Studio teorico della diffusione del calcio nelle cellule degli epiteli sensoriali dellorecchio interno

Tesina di Mario Bortolozzi Corso di Fondamenti di Biofisica, prof. Renato Nobili Dip. Fisica, Universit di Padova A.A.2003/2004

Argomento della tesina

Gli ioni calcio svolgono un ruolo essenziale nei complessi meccanismi di trasduzione del segnale acustico. Per meglio comprendere tale funzione si intende sviluppare un modello teorico semplificato della diffusione del calcio con laiuto della simulazione al calcolatore. Scopo di questa tesina sar anche quello di introdurre a tecniche di simulazione delle dinamiche del calcio pi avanzate utilizzate nel lavoro di tesi di Mario Bortolozzi. Una breve sintesi degli argomenti trattati potr giovare a chiarire il filo logico del discorso: - Descrizione dell apparato uditivo: dalle onde sonore alle cellule ciliate.
- Il ruolo del calcio nelle cellule ciliate ed esperimenti

Ca

2+

di Fabio Mammano.

3 -Modello della diffusione del calcio allinterno della cellula ciliata. Le equazioni di diffusione. -Analisi matematica delle equazioni di diffusione e random walk. -Utilizzo di Matlab per la simulazione della diffusione del calcio.
-Risultati ulteriori gi ottenuti nel lavoro di tesi di laurea.

Fig 1: patch clamp di cellula ciliata in un esperimento di Fabio Mammano ( 2001 ).

Lapparato uditivo.
Lapparato uditivo dell Uomo funzionalmente diviso in tre parti: l orecchio esterno (E) con il padiglione e il meato uditivo, lorecchio medio (M) con il timpano, gli ossicini e la staffa, e lorecchio interno (I) con la coclea, i canali semicircolari, lotricolo e il sacculo (fig.2).

Fig. 2: nellorecchio interno sono presenti le cellule ciliate ( la sezione di una di queste cellule mostrata nel disegno di destra ). Nota: unesauriente trattazione dellapparato uditivo umano reperibile sul sito del prof. Renato Nobili: http://www.pd.infn.it/~rnobili

5 Lapparato uditivo dellUomo differisce sensibilmente da quello degli uccelli, dei rettili o degli anfibi. Tuttavia i complessi meccanismi di trasduzione dellonda sonora hanno in comune in tutti i vertebrati un particolare tipo di cellula preposta (quasi sempre) alla trasduzione di stimoli meccanici in impulsi nervosi: la cellula ciliata. Essa in grado di trasformare la deflessione delle sue stereocilia (situate sullapice) in impulsi nervosi che vengono trasmessi al cervello a partire dalle sinapsi che la cingono alla base.
Fig.3 : stereocilia di cellula ciliata ( hair cell ) di rana a sinistra e cellula intera isolata a destra (Lumpkin E. e Hudspeth A.J., 1998 J. of Neuroscience ) .

Il ruolo del calcio

Nella maggior parte delle cellule eucariote esiste un forte gradiente elettrochimico fra linterno e lesterno della membrana plasmatica. Nonostante tale gradiente tenda a richiamare ioni positivi allinterno della cellula, la concentrazione extracellulare di calcio circa diecimila volte pi grande di quella intracellulare (nel cytosol). Infatti la cellula tende velocemente ad eliminare il calcio in eccesso espellendolo tramite le pompe sulla membrana plasmatica o stipandolo in depositi intracellulari, principalmente il reticolo endoplasmatico/ sarcoplasmatico (ER/SR), il nucleo e i mitocondri. Nel caso della cellula ciliata tali meccanismi di rapida sparizione del calcio fanno seguito alla sua rapida entrata nel liquido intracellulare dovuta alla depolarizzazione della membrana. Lentrata del calcio ha lo scopo di inviare informazioni ai vari distretti della cellula innescando una complessa serie di reazioni chimiche, tra cui la trasduzione del segnale meccanico stereociliare in impulso nervoso ( attraverso il rilascio di neurotrasmettitore che innesca un potenziale dazione a partire dalle sinapsi alla base della cellula ).

