Arg Pro / Arg Pro / Arg Pro / Arg Pro / Arg Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Pro / Arg Pro / Pro Pro / Pro Arg / Arg Pro / Arg Pro / Pro

EDAD 26 22 21 22 25 22 41 22 24 27 22 22 26 27 23 22 22 22 21 20

Familia Antecedentes N N N Si Si Si Si Si Si Si Si Si N N N Si Si N Si Si

Maestros (N = 29) 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

- Polimorfica. Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Arg / Arg Pro / Arg Pro / Arg Pro / Pro Arg / Arg Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Arg / Arg Pro / Arg Pro / Arg Arg / Arg Arg / Arg Arg / Arg Pro / Arg Arg / Arg Pro / Pro Pro / Arg Arg / Arg Pro / Arg

EDAD 42 41 53 52 48 64 39 42 41 46 46 40 54 35 40 33 52 49 52 55 51 42 50 46 48 48 47 49

Familia Antecedentes N Si N N N Si N N Si N Si N Si Si N N Si Si N N N N N Si Si N Si Si

49 Pearson v
2

Arg / Arg

27

Si

2,4454, Probabilidad 0,294, prueba exacta de Fisher 0,384.

conocer los grados de libertad''''. Por lo general, k es igual al producto de (columnas 2 1) 3 (filas 2 1), que representa los grados de libertad. En este caso, (3 2 1) (2 2 1) 2 .Sin embargo, hemos perdido'''' un grado de libertad cuando cal-ing cada parmetro.En este caso, la frecuencia del otro alelo es p = (1 2 q) si p q 1.Los grados de libertad para la prueba de Hardy-Weinberg proporciones son el nmero de genotipos menos el nmero de alelos (3 GE-notypes 2 2 alelos 1).Hay un grado de libertad y el nivel 2 de significacin del 5% para un grado de libertad es 3,84. Puesto que el valor v es menor que este, el hiptesis nula no se rechaza. Los resultados son consistentes con la hiptesis nula, es decir, las frecuencias observadas no se aparten de los que se obtienen suponiendo que los individuos llevar a cabo al azar estera-Ing. Casi la mitad de la poblacin posee el polimorfismo Arg-tipo de p53, lo que podra indicar que son ms susceptibles a desarrollar cncer cervical cal.No hubo correlacin entre la edad o la familia de vuelta en tierra y la presencia de cualquiera de los dos alelos (Tabla III). En este caso, se utiliz la prueba de Fisher 's exacto que se puede aplicar a las pruebas de equilibrio de Hardy-Weinberg proporciones.Debido a que la prueba est condicionada a que las frecuencias allicas p y q, el problema puede ser visto como el ensayo para el nmero apropiado de heterocigotos.De esta manera, la hiptesis de Hardy-Weinberg proporciones se rechaza si el nmero de heterocigotos es demasiado grande o demasiado sm todo.Esta prueba se utiliza en el anlisis de tablas de contingencia donde los tamaos de muestra son pequeos, y el significado de cualquier desvia-cin de una hiptesis nula se puede calcular exactamente

en lugar de confiar en una prueba estadstica que tiene una distribucin que pproximates un conocido terico de distribucin.La prueba es til para los datos categricos que resultan de clasificar los objetos en dos formas diferentes, sino que se utiliza para examinar la significacin de la asociacin (de contingencia) entre los dos tipos de clasificacin t ion.En nuestro caso, un criterio de clasificacin es la edad, mientras que el otro es el fondo de la familia. Queramos saber si estas dos clasificaciones se asocia, es decir, si la edad y los antecedentes familiares se relacionan con la presencia de la lymorphism p o.La prueba consiste en una tabla de contingencia 2 3 3 y el valor de p (0,384) de la prueba se calcula utilizando un paquete estadstico (matemticas-world.wolfram.com). Este valor indica que la edad y los antecedentes familiares no estn relacionados con la f presencia o el polimorfismo. Despus de haber cumplido con xito los objetivos de los dos ensayos de ADN descritas anteriormente, se implement el mdulo en un laboratorio de la divisin superior gentica y bioqumica, que contaba con un total de 15 estudiantes de pregrado. Aunque el protocolo I S relativamente largo, los estudiantes fueron capaces de completar el protocolo y analizar adecuadamente los datos resultantes en tres perodos de laboratorio.El perodo de laboratorio primero implica la recogida de muestras de sangre,-plos, el lavado y el secado de los papeles de filtro, y PCR am lification p del gen p53.Durante el segundo perodo de laboratorio, los productos de PCR fueron digeridos con la enzima BstUI y dos geles de poliacrilamida se prepararon grandes y se vierte por grupos de estudiantes. Durante el perodo de laboratorio tercero, el resol estudiantes ved la mues-tras en el gel y se realiz el bromuro de etidio 241

FIG. 2.La presencia de la p53 codon 72 polimorfismo en muestras de sangre de los estudiantes. Los productos de PCR se analizaron en un gel de acrilamida al 4% y se visualizaron por tincin con bromuro de etidio. Los carriles 1 -12 mostrar los productos PCR de p53 despus de la digestin con BstUI. Los carriles 13 y 15 son el ADN genmico de clulas de la sangre y de la lnea celular MDA231, respectivamente.L ane 14 es el control negativo y el carril 16 es el control positivo.Carril 17 contiene marcadores moleculares (50-pb escalera de ADN de Promega). La digestin de la enzima produce dos fragmentos de 125 y 78 pb. El fragmento sin digerir es de 203 pb. Los carriles 1, 3, 9, 11 son una d Arg / Arg homocigotos mientras que los carriles 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, y 12 son heterocigotos.

