UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA

MEDICION DE LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LA ENZIMA PAPAINA NATURAL EXTRAIDA DEL LATEX DE PAPAYO (Carica papaya) E INMOVILIZADA EN GEL DE AGAR

TRABAJO DE GRADUACION PRESENTADO POR ROXANA BEATRIZ MEJIA AGUILAR CECILIA XIOMARA VEGA RAMOS

PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIATURA EN QUIMICA Y FARMACIA

ABRIL 2010

SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTRO AMERICA.

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

RECTOR MSc. RUFINO ANTONIO QUEZADA

SECRETARIO GENERAL LIC. DOUGLAS VLADIMIR ALFARO CHAVEZ

FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA

DECANO LIC. SALVADOR CASTILLO AREVALO

SECRETARIA MSc. MORENA LIZETTE MARTINEZ DE DIAZ

COMITE DE TRABAJO DE GRADUACION

COORDINADORA GENERAL Licda. Mara Concepcin Odette Rauda Acevedo

ASESORA DE AREA DE ANALISIS DE ALIMENTOS: MICROBIOLOGICO MSc. Mara Evelin Snchez de Ramos

ASESORA DE AREA GESTION AMBIENTAL: CALIDAD AMBIENTAL MSc. Cecilia Hayde Gallardo de Velsquez

DOCENTE DIRECTORA MSc. Sonia Maricela Lemus Martnez

AGRADECIMIENTOS Los ms profundos y sinceros agradecimientos a nuestra asesora de este trabajo: MSc Maricela Lemus por su valiosa asesora, su incondicional apoyo, dedicacin, tiempo, esfuerzo, compromiso en la finalizacin de este trabajo y por todos sus consejos y palabras de aliento. Por ser una docente dedicada a fortalecer el carcter, la excelencia y la tica profesional.

Al laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Qumica y Farmacia y al Laboratorio de control de calidad microbiolgico del Centro de Investigacin y Desarrollo en Salud (CENSALUD), al Laboratorio de Aguas, por habernos prestado sus instalaciones ya que sin estas no se hubiera podido realizar esta investigacin, as como tambin a Lic Mazzini, Sr. Oscar Coreas, Sr. Wilber Guzmn, Sr. Jaime Gonzlez que fueron de ayuda incondicional en cada una de las etapas de nuestro trabajo.

A todas las personas que colaboraron con su apoyo en la realizacin de este trabajo de graduacin sin esperar recompensa alguna ms que la bendicin del todopoderoso.

DEDICATORIA
A DIOS porque a lo largo de mi vida me ilumin y fortaleci en todo momento para alcanzar las metas propuestas permitindome as terminar mi carrera universitaria.

A MIS PADRES Amilcar Meja y Ana Miriam Aguilar por el apoyo incondicional que siempre me han brindado en el transcurso de mi vida.

A MI ESPOSO Joel Rodrguez por apoyarme en los momentos mas difciles y no dejarme vencer por nada, por su comprensin, amor y cario.

A MI HIJO Fabrizzio por acompaarme durante mi trabajo de graduacin dentro de mi vientre y llegar a mi vida para darme una gran felicidad.

A MIS HERMANAS Karina, Esmeralda y Carolina por estar a mi lado y apoyarme en todo momento.

A MIS AMIGAS Cecilia, Odilia y Raquel por apoyarme en todo y darme todo su cario.

Roxana Beatriz Meja Aguilar

DEDICATORIA GRACIAS A DIOS TODOPODEROSO Y A LA VIRGEN SANTISIMA Por darme la vida, salud, serenidad y sobre todo sabidura, para seguir adelante y vencer todo obstculo de la vida y por lograr culminar con xito mi carrera profesional. A MIS PADRES: Trinidad Ramos y Julio Vega por su dedicacin esfuerzo y educacin durante el desarrollo y sobre todo a mi mam que gracias a su sacrificio culmine mi carrera que Dios la bendiga siempre. A MIS HERMANOS: Beatriz Ramos y Edwin Ramos por haberme dado todo el apoyo incondicional durante el proceso de estudios. A MI NOVIO: Fredy Garca por su amor, comprensin y su apoyo incondicional para lograr culminar mi carrera profesional. A MI AMIGA Y COMPAERA DE TESIS: Roxana Meja por los momentos difciles que pasamos para lograr culminar nuestra carrera.

A todas las personas que estuvieron pendientes de mi trabajo que de una u forma me animaron a seguir adelante con mucho cario un agradecimiento enorme y mil gracias.

