Universidade do Minho Licenciatura em Biologia Geologia 2009/2010 Docentes: Dr. Ana Preto e Dr.

Rui Oliveira

Determinao da actividade da Bomba Na/K ATPase

Discentes: Ana Isabel Fernandes, Diogo Gonalves, Juliana Oliveira, Liliana Sousa, Sara Antunes. 1 Ano.

ndice
Resumo..................................................................................................................................... 3 Introduo e Objectivos ............................................................................................................ 4 Material e mtodos .................................................................................................................. 7 Resultados .............................................................................................................................. 13 Discuo ................................................................................................................................. 18 Bibliografia ............................................................................................................................. 20 Anexo ..................................................................................................................................... 21

Resumo

O objectivo principal deste relatrio determinar a actividade da Na/K - ATPase em membranas plasmticas. Medimos essa actividade, indirectamente, atravs da concentrao do fosfato inorgnico, j que essa enzima hidrolisa o ATP para obter energia. A Na+/K+ ATPase (bomba sdio potssio) uma enzima que funciona atravs do gradiente de electres. necessria a sada de trs ies de Na + e de entrada de dois ies K+ para a clula, sendo estas entrada e sada contra o gradiente de concentrao. Por essa razo tem de existir um transporte mediado com gasto de energia (transporte activo). Esta bomba faz parte do impulso nervoso, em clulas nervosas electricamente activas. Usamos para esta experincia algum do material existente no laboratrio e outro extra laboratorial, nomeadamente, crebro de ratinho, homogeneizador de Potter (ver anexo imagem 2), e uma ultracentrfuga (basicamente no foi utilizada por ns, mas tivemos acesso informao pendente ao seu funcionamento). Preparamos 4 tubos aos quais vo ser designamos por amostra I, II, III e IV (ver material e mtodos), e com o auxlio do protocolo, chegamos concluso que a amostra II foi a que teve maior actividade, tal como seria de esperar, e que as outras amostras tinham uma quantidade de Pi significativa mas que no se devia ao funcionamento da bomba. No final, obtemos uma concentrao de fosfato inorgnico de 2,950 nmol/mg de protena/h. Conclumos assim que a bomba Na/K ATPase tem uma enorme importncia nas funes que desempenha, nomeadamente nos impulsos nervosos.

Introduo e Objectivos

As aulas prticas da unidade curricular de Bioenergtica e Metabolismo consistiram na determinao da actividade da Na +/K+ ATPase em membranas plasmticas (isoladas do crebro de ratinho), pela anlise de fosfato resultante da hidrlise de ATP, em diferentes condies experimentais utilizando uma curva padro de fosfato. A ATPase tipo F um transportador activo que muito importante na conservao de energia nas reaces que ocorrem nas mitocndrias, bactrias e cloroplastos e utilizada quer na fosforilao oxidativa e quer na fotofosforilao. Este tipo de ATPases catalisa a passagem transmembranar de protes contra o gradiente de concentrao, logo esta produz ATP para que o transporte activo de ies possa ocorrer atravs da hidrlise de ATP [1]. A ATPase de tipo F que estudamos foi a F oF1ATPase.

Figura 1 - FoF1ATPase vista lateral e vista de corte, subunidades (alfa), (beta), (gamma), (delta) e (psilon) pertencentes subunidade maior F1 e a, b e c pertencentes subunidade maior Fo. [2]

A Na+/K+ ATPase (bomba sdio potssio) uma enzima que funciona atravs do gradiente de electres. necessria a sada de trs ies de Na + e de entrada de dois ies K+ para a clula, sendo estas entrada e sada contra o gradiente de concentrao tem de existir transporte mediado com gasto de energia (transporte activo).

Figura 2 - Transporte activo, e funcionamento da bomba de sdio e potssio Na/K - ATPase. Na imagem, vemos a entrada dos 3 Na na bomba juntamente com a molcula de ATP, havendo a produo de ADP onde o Pi permanece ligado bomba (1). Posteriormente, a libertao dos Na para o meio extra celular (2) e a entrada de 2 K para a bomba, e a libertao dos mesmos juntamente com o Pi para o interior da clula (3, 4, 5 e 6), criando assim um gradiente com uma maior concentrao de Na dentro e K fora.

Esta enzima constituda por duas sub-unidades, nomeadamente (alfa) e (beta) e est presente na membrana celular sendo transmembranar (atravessa toda a membrana).

