GUIA #14 TERAPIA GENICA La dotacin gentica de una clula puede ser modificada mediante la introduccin de un gen normal,

que sustituya al gen defectuoso en su funcin; es lo que se denomina terapia gnica. Se podra definir como el conjunto de tcnicas que permiten vehiculizar secuencias de DNA o de RNA al interior de clulas diana, con objeto de modular la expresin de determinadas protenas que se encuentran alteradas, revirtiendo el trastorno biolgico que ello produce. MODALIDADES DE TERAPIA GENICA Terapia gnica de clulas terminales: dirigida a modificar la dotacin gentica de las clulas implicadas en la formacin de vulos y espermatozoides y por tanto, transmisible a la descendencia. Este tipo de terapia seria la indicada para corregir de forma definitiva las enfermedades congnitas cuando sea eficaz la tcnica. La terapia gnica de la lnea germinal humana no ha sido practicada debido a las limitaciones de la tecnologa de manipulacin de las clulas germinales y a cuestiones ticas, especialmente el peligro de la modificacin del acervo gentico de la especie humana y el riesgo de potenciacin gentica, dando as practicas de eugenesia (modificacin y mejora de los rasgos humanos por diferentes tcnicas) por seleccin artificial de genes que confieren caracteres ventajosos para el individuo. Terapia gnica somtica: dirigida a modificar clulas somticas o constituyentes. Por ello, la modificacin gentica no puede transmitirse a la descendencia. Solamente se llevan a cabo protocolos clnicos en este tipo de terapia gnica. Esta tcnica no ha sido motivo de reservas ticas, salvo lo que se relaciona a aplicaciones posibles en potenciacin de la especie humana, manipulaciones genticas cuyo objetivo sea potenciar algn carcter, sin pretender tratar enfermedad alguna. CLASIFICACION DE LA TERAPIA GENICA Terapia gnica in vivo: agrupa la tcnicas en las que el material gentico se introduce directamente en las clulas del organismo, sin que se produzca su extraccin ni manipulacin in vitro, la gran ventaja es su mayor sencillez, sin embargo, tienen el inconveniente de que el grado de control sobre todo el proceso de transferencia es menor, la eficiencia global es tambin menor (no pueden amplificarse las clulas transducidas) y es difcil conseguir un alto grado de especificidad.

Terapia gnica ex vivo: protocolos en los que las clulas a tratar son extradas del paciente, aisladas, crecidas en cultivo y sometidas al proceso de transferencia in vitro. Una vez se seleccionen las clulas que han sido efectivamente transducidas, se expanden en cultivo y se introducen de nuevo en el paciente. Sus ventajas son que nos permite la eleccin del tipo de celula a tratar, adems de un estrecho control sobe todo el proceso y la mayor eficacia de la transduccin gentica. Los problemas son la mayor complejidad y costo de los protocolos, asi como la imposibilidad de transducir aquellos tejidos que no son susceptibles de crecer en cultivo, existe el riesgo inherente a la manipulacin de las clulas en cuanto a problemas de contaminacin.

La terapia de fundamento gentico se encuentra en fase de experimentacin, en un futuro nada lejano para su uso clnico seguro y eficaz. Transferencia gnica: la terapia gnica requiere transferencia eficiente de genes clonados a clulas enfermas, para que los genes introducidos sean expresados en cantidad adecuada. Tras la transferencia , los genes insertados se pueden quedar como elementos genticos extra cromosmicos. Genes integrados en cromosomas: la ventaja de que el gen se integre en el cromosoma es que puede perpetuarse por replicacin cromosmica tras la divisin celular, se puede obtener una expresin estable a largo plazo. As, en los tejidos formados por clulas en divisin activa, la clave es dirigir la modificacin a las clulas madre (poblacin minoritaria de clulas precursoras indiferenciadas que dan lugar a las clulas diferenciadas maduras del tejido). Las clulas madre no solo dan lugar a las clulas maduras del tejido, sino que se renuevan ellas mismas, por esto es una poblacin inmortal de clulas a partir de la cual deriva el resto de clulas del tejido. La transferencia eficiente de genes a las clulas madre y la posterior estable expresin del gen ofrece la posibilidad de curar un trastorno gentico. La integracin cromosmica tiene sus inconvenientes porque ocurre casi al azar: la localizacin de los genes insertados puede variar enormemente entre clulas. En algunos casos los genes no pueden expresarse debido a su insercin en regiones muy condensadas. En algunas ocasiones, la integracin puede provocar la muerte de la celula husped (insercin en un gen crucial, inactivndolo). Otra preocupacin es el riesgo de cncer: la integracin puede perturbar los patrones normales de expresin de genes que controlan la divisin o la proleferacion celular (activacio de un oncogen o un gen supresor de tumores o un gen implicado en la apoptosis). La terapia gnica exvivo ofrece al menos la oportunidad de seleccionar las clulas en las que la integracin ha tenido xito, gracias a que se amplifica a estas clulas

