Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Carrera de Qumica Ambiental

Informe del Laboratorio Curso Bioqumica Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad y sobre la estabilidad de la fosfatasa cida de germen de trigo

Autores: Camila Donoso Silva (donosito86@hotmail.com) Rodrigo Manzano Reyes (rv.manazano@gmail.com) Francisco Palacios Moyano (fpmoyano@gmail.com) Fecha de Realizacin: 02 de Julio del 2009 Fecha de Entrega: 09 de Julio del 2009

1. Efecto de la temperatura sobre la actividad y sobre la estabilidad de la fosfatasa cida de grmen de trigo: En las tablas N1, 2, 3 y 4 se resumen los diferentes valores de absorbancia, la concentracin de producto, las velocidades de reaccin y los porcentajes de inactivacin de la enzima a diferentes temperaturas (14,5; 24; 37 y 45C) y a 2 diferentes tiempos (5 y 10 minutos) Tabla 1. Datos obtenidos a 14,5C
Tiempo incubacin (min) 5 10 Absorbancia 0,100 0,140 [producto] nmol 33,49 47,09 Velocidad de reaccin nmol/min nmol/mL 6,69 22,32 4,71 15,69 % inactivacin 64 64,5

Tabla 2. Datos obtenidos a 24C

Tiempo incubacin (min) 5 10 Absorbancia

0,107 0,179

[producto] nmol 35,87 60,36

Velocidad de reaccin nmol/min nmol/mL

7,17 6,04

23,9 20,1

% inactivacin 61,4 54,5

Tabla 3. Datos obtenidos a 37C

Tiempo incubacin (min) 5 10 Absorbanci a [producto] nmol 93,01 132,81 Velocidad de reaccin nmol/min nmol/mL % inactivacin 0 0

0,275 0,392

18,60 13,28

62,0 44,27

Tabla 4. Datos obtenidos a 45C

Tiempo incubacin (min) 5 10 Absorbanci a [producto] nmol 80,08 113,08 Velocidad de reaccin nmol/min nmol/mL % inactivacin 13,9 14,85

0,237 0,334

16,01 11,31

53,4 37,7

A continuacin el grfico N1 presenta la variacin de la velocidad en nmol/min con respecto a las 4 temperaturas estudiadas y a los 2 tiempos de incubacin medidos:

20 18

5 minutos 10 minutos

Velocidad de reaccin (nmol/min)

16 14 12 10 8 6 4 15 20 25 30 35 40 45 50

Temperatura (C)

Figura 1. Grfico de velocidad (nmol/min) en funcin de la temperatura

El grfico N2, que se muestra a continuacin, presenta la variacin de la velocidad de reaccin (en nmol/min) con respecto a los tiempos de preincubacin, mejor llamados de incubacin, para cada una de las temperaturas estudiadas:

20 18

14,5C 24C 37C 45C

velocidad de reaccin (nmol/min)

16 14 12 10 8 6 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo de preincubacin (min)

Figura 2. Grfico de velocidad (nmol/min) en funcin del tiempo de incubacin

Del grfico anterior observamos que no tiene mucho sentido estudiar la velocidad con respecto al tiempo de incubacin en este caso, pues slo se estudiaron a 2 tiempos diferentes y no se observa una clara tendencia, slo una recta con un determinado comportamiento, pero que puede no ser representativo de los tiempos intermedios.

El grfico N3 que se presenta a continuacin, presenta el porcentaje de inactivacin a los 2 tiempos de incubacin estudiados, 5 y 10 minutos.

70 60 50

14,5C 24C 37C 45C

% de inactivacin

40 30 20 10 0 5 6 7 8 9 10

Tiempo de preincubacin (min)

Figura 3. Grfico de % de inactivacin en funcin del tiempo para todas las temperaturas

En este grfico, al igual que en el anterior, observamos slo una tendencia lineal de la inactivacin, pero al ser graficado slo con 2 valores de tiempo, no sabemos si resulta ser representativo totalmente para el resto de los tiempos de incubacin.

El grfico N4 que se muestra a continuacin, presenta el porcentaje de inactivacin en funcin de la temperatura a los 2 tiempos de incubacin estudiados:

70 60 50

5 minutos 10 minutos

% de inactivacin

40 30 20 10 0 15 20 25 30 35 40 45 50

Temperatura (C)

Figura 4. Grfico de % de inactivacin en funcin de la temperatura a distintos tiempos.