Figura 3 - Bomba sdio-potssio, esquema do lado esquerdo, locais de ligao do sdio, do potssio ou da uabana e da molcula de ATP; esquema do lado direito subunidades e da bomba sdio potssio [3].

O inibidor especfico da actividade da Na+/K+ - ATPase a uabana competindo com o K+ pelo mesmo local de ligao como se v na imagem anterior. Tem como funo primria o transporte de ies sdio e potssio contra o gradiente de concentrao fazendo parte do impulso nervoso, em clulas nervosas electricamente activas, a Na +/K+ - ATPase tem por funo restabelecer o potencial de repouso depois de cada ciclo de despolarizao. O gradiente de Na+ produzido pela actividade da bomba Na+/K+ regula indirectamente o volume celular e o potencial de membrana. [4]. Como funo secundria pode efectuar transporte de acares, aminocidos e nutrientes.

Objectivo Determinar a actividade da Na/K - ATPase em membranas plasmticas (isoladas do crebro de rato), pela anlise do fosfato resultante da hidrlise de ATP, em diferentes condies experimentais, utilizando uma curva padro de fosfato.

Material e mtodos

Fraccionamento celular e centrifugao diferencial Para se proceder separao de diferentes fraces subcelulares de clulas de crebro de ratinho por centrifugao diferencial, comea-se naturalmente por colocar gelo no tabuleiro e obter 1 crebro deste animal. De seguida, tira-se o crebro do tubo e coloca-se numa placa de Petri, mergulhando-o em soluo isotnica de sacarose 0,32 M tamponizada com Hepes-Triss 20mM (pH 7,4) fria (meio isolamento - MI). Depois de bem lavado, o tecido cortado finamente com o auxlio de um bisturi, rejeitando a poro mielinizada (mais branca) mantendo sempre no gelo. Continuamente, procede-se homogeneizao do tecido em 40 ml de MI/crebro, usando um homogeneizador de Potter (mantendo no gelo). Logo a seguir, verte-se o homogeneizado numa proveta (lavar Potter com MI e aproveitar) at perfazer 60ml com MI e agita-se. Posteriormente, divide-se igualmente por 4 tubos de centrfuga (15 ml), acertar os pesos e colocar na centrfuga a 7255 rpm, 5532G a 4C durante 2 minutos. De seguida, coloca-se os sobrenadantes em tubos limpos e acerta-se os pesos. Aps este passo, adiciona-se 5ml de MI junto ao pellet (P1) e ressuspende-se. Os sobrenadantes so levados a uma centrfuga a 10700rpm, 12000G durante 12 minutos. Seguidamente, retira-se o tubo da centrfuga e separa-se o sobrenadante do pellet, desprezando o sobrenadante. O sedimento agora obtido rico em vesculas de SPM (P2 fraco crude). Logo a seguir, ressuspende-se o pellet (P2) com 400l de MI com o auxilio de uma micropipeta cortada em bisel, e verte-se para um tubo de vidro para homogeneizar a suspenso. Por fim, retira-se 600l para 2 tubos Eppendorf e coloca-se no congelador a 20C negativos (congelar para a aula P3). Manter o tubo de vidro com a suspenso restante no frio, para se efectuar a quantificao proteica

Centrifugao em gradiente de densidade Em primeiro lugar pegar em dois tubos de backman e, com o auxlio de uma bureta e de uma pipeta, preparar um gradiente descontnuo com 7ml de sacarose e com as seguintes solues: 0,8M;1,4M e 2,2M. No primeiro tubo a sacarose colocada recorrendo a uma pipeta ( cada adio de uma nova sacarose feita com uma pipeta lavada ) e comease pelas seguintes solues: 2,2M;1,4M e 0,8M. No segundo tubo, a sacarose colocada com o auxlio de uma bureta e o procedimento igual ao do tubo 1, mas com as solues de sacarose ao contrrio (0,8M;1,4M e 2,2M). A seguir, pipetar cuidadosamente 5ml de homogeneizado sobre a camada de sacarose 0,8M fazer s 2 gradientes com homogeneizado e colocar imediatamente no suporte da ultracentrfuga arrefecido para evitar difuso de partculas. (Deste modo, como o homogeneizado se encontra com uma sacarose de 0,32M, constitui-se um gradiente formado por 4 bandas). Seguidamente leva-se os tubos a centrifugar durante 90 minutos, a 20 000 rpm, em ultracentrfuga refrigerada com rotor horizontal. (Quanto maior for o tempo de centrifugao e fora utilizada, melhor ser a separao dos vrios componentes de homogeneizado). Por fim, observar o aparecimento de vrias bandas.