Cecilia Xiomara Vega Ramos

INDICE
Pg. Resumen Capitulo I 1.0 Introduccin Capitulo II 2.0 Objetivos Capitulo III 3.0 Marco Terico 3.1 Suero de Leche 3.1.1 Composicin del suero 3.1.2 Clases de sueros lquidos 3.2 Agua 3.2.1 Contaminacin del agua 3.2.2 Alteraciones fsicas del agua 3.2.3 Alteraciones qumicas del agua 3.2.4 Tipos y niveles de tratamiento 3.2.4.1 Tipos de tratamiento 3.2.4.2 Niveles de tratamiento 3.3 Papaya o papayo 3.3.1 Historia de la papaya 3.3.2 Usos de la papaya 3.3.3 Monografa de la papaya 25 25 25 26 26 26 28 29 29 29 29 31 31 31 32 xx

3.3.3.1 Definicin 3.3.4 Parte Medicinal de la papaya 3.3.5 Propiedades de la papaya 3.3.6 Indicaciones farmacolgicas de la papaya 3.4 Enzima papana 3.4.1 Historia de la papana 3.4.2 El ltex de la papaya 3.4.3 Aislamiento 3.4.4 Propiedades 3.4.4.1 Propiedades Fsicas 3.4.4.2 Composicin Qumicas 3.4.4.3Otras propiedades y factores que influyen en la accin de la papana. 3.4.5 Activacin y sitio activo 3.4.5.1 Activacin 3.4.5.2 Sitio activo 3.4.6 Especificidad 3.4.7 Usos y aplicaciones de la papana 3.4.8 Tipos de papana 3.4.8.1 Papana cruda 3.4.8.2 Papana semi-refinada 3.4.8.3 Papana refinada 3.4.9 Extraccin y recoleccin del ltex

32 33 33 33 35 35 35 37 39 39 40 40

42 42 42 43 44 44 44 45 45 45

3.4.10 Medicin de la actividad proteoltica 3.4.10.1 Definicin 3.4.10.2 Principio del mtodo 3.5 Inmovilizado de enzima 3.5.1 Aspecto general sobre la inmovilizacin de enzimas 3.5.2 Ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas 3.5.3 Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin 3.5.4 Efectos en la actividad enzimtica. 3.5.5 Aplicaciones de la enzima inmovilizada 3.5.6 Requerimientos bsicos de un sistema inmovilizado 3.5.6.1 Soporte 3.5.6.2 Agar 3.5.6.3 Tcnica de inmovilizacin 3.5.6.3.1 Mtodos qumicos 3.5.6.3.2 Mtodos fsicos 3.5.6.4 Tcnica de atrapamiento en gel 3.5.6.5 Reactores 3.5.6.6 Reactor semicontinuo 3.6 Liofilizado 3.6.1 Caractersticas de la liofilizacin 3.6.2 Etapas de la liofilizacin 3.6.3 El liofilizador

47 47 49 49 49 49 50 50 52 52 53 53 54 54 54 55 55 56 56 56 56 57

Capitulo IV 4.0 Diseo Metodolgico 4.1 Tipo de Estudio 4.2 Investigacin bibliogrfica 4.3 Universo 4.4 Muestras 4.5 Mtodos e instrumentos de recoleccin de datos 4.6 Parte experimental 4.6.1 Extraccin del ltex de papayo 4.6.2 Liofilizacin de la enzima 4.6.3 Inmovilizacin de la enzima 4.6.4 Mezcla enzima soporte 4.6.5 Moldeo de la enzima 4.6.6 Ensayo general de actividad por el mtodo modificado de Kunitz 4.6.7 Recoleccin de la muestra 4.6.8 Tratamiento de aguas residuales de vertido lcteo Con la enzima papana cruda y liofilizada inmovilizada Capitulo V 5.0 Resultados y Discusin de Resultados 5.1 Determinacin del pH optimo de actividad de la enzima cruda libre e Inmovilizada

59 60 60 60 60 60 61 61 61 61 62 62 63 63

64 65

66 67 67

5.2 Determinacin de temperatura optima de la enzima cruda libre e inmovilizada. 5.3 Determinacin de pH optimo de enzima liofilizada libre e inmovilizada 5.4 Determinacin de pH optimo de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a pH 7.0 y a diferente temperaturas. 5.5 Determinacin de pH optimo de enzima comercial libre e inmovilizada 5.6 Determinacin de temperatura optima de la enzima comercial libre e Inmovilizada 5.7 Comparacin de enzima cruda, liofilizada y comercial libre 5.8 Comparacin de enzima cruda, liofilizada y comercial inmovilizada 5.9 Determinacin del tiempo de actividad de la enzima papana cruda Inmovilizada en el control de las aguas residuales de lecheras. 5.10 Determinacin del tiempo de actividad de la enzima papana liofilizada Inmovilizada en el control de las aguas residuales de lecheras. Capitulo VI 6.0 Conclusiones Capitulo VII 6.1 Recomendaciones Bibliografa Anexos

