UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAU CENTRO DE CINCIAS DA SADE DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E FARMACOLOGIA DISCIPLINA: Bioqumica Bsica PROFESSOR: Fernando Acio

de Amorim Carvalho

DETERMINAO QUALITATIVA DOS AMINOCIDOS

As protenas so substncias orgnicas de alto peso molecular formadas por um grande nmero de aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. As clulas de todos os organismos vivos contm uma variedade de protenas com funes diferentes. As membranas que circundam as clulas contm protenas, as reaes metablicas que se do no interior das clulas so catalisadas por enzimas que so protenas. A reproduo das clulas e a transmisso das caractersticas hereditrias dependem das protenas. Certos hormnios so protenas, e os anticorpos que defendem o corpo so protenas. Quando as protenas so hidrolisadas, elas so convertidas numa mistura de aminocidos. So conhecidos cerca de 20 aminocidos obtidos a partir de protenas. O propsito das experincias descritas a determinao qualitativa de aminocidos bem como a pesquisa da ligao peptdica. A molcula protica to complexa que s vezes difcil interpretar o seu comportamento qumico. As protenas de um modo geral refletiro as propriedades qumicas de seus aminocidos. Muitas reaes coloridas das protenas dependem da presena de um determinado aminocido. 1 - REAO DO BIURETO As protenas e seus produtos de hidrlise que contenham mais de duas ligaes peptdicas so reagentes positivos para a Reao do Biureto. O Biureto formado da decomposio da uria a uma temperatura de 180C.

As solues alcalinas com biureto apresentam uma colorao violeta na presena de sulfato de cobre (CuSO4). Isso ocorre pela formao de um complexo entre o on Cu+2 e os tomos de nitrognio da molcula do biureto.
R H O H O H N R N R N N Cu
2+

R N H O N H O H

As ligaes presentes na molcula do biureto so semelhantes s ligaes peptdicas que unem os aminocidos na formao dos peptdeos e protenas.

REAGENTE DE BIURETO Dissolva 1,5g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e 6,0g de tartarato de sdio e potssio (KNaC4H4O6.4H2O) em 500 mL de gua destilada. Adicione, sob agitao constante, 300 mL de soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 10%. Complete o volume para 1L com gua destilada e guarde o reagente em frasco mbar. Conserve por tempo indefinido. TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Reagente de biureto; ii. Soluo de ovoalbumina 2%; iii. Soluo de gelatina 1%; iv. gua destilada. b. Vidraria: i. 3 tubos de ensaio; ii. 4 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Numere os tubos de ensaio; b. Prepare os tubos com as seguintes solues: i. Tubo 1 com 2 mL de soluo de ovoalbumina 2%; ii. Tubo 2 com 2 mL de gua destilada; iii. Tubo 3 com 2 mL de soluo de gelatina 1%; c. Adicione 1 mL de reagente de biureto em cada tubo; d. Agite os tubos; e. Observe e anote os resultados.

2 - REAO DE NINHIDRINA Aminocidos que possuem um grupo amino livre aquecidos em soluo com excesso de ninhidrina formam um composto chamado Prpura de Rhemann. Essa reao pode ser utilizada para a deteco de peptdeos e protenas que apresentam essas caractersticas, aminas primrias e amnia. Nas condies apropriadas, a intensidade da cor violeta produzida relacionada concentrao das espcies presentes. A prolina, que um iminocido, forma um composto amarelo.

TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Soluo aquosa de ninhidrina [C6H4COCO.C(OH)2] 0,1%; ii. Soluo de ovoalbumina 2%. b. Vidraria: i. 1 tubo de ensaio; ii. 2 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Preparar o tubo com as seguintes solues: i. 1 mL de soluo de ovoalbumina 2%; b. Adicione 10 gotas da soluo de ninhidrina 1 %; c. Agite o tubo; d. Aquea em banho maria durante 2 minutos; e. Observe e anote os resultados. 3 - PRECIPITAO COM SAIS DE METAIS Os ctions de metais como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolveis de protenas pela formao de sais insolveis de metal com as protenas negativamente carregadas, forma em que se encontram em meio alcalino. Essa precipitao mais intensa quando o pH est acima do ponto isoeltrico (pI) porque nessa circunstncia, a carga total sobre a protena negativa, o que favorece a interao com os ctions metlicos. Pode ocorrer a ressolubilizao se o pH for corrigido.

O O
2 R

R O
-

O
+
Hg

NH3
+ HgCl2 2NaOH

NH3

O R NH3
+

+ 2NaCl + 2H2O

Protena

Cloreto de Mercrio

Sal Insolvel do metal

Cloreto de sdio

O
O

O
2 R

H3C

R
O O Pb
(II)

O
+
Pb
(II)