Determinao da concentrao da protena

Identificar e preparar os 7 tubos de acordo com a ordem indicada da tabela:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 gua (ml) 0,50 0,25 -----0,50 0,50 0,50 0,50 MI (l) BSA 0,4% (P/V) (ml) 50 50 50 ----------40 40 -----0,25 0,50 --------------------SDS 10% (l) 50 50 50 50 50 50 50 Amostra (l) 0 0 0 50 50 10 10

Aps ter adicionado todas as solues nos tubos, de acordo com a tabela indicada, leva-se a misturar tudo ao vrtex. Posteriormente, adiciona-se em cada tubo 2 ml de Reagente de Biureto e leva-se novamente ao vrtex. Continuamente, coloca-se os tubos num copo de gua tpida e deixa-se reagir durante 10min. Ler a absorvncia a 540nm. Aps ter tirado os dados, construir uma curva de calibrao e determinar a concentrao de protena das amostras. Exprimir os resultados em mg/ml.

Determinao da actividade da NA+/K+ ATPASE em membranas plasmticas sinpticas isoladas de crebro de ratinho.

Determinar a actividade da enzima Na+/K+ - ATPase (em sinaptossomas de crebro de ratinho) pela utilizao do mtodo espectrofotomtrico, em que, de 30 em 30 minutos, vai-se doseando quantidade de Pi inorgnico, resultante da hidrlise de ATP. Comea-se por preparar vrios tubos cnicos de vidro de centrfuga, segundo os valores cedidos pela tabela, ajustando o volume final de 2 ml. Seguidamente, agitar todos os tubos no vrtex de modo a combinar todos os constituintes. Deixar equilibrar a temperatura num banho (37 C).

Tubos I II III IV

Tampo MgCl2 0,1 pH 7,0 (l) M (l) 500 500 500 500 100 100 100 100

NaCl 1 M (l) ---200 200 200

KCl 1 M (l) ---50 50 50

Uabana 20 mM (l) ------200 ----

H2O Protena Amostra (l) (l) (l) 1309 1059 859 1150 ---0,5 0,5 ---91 91 91 ----

Para iniciar a reaco temos de adicionar 100 l de ATP e agitar no vrtex. Repetir o procedimento nos restantes 3 tubos, com o intervalo de 1 minuto entre cada (controlar com um cronmetro). Para obter resultados, esperar 30 minutos para que a reaco ocorra. Ao fim dos 30 minutos, adicionar 2 ml de TCA (cido triccloroactico) a 10% frio, nos diferentes tubos, com 1 minuto de diferena entre cada tubo (como se procedeu anteriormente com o ATP) de modo a parar a reaco. Aps adicionar o TCA, agitar os tubos no vrtex e coloc-los imediatamente no gelo.

De modo a sedimentar a protena precipitada pelo TCA, centrifugar as suspenses numa centrfuga de bancada durante 5 minutos, a uma velocidade de cerca de 400 rpm. Aps a centrifugao, recolher 2 ml de sobrenadante de cada um dos tubos e coloc-los em diferentes tubos, os quais vo ser designados por amostra I, II, III e IV, respectivamente. Para completar a experincia, constri-se uma curva padro de fosfato, de acordo com a tabela fornecida.
Tubos 1 2 3 4 5 6 Amostra I Amostra II Amostra III Amostra IV KH2PO4 0,5 mM (l) -----50 100 150 300 0,4 ml (da soluo 5mM) 400l --------------------Amostra (l) H2O (l) ------------------------------2000 2000 2000 2000 3000 2950 2900 2700 2600 2600 1000 1000 1000 1000

Aps termos os tubos preparados leva-se ao vrtex. Para determinar o fosfato, adicionar em cada um dos tubos 2 ml de Reagente de Molibdato. Deixar a reaco decorrer durante um minuto e ler a absorvncia a 660 nm. Calcular a quantidade de Pi inorgnico de cada tubo e posteriormente construir um grfico barras onde est expressa a quantidade de ATP hidrolisado nos ensaios I, II, III e IV em nmol de Pi por mg de protena por hora. Por fim, calcular a actividade da Na+/K+ - ATPase das SPM isoladas.