69

71

73

75

77

79 80 81

83

86 87 89 90

INDICE DE CUADRO

Cuadro N 1. Alteraciones Fsicas del agua 2. Alteraciones Qumicas del agua 3. Caractersticas de la enzima del ltex de papaya 4. Propiedades fsicas de la papana 5. Composicin de la papana 6. Resultados de las lecturas de la absorbancia de la enzima cruda Libre e inmovilizada a 280 nm a 40C. 7. Actividad en unidades Kunitz de la enzima cruda libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 40C. 8. Porcentaje de actividad de enzima cruda libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 40C. 9. Absorbancia de enzima cruda libre e inmovilizada a 280 nm a a pH 6.0 y a diferente temperatura. 10. Actividad en unidades kunitz de la enzima cruda libre e inmovilizada a pH 6.0 a diferente temperatura. 11. Porcentaje de actividad de la enzima cruda libre e inmovilizada a Diferente temperatura y a pH constante de 6.0. 12. Resultados de lecturas de la absorbancia de la enzima liofilizada libre e Inmovilizada a 280 nm a 40C.

Pg. 28 29 37 39 40 67

67

68

69

69

70

71

13. Actividad de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 40C. 14. Porcentaje de actividad de enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 40C. 15. Resultados de las lecturas de la absorbancia de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a 280 nm a pH 7.0 a diferente temperatura. 16. Actividad de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a un pH 7.0 a diferente temperatura 17. Porcentaje de actividad de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferente temperatura y a un pH constante 7.0. 18. Resultados de las lecturas de la absorbancias de la enzima comercial Libre e inmovilizacin a 280 nm a 30C. 19. Actividad de la enzima comercial libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 30C. 20. Porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura de 30C. 21. Absorbancia de enzima comercial libre e inmovilizada a pH 6.0 a diferente temperatura. 22. Actividad de la enzima comercial libre e inmovilizada a pH 6 y a diferentes temperatura 23. Porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferente temperatura y a un pH constante de 6.0. 24. Actividad de enzima cruda, liofilizada y comercial libre.

71

72

73

73

74

75

75

76

77

77

78

78

25. Actividad de enzima cruda, liofilizada y comercial inmovilizada. 26. Absorbancia antes y despus del tratamiento de agua residual de lecheras con enzima cruda inmovilizada y actividad de la enzima. 27. Absorbancia antes y despus del tratamiento de agua residual de lecheras con enzima liofilizada inmovilizada y actividad de la enzima.

80 81

83

INDICE DE ANEXOS
Anexo N 1. Tabla que se utilizaron para recoleccin de datos de la actividad de la enzima inmovilizada. 2. Preparacin de reactivos para el ensayo de actividad. 3. Preparacin de buffer fosfato pH 5.5, 6.0, 7.0, 7.5, 8.0 4. Determinacin de la cantidad de enzima inmovilizada natural equivalente a 1 mL de solucin de papana. 5. Determinacin de la cantidad de enzima inmovilizada liofilizada equivalente a 1 mL de solucin de papana. 6. Formulas para determinar las unidades de actividad. 7. Resultados de enzima cruda, liofilizada, comercial a diferentes pH. 8. Material y equipo de laboratorio. 9. Imgenes de extraccin del ltex de papayo, liofilizacin de la enzima papana, ensayo de actividad por el mtodo modificado de kunitz, recoleccin de muestra y anlisis de la muestra.

INDICE DE FIGURAS
FIGURA N 1. Papaya 2. Grafica de porcentaje de actividad de enzima cruda libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura de 40C. 3. Grafica de porcentaje de actividad de enzima cruda libre e inmovilizada a diferente temperatura y a un pH constante de 6 4. Grafica de porcentaje de actividad de enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 40C. 5. Grafica de porcentaje de actividad de enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferente temperatura y a pH constante de 7. 6. Grafica de porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 30C. 7. Grafica de porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferente temperatura y a pH constante de 6. 8. Grafica de comparacin de actividad de enzima cruda, liofilizada y comercial libre. 9. Grafica de comparacin de actividad de enzima cruda, liofilizada y comercial inmovilizada. 10. Grafica de actividad de la enzima cruda inmovilizada vrs tiempo en el tratamiento de las aguas residuales de lecheras. 11. Grafica de actividad de la enzima liofilizada inmovilizada vrs tiempo en el tratamiento de las aguas residuales de lecheras. 84 82 80 79 78 76 74 72 70 Pg 31 68