en cultivo y se comprueba si sus fenotipos presentan alguna evidencia obvia de transformacin neoplasica, como paso previo a su re-administracin al paciente. Genes no integrados: algunos sistemas de transferencia gnica estn diseados para insertar genes en clulas donde pueden quedar como elementos extra cromosmicos y tener una expresin elevada. Si las clulas estn dividindose activamente, este gen puede que no se segregue a las clulas hijas y la expresin a largo plazo sea un inconveniente. El resultado puede ser que el curar un trastorno gentico pueda ser remoto. Puede que en algunos casos no haya necesidad de que se mantenga la expresin del gen a largo plazo, ejemplo de esto; las terapias contra el cncer, una vez eliminado el tumor, el gen teraputico puede no ser necesario nunca ms. Mtodos de transferencia gnica: para alcanzar los efectos de esta terapia es necesario introducir la secuencia gnica de interes en la celula diana y conseguir su expresin. Para esto se necesita un adecuado sistema de transferencia y al mismo tiempo disponer de promotores adecuado para conseguir la mxima expresin del gen insertado en la celula. La introduccin de material gentico forneo se denomina transerencia gnica, transduccin o transfeccion. Los principales sistemas de transferencia son de dos tipos: Mtodos de transferencia gnica fsico-quimicos o no virales: fueron los primeros en ser desarrollados. En este mtodo el DNA forneo esta integrado a un plasmido que es una molecula extracromosomica que se puede mantener estable e independiente fuera del genoma de la celula husped. Ventajas: son sencillos de preparar permitiendo produccin de forma industrial, no tienen lmitaciones en cuanto al tamao del DNA que puden transferir, son poco toxicos y no son inmunogenicos. Desventajas: baja eficacia de transduccin de las clulas diana y que algunos de ellos solo pueden utilizarse in vitro. METODOS FISICO QUIMICOS DE TRANSFERENCIA GENICA Proceso que consiste en utilizar micro agujas para insertar Micro inyecciones sustancias a un nivel microscpico en el lmite de Precipitacin con fosfato clcico Electroporacin Bombardeo con microproyectiles
lo macroscpico dentro de una clula viva. el precipitado de fosfato de calcio y el ADN forman un complejo que se cree ayuda a que el ADN penetre en la clula. provocar un aumento significativo de la conductividad elctrica y la permeabilidad de la membrana celular mediante un campo elctrico aplicado externamente

Partculas de tungsteno u oro de 1 o 2 m de dimetro a velocidades que les permiten atravesar las paredes de las clulas

Inyeccin directa de DNA desnudo Conjugado ADN-proteina Conjugados ADN-adenovirus Liposomas

vescula esfrica con una membrana compuesta de una doble capa de fosfolpidos, que constan de partes hidrosolubles y liposolubles

Mediada por virus: en esta se sustituyen ciertos genes prescindibles del vector por aquellos genes que se desea introducir en las clulas diana, en la regin denominada de insercin, su tamao depende del tamao del virus y de los genes que puedan ser sustituidos y contituye un factor limitante a la hora de insertar las secuencias gnicas de interes.los virus constituyen la forma mas eficaz de transferir genes teraputicos y son los vectores mas utilizados en terapia gnica.

Adenovirus

Virus adenoasociados

Virus vaccinia Herpesvirus

Retrovirus

Vectores virales de transferencia genica Los adenovirus son una familia de virus que infectan tanto humanos como animales. Son virus no encapsulados de ADN bicatenario que pueden provocar infecciones en las vas respiratorias, conjuntivitis, cistitis hemorrgica y gastroenteritis grupo de virus ADN de vertebrados de la familiaParvoviridae y del gnero Dependovirus. El AAV es un virus muy simple y no autnomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. ( no asociado a ninguna enfermedad) virus vacuna es un virus bien conocido por su papel como vacuna en la erradicacin de la enfermedad de laviruela hacen alusin a la facultad de estos agentes infecciosos microscpicos de ser fcilmente contagiados y transmitidos de una persona a la otra y de recurrencia crnica. Son virus con envoltura que presentan un genoma de ARNmonocatenario de polaridad + y se replican de manera inusual a travs de una forma intermedia de ADN bicatenario