Material utilizado: Crebro de ratinho; Homogeneizador de Potter (ver anexo imagem 2); Ultracentrfuga.

Resultados

Durante as aulas laboratoriais, conclumos vrias experincias com o fim de determinar a actividade da bomba Na+/K+. Numa fase inicial, preparamos solues especficas para determinar a absorvncia dos tubos 1 a 6. Nesses tubos, reconhecemos a concentrao de Pi e a absorvncia dos mesmos. Com isto pretendemos elaborar um grfico de disperso com uma recta de calibrao (ver na figura 4).
Tabela I Tabela ilustrativa da absorvncia e da concentrao de Pi em l/ml dos 4 grupos para determinar a curva padro. Tubos 1 2 3 4 5 6 D.O. G1 D.O. G2 D.O. G3 D.O. G4 *Pi+ (l/ml) Mdia D.O. Desvio padro 0 0 0 0 0 0 0 0,161 0,173 0,294 0,172 0,25 0,200 0,063 0,315 0,358 0,462 0,346 0,5 0,370 0,064 0,467 0,507 0,601 0,553 0,755 0,532 0,058 0,877 0,937 0,863 0,93 1,5 0,902 0,037 1,104 1,181 1,087 1,175 2 1,137 0,048

Curva Padro de Fosfato Inorgnico

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 D.O. 660nm

y = 0,5977x R = 0,9809
Srie1 Recta calibrao 2,5

[Pi] (l/ml)

Figura 4 Grfico ilustrativo da curva padro de fosfato inorgnico. Para determinar esta curva, utilizamos os dados da tabela I, onde em abcissa temos a concentrao de fosfato inorgnico em l/ml, e em ordenada temos a mdia dos valores da absorvncia do turno. N o mesmo grfico, temos presente a equao da recta de calibrao e R. Para determinar a concentrao de fosfato inorgnico, recorremos a uma srie de clculos para, partindo da absorvncia, chegarmos concentrao do fosfato, como podemos ver pelas seguintes tabelas e figura.

Tabela II Absorvncia das amostras a 660nm. Absorvncia (660nm) Amostras I II III IV Grupo 1 0,79 1,810 0,877 0,25 Grupo 2 0,944 1,555 0,785 0,457 Grupo 3 0,95 1,366 0,818 0,441 Grupo 4 0,764 1,642 0,699 0,289

Na tabela II registamos os dados da absorvncia obtidos no espectrofotmetro a 660nm. Destes dados, partimos para a tabela III, onde passamos a absorvncia para concentrao de fosfato inorgnico em nmol. Conseguimos resolver o problema com a ajuda da curva padro de fosfato inorgnico (figura 4), e substitumos na equao (y=0,5977x) o valor de x pelo valor da absorvncia (registada na tabela II), e chegamos a valores de fosfato inorgnico (registados na tabela III)

Tabela III Concentrao do fosfato inorgnico em nmol. Concentrao de fosfato inorgnico (nmol) Amostras I II III IV Grupo 1 0,472 1,082 0,524 0,149 Grupo 2 0,564 0,929 0,469 0,273 Grupo 3 0,568 0,816 0,489 0,264 Grupo 4 0,457 0,981 0,418 0,173

Com estes dados, dividindo os valores pela quantidade de protena em mg (0,5), chegamos a uma concentrao de fosfato inorgnico em nmol/mg de protena (como podemos ver na tabela IV).

Tabela IV Concentrao do fosfato inorgnico em nmol/mg de protena.

Concentrao de fosfato inorgnico (nmol/mg protena) Amostras Grupo 1 I II III IV 0,944 2,164 1,048 0,299 Grupo 2 1,128 1,859 0,938 0,546 Grupo 3 1,136 1,633 0,978 0,527 Grupo 4 0,913 1,963 0,836 0,345

Partindo dos dados em nmol/mg de protena, chegamos concentrao de Pi em nmol/mg de protena/h, se dividirmos por 0,5 (j que procedemos experincia em 30 minutos) que ser o mesmo que multiplicar os valores por 2, chegando assim aos valores registados na tabela V.