RESUMEN
En el presente trabajo comprende la extraccin por medios mecnicos de la

enzima papana del ltex del papayo (Carica papaya) obteniendo una muestra de 25 mL de enzima papana. Para darle un mayor tiempo de vida media se someti a un proceso de liofilizacin hasta total desecacin, y para mayor tiempo de uso se inmoviliz en gel de agar. Por ser una enzima natural se midi la actividad determinando temperatura y pH ptimos, por el mtodo modificado de Kunitz y se comparo la enzima liofilizada libre e inmovilizada con la enzima cruda libre e inmovilizada y una enzima comercial libre e inmovilizada. La enzima cruda libre e inmovilizada present un mximo de actividad a una

temperatura de 40C y un pH de 6 y la enzima liofilizada libre e inmovilizada presento una actividad mxima a 40C y un pH de 7 y la enzima comercial libre e inmovilizada un mximo de actividad a 30C y un pH de 6. Con los parmetros optimizados se trataron aguas residuales de lechera con las enzimas cruda y liofilizada inmovilizadas, obteniendo un tiempo de actividad de 570 minutos de la enzima cruda y 630 minutos de la enzima liofilizada. Al comparar la actividad de las tres enzimas se determino que la que tiene mayor actividad es la enzima liofilizada. Con el proceso de liofilizacin ayud a mejorar la actividad y darle un mayor tiempo de vida media a la enzima papana liofilizada. Por los resultados obtenidos se recomienda para el tratamiento de las aguas residuales de lechera el uso de enzima papana cruda y liofilizada inmovilizada

previo a su descarte a las alcantarillas y ros disminuyendo la contaminacin que este tipo de industria genera. La investigacin fue realizada en los laboratorios de Centro de Investigacin y Desarrollo en Salud (CENSALUD) y Laboratorios de la facultad de Qumica Farmacia de la Universidad de El Salvador.

Capitulo I INTRODUCCION

XX

1. INTRODUCCION La industria Lechera genera una gran contaminacin de las aguas superficiales porque se descarta el suero de la produccin de queso sin ningn tratamiento. En El Salvador la produccin de leche es de 1,000,000 de litros por da y para la fabricacin del queso se consumen 469,000 litros, el suero que se obtiene que por no ser aprovechado convenientemente; es descartado a ros y quebradas sin ningn tratamiento, lo que constituye una fuente de contaminacin de las aguas superficiales por lo que presentamos el uso de la enzima papana proteoltica como una alternativa para el tratamiento previo de las descargas que se hagan reciban un tratamiento previo antes de que llegue a los ros.

Es por ello que se vio la necesidad de tratar estas aguas residuales de las lecheras de la ciudad de Aguilares, con la enzima papana natural (Carica papaya) la cual se extrajo por medios mecnicos. Siendo la papana una mezcla de enzimas (Papana, Lizosima, Quimiopapaina) que son capaces de dividir a las protenas en molculas ms simples.

En la investigacin para poder tener un fcil manejo de la enzima papana y un mayor tiempo de vida til se utilizo el mtodo de liofilizacin, se utilizo el mtodo de inmovilizacin en gel de agar para permitir una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace que se pueda reutilizar.

XXI

Para cumplir dicho objetivo de la actividad de la enzima papana se determino con el mtodo Modificado de Kunitz logrando as comparar la actividad de la enzima papana natural, liofilizada con una enzima comercial.

La informacin recolectada en esta investigacin se presenta en cuadros, figuras y esquemas que explica de una manera ms comprensible los resultados obtenidos.

Capitulo II OBJETIVOS

2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL Medir la actividad proteoltica de la enzima papana natural extrada del ltex de papayo (Carica papaya) e inmovilizada en gel de agar.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 2.2.1 Extraer del ltex del papayo (Carica papaya) por medios mecnicos la enzima papana natural.

2.2.2 Determinar el pH y Temperatura ptimos de actividad de la enzima papana cruda, seca liofilizada libre e inmovilizada y papana comercial.

2.2.3 Comparar la actividad a pH y Temperatura ptimos de la papana extrada cruda y liofilizada inmovilizada con una papana comercial inmovilizada.

2.2.4 Determinar el tiempo mximo de actividad de la papana cruda y liofilizada inmovilizada en el control de aguas residuales de lechera.