Vectores virales obtenidos por eliminacin de genes para la replicacin del virus y sustitucin por el gen teraputico, eso hace que el virus sea capaz de infectar la celula pero es incapaz de miltiplicarse en ellas. Un virus puede modificarse por diferentes tcnicas dando como producto un vector recombinante relativamente seguro, siempre y cuando se sustituyan los genes de virulencia y replicacin por los teraputicos, manteniendo capacidad infectiva intacta. Los vectores virales son los mas eficaces para transferir clulas porque son capaces de infectar una elevada eficacia de transfeccion incluso del 100%. Las limitaciones en el empleo de virus: puede producirse una transferencia involuntaria del virus nativo patgeno, o la activacin de un virus patgeno o un oncogen por la recombinacin al insertarse en un gen forneo. En la terapia gnica in vivo es la reaccin in munitaria del organismo receptor pudiento eliminar el material gentico atraves de la muerte de las clulas genticamente modificadas por esto se intenta contrarrestar la reaccin inmune eliminando el mayor numero posible de genes vricos del vector con el fin de obtener una expresin mas estable. MARCAJE CELULAR Consiste en introducir junto con el gen teraputico genes que permitan identificar laas clulas en donde se ha incorporado el transgen. Un riesgo potencial de la terapia gnica es la posibilidad de aparicin de complicaciones que requieran la suspensin del tratamiento por esto se desarrollo una alternativa consistente en el doble marcaje de la celula con genes diferentes a la secuencia de interes, quiere decir que la celula marcada lleva un gen forneo que nos sirve de marcador que permiten las clulas que han tomado el DNA exgeno y el otro gen que permitir hacer una seleccin negativa in vivo de las clulas marcada, eliminndose asi las clulas modificadas debido a la toxicidad del tratamiento y otras complicaciones. TERAPIA ANTISENTIDO Antisentido se aplica a secuencias cortas de DNA o RNA diseadas para ser complementarias de secuencias gnicas especificas interfiriendo en el flujo de informacin gentica. Los agentes teraputicos antisentido inhiben la sistesis proteica al interferir en los procesos de transcripcin o traduccin. Existen tres clases:

Secuancias antisentido: derivan de acidos nucleicos que se hibridan con heras de RNAm citosolicas ( hebras con sentido: poradoras de la informacin necesaria para la sntesis de protenas en los ribosomas) o RNAhn (precursor nuclear del RNAm ), por complementariedad, estas secuencias antisentido son cortas por lo que se denominan oligonucletidos Secuencias antigen: una forma similar a las secuencias antisentido, las antigen se hibridan al DNA de doble hebra que esta en el nucleo, creando secuencias de triple hlice que bloquean la transcripcin del gen correspondiente o interfiriendo en la unin de protenas a secuencias especificas del DNA. Ribozimas: RNA antisentido catalizan la hidrlisis de secuencias especificas de RNAm, estos se denominan ribozimas y actan sobre sustratos naturales concretos, pero en terapia antisentido son diseados para reconocer especficamente diversas secuancias de RNA diana. Hay dos enfoques en terapia antisentido: 1. Administracin directa de oligonucletidos: microinyeccion directa , formacin de complejos con lpidos cargados positivamente, incorporacin en el interior de liposomas y electroporacion. 2. Expresin de oligonucletidos tras haber transfeccion de una celula: adenovirus, retrovirus (el vector se suministra al paciente cuyas clulas son encargadas de generarl el oligonucletido antisentido. Ventajas y desventajas de expresin de oligonucletidos en administracin directa: 1. Produccin directa a nivel nuclear permite mecanismos adicionales ya que el oligonucletido puede interferir en transporte del RNAm al citoplasma, puede inducir actividad nuclear tipo nucleasa o interferir en el proceso de transcripcin de la hebra de DNA complementario. 2. RNA antisentido expresadosn son de mayor lontigud ofreciendo mas posibilidades de interaccion con el RNAm diana, aunque tambin puede favorecer formacin de interacciones no especificas y facilitar formacin de estructuras secundarias que interfieren con el proceso de hibridacin. TERAPIA GENICA DE LAS ENFERMEDADES MONOGENICAS La terapia gnica fue concebida para tratar enfermedades genticas causadas por mutaciones de un solo gen (monogenicas), de las que se conocen 4.000 , las enfermedades hereditarias son de diversas ndoles en donde las que un gen defectuoso determina que no se sintetice una proteeina o que se elabore anormalmente causando diversas manifestaciones clnicas, segn la funcin que ejersa la protena en la celula. Por esto los cuadro varian de leve, que no necesitan tratamiendo (daltonismo) hasta graves (fibrosis qustica). Para estas enfermedades se han desarrollado tratamientos basados en la restitucin de la protena defectuosa, sin embargo estos tratamentos solo tienen efectividad parcial y pueden conllevar graves complicaciones, en pocas enfermedades genticas es factible suministrar la protena de manera farmaceutic, dada su naturaleza labil y compleja, y la necesidad de hacerla llegar a un citio subcelular especifico