Tabela V Concentrao do fosfato inorgnico em nmol/mg de protena/h Concentrao de fosfato inorgnico (nmol/mg protena/h) Amostras I II III IV Grupo 1 1,889 4,327 2,097 0,598 Grupo 2 2,257 3,718 1,877 1,093 Grupo 3 2,271 3,266 1,956 1,054 Grupo 4 1,827 3,926 1,671 0,691 Mdia 2,061 3,809 1,900 0,859

Com os dados da tabela V, procedemos elaborao de um grfico de barras (fig. 5), para ter uma ideia visual da quantidade de fosfato inorgnico presente em cada uma das amostras.

[Pi] (nmol/mg/h) das Amostras

4,000 3,500 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 I II Amostras III IV [Pi] 0,859 2,061 1,900 3,809

Figura 5 Grfico ilustrativo da concentrao de fosfato inorgnico das amostras. Para obtermos este grfico, utilizamos os dados da tabela V, onde em abcissa temos as amostras, e em ordenada a concentrao do fosfato inorgnico em nmol/mg de protena/h. Chegamos a estes dados atravs da absorvncia das amostras, e dos diversos clculos feitos ilustrados em tabelas (II, III, IV e V). Aqui podemos ver que a quantidade de Pi na amostra II muito maior do que nas amostras I, III e IV, e o facto de existir esta discrepncia ser discutido na parte de Discusso.

A determinao da actividade da bomba Na+/K+ dada pela subtraco da quantidade de fosfato inorgnico da amostra IV s restantes. Dando assim, um resultado esquematizado na seguinte tabela e figura.

Tabela VI Tabela ilustrativa da actividade da bomba Na+/K+ medida em concentrao de Pi (em nmol/mg de protena/h). Amostras I II III IV Actividade da bomba [Pi] (nmol/mg de protena/h) 1,202 2,950 1,041 (*)

(*) Como iremos referir na parte de discusso, teoricamente o valor da amostra IV deveria ser 0 (zero). Devido actividade a presente, subtramos o valor da amostra IV s restantes amostras, obtendo assim os valores esquematizados na tabela VI e figura 6.

Actividade Bomba Na+/K+

3,000 [Pi] (nmol/mg de protena/h) 2,500 2,000 2,950

1,500
1,000 0,500 0,000

1,202

1,041

II Amostras

III

Figura 6 Grfico ilustrativo da actividade da bomba Na+/K+ medida em concentrao de fosfato inorgnico (nmol/mg de protena/h). Teoricamente a concentrao do Pi na amostra IV ser 0 (zero), pelo que excludo do grfico.

Discuo

Cada grupo, com os tubos de 1 a 6, determinou a absorvncia dos mesmos. Existem valores que fogem da tendncia geral, mas decidimos no excluir por no sabermos a discrepncia que os valores podem ser, nem sabemos os erros cometidos pelos grupos. Sendo assim, obtivemos uma curva de calibrao como podemos ver na figura 4. Esta curva tem um factor de correlao de 0,9809. Poderamos ter uma curva com um R de 0,991 se exclussemos os tubos 2, 3 e 4 do grupo 3, mas, como supra mencionado, no foram excludos estes valores. Depois de prepararmos as amostras, e de medir a densidade ptica, registamos os valores de absorvncia (ver tabela II). Estes dados no so muito semelhantes, j que os grupos 2 e 3 tm valores semelhantes entre si na amostra I, mas discrepantes em relao aos restantes dois grupos. Outros valores fogem da tendncia geral como o da amostra II, grupo 1 e 3; amostra III, grupo 4; amostra IV, grupo 1 e 4. A diferena destes valores em relao tendncia geral deve-se ao facto de haver erros laboratoriais, ou erros no procedimento dos mtodos (erros de medio etc.). Para prepararmos estas amostras, tnhamos de introduzir 100l de ATP em cada um dos tubos com intervalos de 1 minuto entre cada um. Podem ter existido grupos que no tenham respeitado esse intervalo de tempo ou terem pipetado quantidades diferentes de ATP. Isto pode ter levado a certos erros laboratoriais impossveis de fugir, que fazem parte de todas as actividades. Mesmo depois de ter-mos medido as densidades, podem ter existido erros nos clculos da concentrao do fosfato inorgnico que nos tenham levado a uma soluo diferente da que esperaramos obter. Como resultado final, obtivemos um grfico de barras (ver figura 5) que nos permite ver de uma forma mais concreta, a concentrao de fosfato inorgnico das diferentes amostras.