Capitulo III MARCO TEORICO

25

3.0 MARCO TEORICO

3.1 SUERO DE LECHE (32).

Durante la elaboracin del queso se hace coagular la leche mediante la adicin de cuajo. Con ello la leche se descompone en dos partes: una masa semislida, compuesta de casena y un lquido, que es el suero de leche. El suero de leche es transparente y de color amarillo verdoso y tiene un sabor ligeramente cido, bastante agradable. 3.1.1 Composicin del suero El suero de leche tiene un perfil de minerales en el que destaca sobre todo la presencia de potasio, en una proporcin de 3 a 1 respecto al sodio, lo que favorece la eliminacin de lquidos y toxinas. Cuenta tambin con una cantidad relevante de otros minerales como calcio ("En una proporcin de un 50% ms que en la leche", segn Roser Amills), fsforo y magnesio, y de los oligoelementos zinc, hierro y cobre, formando todos ellos sales de gran biodisponibilidad para nuestro organismo. El suero de leche, que contiene todos los aminocidos esenciales, aporta protenas de una calidad extraordinaria y con un coeficiente de uso por parte del organismo humano, segn Marisa Madoz: "Superior incluso al de la leche o los huevos". Contiene adems cantidades pequeas pero apreciables de las vitaminas A, C, D, E y del complejo B, as como cido ortico, que es, en palabras de Madoz(32): "Fundamental para la absorcin de minerales como el calcio, fsforo,

26

etc." , y cido lctico ("Que ayuda a mejorar el proceso de respiracin celular", segn Roser Amills), junto con un contenido muy bajo en grasas y en caloras.

3.1.2 Clases de sueros lquidos

Hay dos clases de suero: el dulce y el cido, los cuales dependen de los mtodos empleados para la coagulacin de la leche. El suero dulce es el obtenido por una coagulacin enzimtica, utilizando para ello un cuajo de procedencia animal, como la quimosina de rumiantes; o vegetal, o bien un cuajo microbiano. El suero cido es obtenido por acidificacin natural de la leche o por la adicin de cidos orgnicos. La coagulacin natural se produce por fermentacin de la leche causada por la flora bacteriana existente o a fermentos lcticos aadidos; o bien puede ser obtenida por adicin de cidos orgnicos a la leche lquida, tales como actico, ctrico, lctico, etc.

3.2 AGUA (26) El agua, constituye un rea esencial para el establecimiento de la sustentabilidad de la vida, en un pas o el planeta; ya que es un elemento necesario para la supervivencia y un recurso vital para el desarrollo de las diversas actividades econmicas, sociales, agrcolas, etc. La problemtica del agua incluye aspectos de disponibilidad, distribucin, uso y contaminacin.

3.2.1 Contaminacin del agua (26). De acuerdo a la Ley del Medio Ambiente de El Salvador, promulgada en 1998, se entiende como contaminacin: la presencia o introduccin al ambiente de

27

elementos nocivos a la vida, la flora o la fauna, o que degraden la calidad de la atmsfera, del agua, del suelo o de los bienes y recursos naturales en general, conforme lo establece la ley. Bajo este concepto se estim que ms del 90% de todas las fuentes de agua superficiales se encuentran con algn grado de contaminacin por desechos orgnicos, industriales y agroqumicos. En cuanto a aguas subterrneas, solo se tienen algunos datos muy espordicos sobre la contaminacin. Los ros ms contaminados a nivel nacional segn el MARN son el Acelhuate, Suquiapa, Sucio, Grande de San Miguel y Acahuapa, en cuyas cuencas se encuentran establecidas zonas urbanas con alta densidad poblacional. La OPS-UNICEF estim en el ao 2000, que de toda la poblacin cubierta con servicios de alcantarillado, slo entre 2% y 3% del caudal de aguas residuales recibe algn tipo de tratamiento previo antes de ser lanzadas a ros o quebradas (OPS-UNICEF, 2000). En general las actividades humanas que contribuyen a la contaminacin del agua, se clasifican de la siguiente forma: - Domsticas /institucionales - Comerciales - Industriales - Agropecuarias - Hospitalarias - Por derrame de petrleo

28

3.2.2 Alteraciones Fsicas del agua (14) Cuadro N 1 Alteraciones Fsicas del agua.

Alteraciones Fsicas

Caractersticas y contaminacin que indica

Color

El agua no contaminada no suele tener ligeros colores rojizos, pardos, amarillentos o verdosos. Las aguas contaminadas pueden tener muy diversos colores pero, en general, no se pueden establecer relaciones claras entre el color y el tipo de contaminacin.

Olor y sabor

Compuestos qumicos presentes en el agua como los fenoles, diversos hidrocarburos, cloro, materias orgnicas en descomposicin o esencias liberadas por diferentes algas u hongos pueden dar olores y sabores muy fuertes al agua, aunque estn en muy pequeas concentraciones. Las sales o los minerales dan sabores salados o metlicos, en ocasiones sin ningn olor.

