TCNICAS DE CARACTERIZACIN DEL COLGENO

Por ltimo se encuentran las pruebas de caracterizacin. Primero se asegura que el producto obtenido es colgeno tipo I comparndolo con patrones de alto peso molecular mediante la tcnica de electroforesis, que se define como el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. La movilidad de las partculas est determinada de forma proporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molcula y de forma inversamente proporcional a la friccin de la molcula; esta ltima depende de la forma y el tamao de la misma.

Figura1-6: Gel de electroforesis (SDS-Poliacrilamida) con muestras de colgeno de diferentes fuentes. El patrn de SDS-PAGE muestra que el colgeno consiste en cadenas , su regulador de voltaje (cadena ), y pequeas cantidades de un componente . Todos los colgenos estn compuestos por lo menos de dos diferentes cadenas , 1 y 2, y la densidad de 1 es mayor que la de 2. Se puede observar que los pesos moleculares de las subunidades (cadenas 1, 2 y ) del colgeno de piel de carpa son mayores que los del colgeno extrado de piel de becerro. Una gran cantidad de cadenas pudo verse en todos los colgenos, esto significa que los colgenos son ricos en inter e intra-enlaces moleculares (Zhang et al. 2009).

Igualmente es necesario cuantificar el colgeno presente en la muestra por medio de la tcnica colorimtrica de cuantificacin del % de hidroxiprolina, (aminocido caracterstico de los colgenos), que dependiendo de la fuente tiene un factor para determinar el % de colgeno. Este clculo permite realizar el balance de materia e indicar el rendimiento del proceso. El colgeno es una protena termo-inestable, la cual puede desnaturalizarse a temperatura ambiente. En general, el colgeno de pescado puede variar mucho en su composicin de aminocidos, especialmente los niveles de aminocidos (prolina e hidroxiprolina) entre especies de pescados y la cantidad de hidroxiprolina depende del medio ambiente en el cual habita el pescado y afecta la estabilidad trmica del colgeno(Muyonga et al. 2004). Es por esto que es necesario determinar la temperatura de desnaturalizacin del colgeno as como controlar la temperatura durante todas las etapas del proceso. La temperatura de desnaturalizacin puede determinarse mediante estudios reolgicos o de calorimetra diferencial de barrido (DSC). La curva de desnaturalizacin trmica puede obtenerse graficando el cambio fraccional de la viscosidad con la temperatura. La temperatura de desnaturalizacin, Td, es determinada como la temperatura a la cual el cambio de viscosidad es del 50%. En el caso del DSC, se grafica el cambio del flujo de calor con la temperatura y la Td es la temperatura mxima o mnima. PROCESO DE EXTRACCIN DEL COLAGENO El proceso de extraccin cuenta con varias etapas, la primera comnmente es la eliminacin de la protena no colgenosa de la piel utilizando hidrxido de sodio, el cual hidroliza las protenas permitiendo su eliminacin con lavados posteriores. El control de esta etapa debe ser cuidadoso debido a que el hidrxido de sodio puede hidrolizar el colgeno presente en las pieles. Para eliminar la grasa presente en la membrana es posible emplear detergentes pero debido a que estos dejan residuos qumicos en el producto, su difcil recuperacin y altos costos en los ltimos estudios se han usado alcoholes de bajo peso molecular, estos alcoholes no dejan residuos y pueden ser recuperados fcilmente gracias a su baja presin de vapor.

En la etapa de solubilizacin del colgeno es posible utilizar acido actico o pepsina en medio cido, la seleccin entre uno y otro debe tener en cuenta el uso final de la protena extrada, ya que mientras el cido actico solubiliza la protena la pepsina la hidroliza para que siendo una molcula ms pequea se solubilice. Es por esto que es ampliamente utilizado el cido actico en lugar de la pepsina en las investigaciones. Por ltimo se encuentra el proceso de purificacin que tiene como primera etapa la precipitacin con cloruro de sodio para separar la protena de la anterior solucin cida, seguida de la etapa de centrifugacin y re-solubilizacin para finalmente dializar y eliminar los iones cloruro y sodio libres solubles durante la precipitacin La temperatura de trabajo es 4C, con el fin de evitar al mximo la desnaturalizacin de la protena. Se observa que aunque el proceso de extraccin a nivel de laboratorio consta de etapas relativamente sencillas, el estudio de cada etapa requiere un anlisis cuidadoso de cada de una las variables que intervienen en ellas. Es por esto que estudiar este proceso permitir aprovechar la investigacin para proponer un proceso de extraccin de colgeno de la cscara de huevo en la U.NEF.M.