Conclusin:

Se observa que a temperaturas altas se desnaturaliza la enzima, disminuyendo la velocidad de reaccin. Se observa una temperatura ptima determinada experimentalmente, (37C) la cual depende del tiempo de incubacin, la fuerza inica, pH, y de la concentracin de enzima y sustrato. Se observa una temperatura ptima (aprox. 37C) al representar velocidad de reaccin versus temperatura reflejada en un peak. Esto se produce por que las enzimas se desnaturalizan por la accin del calor y se inactivan cuando la temperatura sobrepasa cierto punto en este caso 37C La temperatura ptima es el resultado de 2 procesos:
1. 2.

El incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura. El incremento en la velocidad de desnaturalizacin trmica de la enzima al sobrepasar una temperatura crtica.

A los 5 minutos se observa una mayor actividad enzimtica en todas las temperaturas comparados con los 10 minutos Se observa el menor porcentaje de inactividad en las cercanas de la temperatura optima, donde la actividad enzimtica es mayor

La mayor inactividad se presenta a la menor temperatura.

2. Efecto del pH sobre la actividad y sobre la estabilidad de la fosfatasa cida de grmen de trigo: La tabla que se presenta a continuacin rene la absorbancia la concentracin de producto, la velocidad de reaccin, la actividad enzimtica y el porcentaje de inactivacin para los ensayos realizados a diferentes pH y medidos a 5 minutos de incubacin. Tabla 5. Valores de absorbancia, producto y velocidad de reaccin asociados a reaccin hasta los 5 minutos Actividad Porcentaje Producto Velocidad pH Absorbancia Enzimtica de (nmoles) reaccion (nmoles/min/mL) inactivacin 3 0,048 15,79 3,162 10,54 78,94 4,5 0,119 39,95 7,992 25,64 46,72 5 0,107 35,87 5,976 19,92 52,16 6 0,088 29,40 5,880 19,60 60,79 7 0,080 26,68 5,336 17,79 64,42 A partir de esta tabla, se construyeron los dos siguientes grficos:

26 24

Actividad enzimtica (U/mL)

22 20 18 16 14 12 10 3 4 5 6 7

pH

Grfico N5: Actividad enzimtica versus pH

80 75

Porcentaje de inhibicin (%)

70 65 60 55 50 45 3 4 5 6 7

pH

Grfico N6: Porcentaje de inhibicin en funcin del pH

La tabla que se presenta a continuacin rene la absorbancia la concentracin de producto, la velocidad de reaccin, la actividad enzimtica y el porcentaje de inactivacin para los ensayos realizados a diferentes pH y medidos a 10 minutos de incubacin. Tabla 6. Valores de absorbancia, producto y velocidad de reaccin asociados a reaccin hasta los 10 minutos Actividad Porcentaje Producto Velocidad pH Absorbancia Enzimtica de (nmoles) reaccin (nmoles/min/mL) inhibicin 3 0,083 27,70 2,772 9,240 63,06 4,5 0,222 74,98* 7,517 25,06 0 5 0,179 60,36 6,036 20,12 19,50 6 0,155 52,19 5,223 17,41 69,61 7 0,152 51,17 5,118 17,06 68,24 *Al ser el mximo valor de absorbancia, se consider como el ptimo para calcular los porcentajes de inhibicin (porcentajes de inhibicin relativos) De ella se desprenden los siguientes grficos:

26 24

Actividad Enzimtica (U/mL)

22 20 18 16 14 12 10 8 3 4 5 6 7

pH

Grfico N7:Actividad enzimtico versus pH

80 70 60

Porcentaje de inhibicin

50 40 30 20 10 0 -10 3 4 5 6 7

pH

Grfico N8: Variacin de la inhibicin (%) en relacin al pH

Conclusin:

Gracias a los datos registrados para distintos pH y a tiempos de reaccin distintos, se concluye que el pH ptimo se encuentra muy cercano al 4,5. Esto, dado que a ese pH se encuentra la absorbancia ms alta, lo que se traduce en un mayor rendimiento y por ende, en una inhibicin mnima. Debido a sus propiedades inicas, cada enzima se caracteriza por poseer una actividad especfica, diferente a la de cualquier otra enzima, a un cierto pH. Como se demostr, el pH es un factor que ejerce una gran influencia sobre la cintica enzimtica. Debido a este carcter inico mltiple, las enzimas deben estar en el estado inico apropiado para mantener en forma adecuada conformacin de su sitio activo, de manera que se logre realizar de la manera ms expedita posible la reaccin.