Temperatura

El aumento de temperatura disminuye la solubilidad de gases (oxgeno) y aumenta, en general, la de las sales. Aumenta la velocidad de las reacciones del metabolismo, acelerando la putrefaccin. La temperatura ptima del agua para beber est entre 10 y 14C. Las centrales nucleares, trmicas y otras industrias contribuyen a la contaminacin trmica de las aguas, a veces de forma importante.

Materiales en suspensin

Partculas como arcillas, limo y otras, aunque no lleguen a estar disueltas, son arrastradas por el agua de dos maneras: en suspensin estable (disoluciones coloidales); o en suspensin que slo dura mientras el movimiento del agua las arrastra. Las suspendidas coloidalmente slo precipitarn despus de haber coagulacin o floculacin (reunin de varias partculas)

Espumas

Los detergentes producen espumas y aaden fosfato al agua (eutrofizacin). Disminuyen mucho el poder autodepurador de los ros al dificultar la actividad bacteriana. Tambin interfieren en los procesos de floculacin y sedimentacin en las estaciones depuradoras.

Conductividad

El agua pura tiene una conductividad elctrica muy baja. El agua natural tiene iones en disolucin y su conductividad es mayor y proporcional a la cantidad y caractersticas de eso electrolitos. Por esto se usan los valores de conductividad como ndice aproximado de concentracin de solutos.

29

3.2.3 Alteraciones Qumicas del agua (14) Cuadro N 2 Alteraciones Qumicas del agua

Alteraciones Qumicas

Contaminacin que indica

pH

Las aguas naturales pueden tener pH cidos por el CO2 disuelto desde la atmsfera o proveniente de los seres vivos; cido sulfrico procedente de algunos minerales, por cidos hmicos, disueltos del mantillo del suelo. La principal sustancia bsica en el agua natural es el carbonato clcico que puede reaccionar con el CO2 formando un sistema de tampn carbonato/bicarbonato. Las aguas contaminadas con vertidos mineros o industriales pueden tener pH muy cido. El pH tiene una gran influencia en los procesos qumicos que tienen lugar en el agua, actuacin de los floculantes, tratamientos de depuracin, etc.

3.2.4 Tipos y Niveles de Tratamiento de Aguas Residuales (14) 3.2.4.1 Tipos de tratamiento: Los tipos de tratamiento se pueden clasificar como: fsicos, qumicos, biolgicos

3.2.4.2 Niveles de Tratamiento (14) Los niveles de tratamiento se agrupan segn los diferentes grados de eficiencia alcanzados en la remocin de los contaminantes existente en los lquidos residuales. Estos niveles se conocen usualmente como; pretratamiento, tratamiento primario, tratamiento secundario, tratamientos avanzados o terciarios.

30 Pretratamiento. Se trata de un tratamiento previo, diseado para remover partculas grandes, tales como plsticos, pelos, papeles, etc. ya sea que floten a se sedimenten, antes de que lleguen a las unidades de tratamiento posteriores. Aqu se emplean mayoritariamente rejillas o tamices,

Tratamiento primario Se elimina un gran porcentaje de slidos en suspensin, sobrenadante y materia inorgnica. En este nivel se hace sedimentar los materiales suspendidos usando tratamientos fsicos o fisicoqumicos.

Tratamiento secundario. Se trata de reducir el contenido en materia orgnica acelerando los procesos biolgicos naturales. En esta fase del tratamiento se eliminan las partculas coloidales y similares. Puede incluir procesos biolgicos y qumicos.

Tratamientos avanzados o terciarios. En el tratamiento terciario es necesario cuando el agua va a ser reutilizada; elimina un 99% de los slidos y adems se emplean varios procesos qumicos para garantizar que el agua est tan libre de impurezas como sea posible.

31

3.3 PAPAYA O PAPAYO (Carica papaya)(17) 3.3.1 Historia de la Papaya. La papaya cuyo nombre cientfico (Carica papaya) pertenece a la familia de la Caricceas nativa de Centroamrica. La primera mencin de la misma fue en el ao 1535 y se le atribuye a Oviedo (Gonzlez Fernndez de Oviedo 1478-1557, Historiador Espaol),
Figura N1: Papaya

quien informo a los Reyes de Espaa haber visto plantas de papaya creciendo en dicha regin. Su llegada del Caribe a Sudamrica se dio a los marinos espaoles y Portugueses. En estos lugares se le conoce con diferentes nombres tales como: Fruta bomba, Lechosa, Papaw y otros. Su distribucin en todo el resto del mundo tropical se logra durante el siglo XVI.