7 Le tecniche pi avanzate di studio della diffusione del calcio utilizzano dei marcatori fluorescenti (es.:FURA-2) che, legati a tale ione, mutano il loro spettro di emissione caratteristico permettendo di rilevare indirettamente (con tecniche di microscopia ed imaging computerizzata ) la concentrazione di calcio nei vari punti dellimmagine. Il prof. Fabio Mammano studia con successo da molti anni le cellule ciliate con tali tecniche di microscopia. Nella prima serie di immagini in basso (fig.4) possiamo vedere una cellula ciliata arpionata con la tecnica del patch clamp, vista otticamente (A), in fluorescenza (B) e dopo lelaborazione al computer. Il colore rosso corrisponde alla massima concentrazione di calcio, quello blu alla minima.
Fig.4 : F.Mammano, 2001.

8 Nella figura 6 a lato possiamo vedere la diffusione del calcio a seguito di un impulso depolarizzante di 420 ms (A e B) e di 1s (C e D). Il calcio entra dagli hotspot, ristretti agglomerati di canali concentrati soprattutto alla base della cellula. Si formano cos veri e propri fronti donda di diffusione chiaramente visibili dalle immagini in falsi colori elaborate al computer.
Fig.5: Il fotogrammi qua a lato in basso si riferiscono ad un filmato realizzato dal gruppo del prof. Mammano in cui si osserva (in falsi colori ) la diffusione del calcio. Il fenomeno ha una durata reale di circa due secondi. Il filmato scaricabile in allegato ( 16,4 Mb, file 030414_a07 ).

Fig.6: Correnti di calcio in seguito a depolarizzazione della cellula da -70 a -20 mV (A e C ) e rispettive diffusioni del calcio in scala di colori (B) ed evidenziando i fronti donda di concentrazione (D) ( F. Mammano, 2001).

Costruire un modello
La costruzione di modelli teorici nella ricerca scientifica necessita sempre di assunzioni e semplificazioni, ci a maggior ragione nei sistemi biologici, alcuni dei quali sono quanto di pi complesso lUomo conosca. Tuttavia un buon modello costituisce quasi sempre la guida verso ulteriori progressi nel campo sperimentale. Detto questo, costruire un modello per un sistema biologico, nel mio caso la diffusione del calcio nella cellula ciliata, necessita in linea di principio dei seguenti step: 1) Scelta degli elementi biologici del modello (specie ioniche e molecolari, reazioni chimiche, recettori, membrane, ecc.) in base alla loro importanza nel problema. 2) Descrizione matematica del modello (equazioni della diffusione e reazioni chimiche in particolare).

10 3) Scelta degli strumenti informatici per la costruzione del modello da simulare ( programmi gi scritti o creazione di un codice). 4) Scelta e ottimizzazione degli algoritmi di calcolo tramite anche opportune approssimazioni e semplificazioni. Nel nostro caso trascureremo le interazioni chimiche del calcio con le molecole di buffer endogeno (cio gi presente nel cytosol) ed esogeno (introdotto dallesterno, es. il FURA) e simuleremo la pura diffusione di tali molecole. La struttura della cellula verr semplificata con un box e le interazioni delle molecole con la membrana saranno viste come urti elastici. Si tratta naturalmente di un approccio estremamente semplificativo della reale situazione fisica, tuttavia si tratta un primo step utile a comprendere alcuni aspetti basilari del fenomeno della diffusione.