tincin inmediatamente despus. Una imagen de los resultados se obtuvieron con la documentacin BioRad gel sistema (Fig. 2). Para el anlisis estadstico, los estudiantes fueron instruidos para utilizar el v frmula para calcular la frecuencia de la mutacin como se ha descrito anteriormente y se les pidi que determinar si la poblacin se encontraba en equilibrio de Hardy-Weinberg. Como parte de la discusin experimental, los estudiantes fueron invitados a presentar el anlisis estadstico y su significado en trminos de gentica de poblaciones.
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DISCUSIN

Este proyecto result ser un gran xito en el que se establece un protocolo de laboratorio de bioqumica, apropiado para un estudiante curso superior nivel de divisin, para detec-cin de una mutacin presente en el cncer. Los objetivos principales de aprendizaje fueron alcanzados: los estudiantes xito en 1) aislamiento del ADN genmico a partir de sangre perifrica, 2) usando PCR para amplificar el polimorfismo en el codn 72 de p53 y el uso de restriccin BstUI digestin enzimtica para confirmar el genotipo, 3) resolver las

mues-tras con la electroforesis en gel de poliacrilamida y tincin con bromuro de etidio para visualizar los resultados, y 4) aprender a analizar correctamente los resultados en el contexto de la gentica de poblaciones humanas y la forma de relacionar la presencia del polimorfismo con la susceptibilidad de desarrollar cncer. Fue muy alentador escuchar a los estudiantes comentan que fueron motivados por la idea de la realizacin de protocolos utilizados por los investigadores reales de laboratorio para determinar la susceptibilidad al cncer.Adems, los estudiantes mostraron un mayor inters en los resultados experimentales desde que eran ab le para utilizar su propio ADN en el protocolo y descubrir la naturaleza allica de los genes humanos. Nos las arreglamos para incorporar todos los elementos del procedimiento en tres perodos de laboratorio. La recoleccin de las muestras de sangre fue fcil y rpido con las tarjetas FTA, y el ADN cin iso fue sencillo.Las etapas de amplificacin de PCR fueron coordinadas adecuadamente y siempre que los estudiantes la oportunidad de obtener experiencia prctica con este importante mtodo que se utiliza ampliamente en muchas reas de la investigacin cientfica. Nos k delgado que el aspecto ms difcil de este protocolo es la preparacin de las placas de vidrio y el vertido de los geles de acrilamida grandes para la resolucin de PAGE de los productos de PCR. Por lo tanto, es muy importante que el instructor antes de tener pericia una experiencia d para que los estudiantes puedan ser debidamente instruidos en el vertido, carga y ejecuta el gel. Si el ejercicio se complet de acuerdo con el protocolo, los polimorfismos de p72 codn puede ser visualizada muy claramente (Figs. 1 y 2). Un gel de poliacrilamida de transferencias significativas resolucin de los productos de PCR, y de etidio MIDE-bro resultados de la tincin de contraste suficiente para rpida visu-zacin de las bandas polimrficas.Los alelos corres-pondientes a los diferentes codones p53-72 loci son distinguibles t relativos o los positivos y negativos de los controles. Se detect un alto porcentaje de arginina homozy-Gotes en nuestras muestras de 49, lo que sugiere que este genotipo, que se considera un factor de riesgo de cncer asociado con el VPH oncognico, es altamente prevalente en la Ciudad de Mxico. La identificacin de este tipo de polimorfismo tiene un impacto preventivo im-portante, ya que identifica un factor de riesgo para el carcinoma de cuello uterino asociada con infeccin por HPV. Un elemento de complejidad en cuanto a susceptibilidad gentica-dad del cncer es la n ce existe de mltiples grupos tnicos, algunos de los cuales pueden verse afectados por los efectos fundadores fuertes que pueden explicar la agrupacin local o regional de algunos tipos de cncer.Por lo tanto, el uso de biomarcadores moleculares pueden ser particularmente tiles en la identificacin de las funciones respectivas del medio ambiente, estilo de vida biolgica, y el riesgo gentico factores de desarrollar cncer y para ayudar en su deteccin y prevencin. La realizacin exitosa de los tres objetivos y la s ubsequent retroalimentacin positiva por parte de los estudiantes demuestren la viabilidad de introducir a los mtodos de anlisis de ADN y tecnologas utilizadas por los laboratorios de investigacin en una clase de laboratorio de grado.La experiencia adquirida y los conocimientos adquiridos ayudarn a los estudiantes que planean seguir carreras en los campos de cre-ciente de la genmica mdica, as como ayudar a todos los estudiantes a entender mejor los polimorfismos y la susceptibilidad del cncer.
Reconocimiento-La Autores Reconocer. Dr. Juan Nu 'n ~ ez-Farfa' n, Instituto de Ecolog'a, UNAM, por su ayuda con el anlisis estadstico y discusin til sobre gentica de poblaciones.

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