3.3.2 Usos de la Papaya (17) El fruto de la Papaya tiene muchos usos como: - Fruta fresca - En jugos - En batidos - Helados - Como parte de las ensaladas - Elaboracin de dulces por Casera o envasados por la Industria.

32

3.3.3 Monografa de la Papaya (19)

3.3.3.1 Definicin: Se trata de un arbolito carnoso y de tronco frgil muy esponjoso y hueco en su parte central muy cultivado en regiones tropicales y sub-tropicales. Altura: Alcanza hasta los 9 metros Familia: Caricceas Hbitat: Originaria probablemente del rea tropical de Amrica del Sur. Hojas: De color verde oscuros y gruesas, y de 80 centmetros de longitud, alternas y muy juntas entre s, palmeadas y divididas de forma suborbicular en 5-7 lbulos, irregulares. Posee un pecolo robusto de hasta 50 centmetros de longitud.

Flores: Dioicas, aunque raramente monoca, agrupadas en el extremo del tronco de color amarillo claro. Posee 5 ptalos y 5 spalos del mismo color. Las flores masculinas son fragantes las cuales nacen de racimos pedunculados de hasta 50 centmetros de longitud. Las femeninas son de mayor tamao, solitarias, axilares y con pednculo corto.

Frutos: Son gratos al paladar y refrigerantes, vallas carnosas y lobulosas, usualmente con 5 ngulos de tamao variable y de color anaranjado al madurar. Contiene en su interior una pulpa lechosa de color anaranjado , con numerosos semillas negras y globulares que estn dispuestas en su cavidad central. Las numerosas semillas son aplanadas y con endospermo carnoso.

33

3.3.4 Parte Medicinal de la Papaya (19) El ltex desecado del fruto, el cual se puede obtener de las semillas y la planta entera.

3.3.5 Propiedades de la Papaya (19) - Digestiva - Activadora de los jugos pancreticos - Anticonceptiva (a grandes dosis) - Vermfugo - Cicatrizante (ltex).

3.3.6. Indicaciones Farmacolgicas de la Papaya

(17):

- Sistema Digestivo: su jugo posee la caracterstica de ablandar las carnes, debido a su alto contenido en papana, la cual es capaz de disolver los trombos de fibrina y ejerce una actividad peptnica muy superior a la de la propia pepsina digestiva. La papana y la pulpa de la papaya se recomiendan en caso de dispepsia y dificultad de digestin de origen intestinal, especialmente cuando existe una disminucin en la secrecin de los jugos pancreticos. La papaya est muy recomendada para aquellas personas que tienen dificultades en digerir las protenas o las grasas. As mismo est muy indicada como postre en aquellas comidas en las cuales ha habido una sobrecarga proteica.

- Estreimiento: tomar en ayunas una papaya con un poco de sal

34

- Endocrinologa: la virtud en la papaya como anticonceptiva es algo discutida si bien se sabe por ejemplo que las mujeres indias que consumen este fruto en gran cantidad poseen una menor capacidad reproductiva. Esta accin se debe probablemente a una inhibicin de la hormona progesterona. Las semillas de la papaya son occitxicas, es decir que estimulan la contraccin uterina. - Infestacin intestinal: por scaris lumbricoides y tenia - Lombrices Intestinales: Ingerir una cucharada de las semillas frescas y molidas Puede mezclarse las semillas con alguna infusin que tomemos habitualmente. - Inflamaciones del hgado, riones y ovarios: El fruto maduro y rallado o licuado mezclndolo con leche o agua. - Enteritis de los nios: Cocimiento de una rodaja verde, pelada y sin semillas en un litro de agua. Aadir luego leche. - Dermatologa: debido a su capacidad de disolver las protenas, su uso es recomendado en los casos de verrugas, lceras crneas y excrecencias de todo tipo como eccemas descamativos, psoriasis, etc. En los abscesos se utiliza el ltex de papaya el cual adems de ayudar en la cicatrizacin disuelve el tejido colgeno que obstruye en muchos casos la cicatrizacin correcta. - Otorrinolaringologa: La papaya se utiliza en la disolucin de los tapones de cerumen de los odos. - Asma, fiebres y enfermedades pulmonares: cocimiento de un pedazo de la hoja (del tamao de un billete para un jarro de agua) - Para mujeres que amamantan a sus nios: El jugo lechoso de la papaya verde,

35

untado en los pechos de las mujeres que dan de mamar a sus hijos aumenta la secrecin lctea. . 3.4 ENZIMA PAPAINA (4) 3.4.1 Historia de la papana Se ha sabido que desde hace muchos aos los pueblos de la India Occidental prensaban piezas de carne entre las hojas de papaya, con el objeto de suavizarla. En Barbados se aadan masas de frutas verdes a la carne que de otra manera no se podan cocer. Los Nativos tambin usaban el jugo de la papaya con propsitos de cosmtico; as, frotaban ya sea el jugo solo o el jugo mezclado con agua o pigmentos en sus peles, para obtener as un tono de piel ms saludable y suave. El jugo de la papaya tambin fue usado por los indgenas contra: - El eczema - Las verrugas - Los parsitos intestinales - Las ulceras y otras llagas - La difteria - Mltiples afecciones de la piel.