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La diffusione del calcio

La diffusione del calcio nel fluido intracellulare pu essere descritta tramite la legge del trasporto passivo di una sostanza in un mezzo omogeneo a temperatura costante. Tale trasporto rispecchia la tendenza del sistema a portarsi verso uno stato di equilibrio, cio quello a concentrazione uniforme. A causa del loro moto termico le molecole del soluto tenderanno a muoversi in continuazione urtandosi fra loro e soprattutto urtando le molecole dacqua. Questo caos termico far s che gli spostamenti delle molecole siano totalmente casuali (in assenza di campi di forza esterni) e che zone a concentrazione maggiore tendano ad invadere zone a concentrazione minore portandosi verso lequilibrio semplicemente per ragioni probabilistiche. Le due leggi di Fick descrivono efficacemente la diffusione in un mezzo continuo:

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1a legge di Fick
Sia C(x) la concentrazione di una sostanza, con x lasse lungo il quale si suppone (per semplicit) che vari la concentrazione. Adolf Fick stabil tramite argomentazioni teoriche ed esperimenti (1855) che il flusso attraverso un elemento di superficie ortogonale allasse X dipende solo dalla variazione locale di concentrazione:

dC ( x) J ( x) = D dx
D il coefficiente di diffusione della sostanza e dipende, per concentrazioni fisiologiche, dalle caratteristiche delle molecole del solvente e del soluto nonch dalla temperatura. D si misura solitamente in m 2 s 1 200. e, nel caso del calcio, pari a circa

13 La forma generale della prima legge di Fick sar dunque:

J ( x ) = D C ( x )

2a legge di Fick
La seconda legge di Fick si ricava dalla prima utilizzando lequazione di continuit, la quale consente di ricavare agevolmente la seguente espressione:

dJ ( x, t ) dC ( x, t ) = dx dt
avendo posto il segno meno per convenzione. Questultima relazione, combinata con la prima legge di Fick, permette di ottenere immediatamente la seconda legge di Fick:

dC d 2C = D 2 dt dx

14 In tre dimensioni la legge diventer:

C ( x , t ) = D C ( x , t ) t

Il moto browniano
La corretta interpretazione delle leggi della diffusione venne data allinizio del secolo scorso da Einstein e Smoluchowski indipendentemente. Lidea di base nacque dallinterpretazione del movimento delle molecole in un fluido derivante dagli studi sul moto Browniano. Infatti le particelle in sospensione in un liquido seguono traiettorie a zig-zag del tutto casuali, proprio come se fossero soggette a continui urti con le molecole del solvente. Il modello pi elementare di diffusione che sfrutta tale principio di random walk (ma detto anche drunkards walk) fu formulato da Smoluchowski e prevede lo spostamento in una dimensione delle molecole con 2 step di cammino equiprobabili a destra e sinistra.

15 Se al tempo zero tutte le molecole sono confinate omogeneamente su un piano (di coordinata x=0) e successivamente lasciate diffondere otteniamo con buona approssimazione da tale modello la stessa espressione della concentrazione che si pu ottenere dalle leggi di Fick:

N C ( x, t ) = e 2 D t

x2 4 Dt

cio una gaussiana di varianza 2Dt, con D il coefficiente di diffusione ed N il numero di molecole ( viene solitamente omesso un coefficiente necessario a dimensionare correttamente lespressione ). Nel caso di diffusione a partire da una sorgente puntiforme avremmo ottenuto (in coordinate radiali):

C (r , t ) =

(4 D t )

3 2

r2 4 Dt

16 Una versione pi precisa del random walk utilizza proprio questa formula per stabilire la probabilit che una molecola si sposti di una distanza r dopo un tempo t. Infatti la gaussiana della concentrazione equivale alla gaussiana probabilistica se normalizzata a uno. Possiamo vedere qui di seguito linizio di una simulazione con Matlab della diffusione di 1000 molecole a partire da un hotspot di calcio e una distribuzione omogenea di buffer e calcio bufferato. Il codice (pannello_calcio.m/fig e calcio.m) scaricabile in allegato al presente file PDF.
Fig.7.

17 Per effettuare una simulazione necessario dapprima lanciare il file pannello_calcio.m Il risultato della simulazione dopo 600 step di 10 microsecondi riportato in fig.8 insieme al grafico del numero di molecole (in funzione del tempo) presenti nella ROI (region of interest) disegnata in blu allinterno del box.

Fig.8.