Vemos que a amostra II tem uma maior concentrao de Pi seguido da amostra I, III e IV. Teoricamente, as amostras I, III e IV no deveriam ter actividade. No tubo 1 podemos ver que houve actividade da enzima apesar de no haver substrato (NaCl e KCl), isto pode dever-se ao facto de haver outras fontes destes sais dentro da clula ou devido presena de detergentes nos materiais utilizados para dosear e armazenar os reagentes. No tubo 2, como seria de esperar detectou-se muita actividade enzimtica. Neste tubo tinha tudo o que era necessrio para as reaces ocorrerem, tinha substratos, tampo, protena e amostra. No tubo 3, registou-se actividade enzimtica embora no se esperasse nenhuma devido presena do inibidor especfico desta bomba (uabana). Esta actividade pode dever-se ao facto da quantidade de uabana no ser suficiente para inibir totalmente a actividade da enzima Na+/K+ ATPase. Pode ainda detectar-se a presena de fosfato inorgnico proveniente da hidrlise do ATP atravs de outras bombas que efectuam transportes mediados. Pode tambm, existir Pi proveniente de detergentes utilizados na lavagem dos materiais. No tubo 4, era de esperar que no existisse fosfato inorgnico uma vez que no havia amostra nem protena. Isto no se verifica, pois detectou-se na espectrofotometria de massa uma ligeira quantidade de fosfato inorgnico que pode ser devido presena de detergentes nos materiais utilizados para dosear e armazenar os reagentes. No final, obtemos uma concentrao de fosfato inorgnico de 2,950 nmol/mg de protena/h, e conclumos assim que a bomba Na/K ATPase tem uma enorme importncia nas funes que desempenha, nomeadamente nos impulsos nervosos.

Bibliografia

[1] Nelson, David L. & Cox, Michael M. , Lehninger PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY, 4 Edio, Cap.11,sub.cap.3 Solute Transport across Membranes, pg. 401 [2] Retirado de: http://www.atpsynthase.info/FAQ.html [3] Protocolo das aulas laboratoriais , segundo semestre, ano 2010, fornecido pelos docentes Dra. Ana Preto e Dr. Rui Oliveira. [4] Retirado de: http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/pt/Na%252B%252FK%252BATPase

Anexo

Em anexo colocamos o que achamos ser desnecessrio para a compreenso do relatrio, mas visto que fez parte da experincia, colocamos como um complemento.
Tabela VII Absorvncia da BSA para 1 e 2 mg mg BSA Grupos 1 2 3 4 Mdia 1 0,073 0,093 0,106 0,104 0,094 2 0,146 0,2 0,203 0,207 0,189

Tabela VIII Absorvncia da amostra (com 50 e 10 l) Amostra Grupos 1 2 3 4 50 l 0,027 0,027 0,035 0,023 50 l 0,027 0,025 0,033 0,025 10 l 0,003 -0,001 0,01 0,015 10 l 0,003 -0,004 0,009 0,01

Tabela IX Determinao dos miligramas de protena dos grupos 1, 2, 3 e 4 atravs da curva de calibrao Grupos 1 1mg BSA 2mg BSA Amostra 50 l Amostra 50 l Mdia amostra Protena (mg) 0,073 0,146 0,027 0,027 0,027 0,286 2 0,093 0,200 0,027 0,025 0,026 0,275 3 0,106 0,203 0,035 0,033 0,034 0,360 4 0,104 0,207 0,023 0,025 0,024 0,254

Curva calibrao BSA

0,2 0,18 0,16 Absorvncia 540nm 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Srie1 Recta calibrao y = 0,0944x R = 1

BSA (mg)
Figura 4 Curva de calibrao de BSA. Para determinar esta curva, utilizamos os dados da tabela IX, onde em abcissa temos a concentrao de BSA mg, e em ordenada temos a mdia dos valores da absorvncia do turno. No mesmo grfico, temos presente a equao da recta de calibrao e R.

Imagem 1 Centrifuga de bancada utilizada para centrifugar o homogeneizado (centrifugado a 7255 rpm, 5532 G, 4C durante 2 minutos e posteriormente a 10700 rpm, 12000 G, durante 12 minutos)

Imagem 2 Docente Ana Preto a proceder homogeneizao da amostra no homogeneizador de Potter.

Imagem 3 Tubo com os diferentes nveis de densidade de sacarose depois de ter sido separado manualmente, com a soluo de maior densidade no fundo, e a menor na superfcie.