O
+

NH3
2NaOH

NH3

O R NH3
Sal Insolvel do metal

+ 2CH3COONa + 2H2O

H3C O

O
+

Protena

Acetato de Chumbo

Acetato de sdio

TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Soluo de cloreto de mercrio (HgCl2) 5%; ii. Soluo de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb.3H2O] 10%; iii. Soluo de ovoalbumina 2%. b. Vidraria: i. 2 tubos de ensaio; ii. 3 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Numere os tubos de ensaio; b. Prepare os tubos com as seguintes solues: i. 2 mL de soluo de ovoalbumina 2%; c. Adicione ao primeiro tubo 7 gotas de HgCl2 5%; d. Adicione ao segundo tubo 5 gotas de (CH3COO)2Pb.3H2O 10%; e. Agite levemente; f. Observe e anote os resultados. 4 - PRECIPITAO PELOS CIDOS FORTES Estes cidos desnaturam as protenas transformando-as em metaprotenas insolveis. Essa precipitao mais intensa quando o pH est abaixo do ponto isoeltrico (pI). Isso porque, abaixo do pI, a carga lquida sobre a protena positiva, favorecendo a interao com os nions provenientes dos cidos fortes. Pode ocorrer a ressolubilizao se o pH for corrigido. PROTENA + HNO3 METAPROTENA TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Soluo de cido ntrico concentrado (HNO3); ii. Soluo de ovoalbumina 2%; iii. gua destilada. b. Vidraria: i. 1 tubo de ensaio; ii. 3 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Prepare o tubo com a seguinte soluo: i. 1 mL de soluo de ovoalbumina 2%; b. Adicione 3 mL de gua destilada; c. Incline o tubo e acrescente lentamente pelas paredes 0,5 mL de cido ntrico concentrado (HNO3), sem agitar; d. Observe e anote os resultados.

5 - REAO XANTOPROTEICA O benzeno reage lentamente com o cido ntrico (HNO 3) concentrado formando o nitrobenzeno. Essa reao pode ser acelerada por aquecimento tornando a colorao da reao amarela. Essa reao tambm ocorre com aminocidos que possuam em suas cadeias laterais anis benznicos, que ocorre com a tirosina e o triptofano, e em condies de nitrao mais fortes, ocorre tambm para a fenilalanina. Se a reao for mantida em meio bsico, a colorao ser vermelho alaranjada.

O O HO NH3
Tirosina (Tyr)
+ -H2O

O O HO O
+

+ HNO3

NH3 N
+

Nitroderivado vermelho NaOH alaranjado

Nitroderivado amarelo

O O NH NH3
+ -H2O

O O NH O
NaOH

+ HNO3

NH3

Nitroderivado vermelho alaranjado intenso

Triptofano (Trp)

O
Nitroderivado amarelo intenso

TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Soluo de cido ntrico concentrado (HNO3); ii. Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 2N; iii. Soluo de ovoalbumina 2%. b. Vidraria: i. 1 tubo de ensaio; ii. 3 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Prepare o tubo com a seguinte soluo: i. 1 mL de soluo de ovoalbumina 2%; b. Acrescente 10 gotas de cido ntrico concentrado (HNO 3); c. Aquea o tubo em banho maria; d. Adicione 4 mL de soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 2N; e. Observe e anote os resultados. 6 - REAO DE MILLON O grupamento hidroxifenil da tirosina sofre uma nitrao pelo cido ntrico presente na soluo. Aps a nitrao, esse produto reage com os ons mercrio na soluo, formando o fenolato de mercrio que forma uma soluo ou precipitado vermelho, resultados positivos. Como a tirosina o nico aminocido a apresentar um grupo fenlico, esse teste se torna especfico para verificao da presena ou ausncia desse aminocido. A reao no deve ser feita em meio alcalino forte devido precipitao do mercrio sob a forma de xido.

O
2

O O +Hg++
HNO3

HO

NH3
Tirosina (Tyr)

Hg

H C 2 3 NH3
+

Fenolato de mercrio

Alanina (Ala)

REATIVO DE MILLON Adicione 40 mL de cido ntrico (HNO3) concentrado frio em 20 g de mercrio (Hg0), dissolvendo por aquecimento. Dilua com gua destilada 2 vezes em volume. Deixe decantar por 24 horas e use o sobrenadante. O reativo de Millon pode ser armazenado por longos perodos em geladeira. TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Soluo do reagente de Millon; ii. Soluo de gelatina 1%; iii. Soluo de ovoalbumina 2%. b. Vidraria: i. 2 tubos de ensaio; ii. 3 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Numere os tubos de ensaio; b. Prepare os tubos com as seguintes solues: i. 1 mL de soluo de ovoalbumina 2%; ii. 1 mL de soluo de gelatina 1%; c. Adicione aos dois tubos 5 gotas do reativo de Millon; d. Agite levemente; e. Observe e anote os resultados; f. Aquea em banho maria o tubo com a soluo de ovoalbumina com reativo de Millon; g. Observe e anote os resultados.

7 REAO DO GRUPO SULFIDRILA Dos aminocidos que apresentam enxofre em sua constituio apenas a cistena e a cistina so capazes de liber-lo quente e no meio alcalino. O enxofre liberado forma sulfeto de sdio que reage com o acetato de chumbo, formando o sulfeto de chumbo precipita na cor preta ou castanha. O enxofre da metionina no liberado em meio bsico.

O HS NH3
Cistena (Cys) O H3C O O Pb O H3C O Sulfeto de sdio Acetato de Chumbo Sulfeto de chumbo
(II)

O O
-

2NaOH

Na2S + H2O + HO
Sulfeto de sdio

O NH3
+

Serina (Ser)

Na2S +

PbS

+ 2
H3C O Na

Acetato de sdio

TCNICA 1) Material: a. Solues e reagentes: i. Chumao de cabelo; ii. Soluo de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5%;

iii. Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 50%. b. Vidraria: i. 1 tubo de ensaio; ii. 2 pipetas de 5 mL. 2) Procedimento: a. Coloque o chumao de cabelo no tubo de ensaio; b. Adicione 5 gotas da soluo de acetato de chumbo [(CH 3COO)2Pb] 5%; c. Acrescente 2 mL da soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 50%; d. Ferva durante 5 minutos; e. Observe e anote os resultados.