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Matlab
Che cos Matlab? Matlab un software commerciale che utilizza un linguaggio ad alto rendimento per la computazione tecnica. Esso integra il calcolo, la visualizzazione e la programmazione in un ambiente di facile impiego in cui i problemi e le soluzioni sono espressi in notazione matematica familiare. Matlab stato studiato in particolare per la risoluzione di problemi tecnici con formulazioni vettoriali e matriciali, attraverso algoritmi molto pi semplici e snelli rispetto a quelli che sarebbero necessari in un programma in linguaggi scalari quali C o il Fortran. Il suo nome corrisponde appunto a Matrix Laboratory. I toolboxes sono collezioni di funzioni Matlab (M-files) per la risoluzione rapida ed efficace di problemi specifici inerenti ai vari settori scientifici. La costruzione di un modello completo di diffusione del calcio nella cellula ciliata prevede lutilizzo di formule matematiche (diffusione e reazioni chimiche in particolare) che possono essere integrate nel codice di simulazione in modo da sfruttare al meglio la velocit di Matlab nel calcolo matriciale e le sue funzioni altamente ottimizzate, in particolare quelle insiemistiche.

19 La scelta e lottimizzazione degli algoritmi di calcolo il punto chiave in una simulazione. Lottimizzazione dipende soprattutto dalla capacit del programmatore di far eseguire al computer il minor numero di calcoli per generare loutput del problema. Fatto ci sar necessario calibrare le variabili in gioco (numero di molecole, complessit della struttura delle superfici cellulari, ecc.) in modo tale da ottenere il risultato della simulazione in tempi ragionevoli ( giorni o settimane ). Una ricostruzione molto accurata ma estremamente efficiente in termini di mole di calcoli della membrana plasmatica della cellula ciliata stata fatta nel lavoro di tesi dellAutore utilizzando unimmagine di questultima per costruire, a partire dal profilo 2D della cellula una struttura 3D molto simile a quella reale.
Figg.9-10 : Immagine in fluorescenza di una cellula ciliata isolata da un canale semicircolare di rana (Mammano, 2003) e ricostruzione del suo profilo in 2D.

20 Si ottiene cos una struttura a dischi estremamente fedele alla forma reale della cellula , estremamente rapida da realizzare ed efficiente nei calcoli di interazione con le molecole (fig.11). Lo stesso risultato ottenuto con una tipica struttura a poligoni rallenterebbe notevolmente la simulazione rendendo preferibile lutilizzo di forme semplificate (tipicamente un box) ma non abbastanza realistiche.
Fig.11.

21 Il rendering grafico con Matlab molto pratico e d ottimi risultati. Anche questa animazione, insieme alle successive, scaricabile in allegato al presente file PDF (file hair_cell_movie.avi).
Fig.12.

22 Una volta ricostruita la superficie cellulare esterna ed interna (quella del nucleo in questo caso) possibile simulare la semplice diffusione di 1000 molecole a partire da un hotspot (file diffusione_1.avi, 1990 step di 10 microsec.).
Figg.13-14.

23 Infine osserviamo la diffusione di due specie molecolari (file diffusione_2.avi, 1990 step di 10 microsecondi ), quella blu avente un coefficiente di diffusione cinque volte pi grande della nera (figg.15-16). Per un esauriente descrizione del codice, degli algoritmi e dei metodi utilizzati per la simulazione si consiglia di consultare la tesi di laurea dellAutore. Figg.15-16.

24 BIBLIOGRAFIA
James W.Putney, Jr (1999) Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, Cap. 23, 6th ed., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA. Giebish G., Tosteson D.C. e Ussing H.H. Membrane Transport in Biology. Concepts and Models, Vol. I, Alle Zeit Wach Press. F. Mammano ed altri (2001) Dynamics of intracellular calcium in hair cells isolated from the semicircular canal of the frog , Cell Calcium 30 (2), 131-140. F. Mammano ed altri (2003) Presynaptic calcium stores modulate afferent release in vestibular hair cells , The Journal of Neuroscience, 23 (17), 6894-6903.