3.4.2 El ltex de la papaya (2) Se obtiene el ltex de la Carica papaya, un rbol que crece en casi todo pas tropical. La fuente ms rica de papana es el jugo o ltex que se encuentra bajo la

36

cscara de la papaya verde y plenamente desarrollada. Este ltex esta contenido en unos pequeos vasos largos que se encuentran justamente debajo de la piel.

Cuando estos vasitos son cortados, exudan un lquido claro como el agua, el cual se vuelve opaco por su exposicin al aire, siendo este lquido la fuente ms importante de papana.

Aunque todas las partes de la planta contienen ltex, en plantaciones comerciales para obtener papana, solo los frutos verdes, inmaduros y sin cortar son usados para la extraccin de ltex, porque las exudaciones de estos frutos son mas vigorosas que de cualquier otra parte de la planta.

El ltex de papaya consiste en una mezcla de proteasas o enzimas. Schack demostr la existencia de cuatro componentes principales con actividad proteoltica: - Papana - Quimiopapana - Lisozima - Material no caracterizado, en las protenas solubles del ltex. Juntas estas protenas son ms o menos el 64% de las protenas solubles del ltex. La fraccin denominada quimiopapana es el componente proteoltico ms abundante en el extracto. La papana fue cristalizada por primera vez por Ball et. Al. En 1937

37

Cabe mencionarse tambin que la extraccin del ltex no daa la pulpa del fruto, pudiendo utilizarse este al madurarse, para consumo fresco o considerar la posibilidad de enlatarlo en forma de trozos o rodajas, fabricar mermeladas, vinagre, nctar, etc., ya sea para consumo interno o para exportacin.

3.4.3 Aislamiento (2)

La papana es una enzima proteoltica (hidrolasa) que se encuentra en el ltex de la papaya, el cual esta contenido principalmente en unos vasos pequeos que estn debajo de la cscara del fruto, y se extrae por medio del estriado del fruto verde, pero plenamente desarrollado, sin cortarlo de la planta; las propiedades de este son conocidas desde hace muchos aos. El ltex de la papaya contiene una mezcla de enzimas, la composicin de este y algunas de las caractersticas de sus fracciones enzimticas se muestra en el Cuadro 3.

Cuadro N 3 Caractersticas de la enzima del ltex de papaya (5) Enzima Peso Molecular Punto Isoelctrico Concentracin del ltex
Papana Quimiopapana Lisozima 21,000 36,000 25,000 8.75 10.1 10.5 10% 45% 20%

La papana puede separarse del resto de enzima y prepararse rpida y econmicamente, en una forma cristalina, en un estado de pureza bueno y en cantidades razonables, a partir del ltex seco comercial.

38

Se han desarrollado muchos mtodos para aislar la papana del resto de enzimas, entre ellos cabe mencionar el desarrollado por Kimmel y Smith, que es uno de los mtodos ms usados de extraccin de papana. Este procedimiento comprende una extraccin del ltex, eliminacin del material insoluble en el extracto a un pH 9, precipitaciones con sulfato de amonio, seguidas de tres recristalizaciones. La papana pura obtenida por este mtodo contiene tres componentes: - Papana activa - Papana no activable - Papana activable. Por este mtodo se obtienen aproximadamente de 6 a 7 mg., de papana pura por gramo de ltex seco (2).

En general, lo que se busca en la purificacin del ltex seco es: 1) Reducir el contenido de componentes no proteolticos, para obtener una fraccin con mayor actividad proteolticas. 2) Separar la papana u otro componente del resto de enzimas o compuestos con actividad proteoltica (o al menos incrementar considerablemente la proporcin de esta). 3) Producir un producto ms estable para incrementar su vida de almacenamiento 4) Producir un producto estril para una aplicacin especifica. La papana aislada representa solo una parte menor del total de actividad proteoltica, esto se debe a que hay otra enzima proteoltica presente en el ltex

39

en una proporcin considerablemente mayor, que tambin ha sido aislada en forma cristalina por medio de un procedimiento de fraccionamiento diferente, siendo esta la quimiopapana. La suma de las actividades de esas dos enzimas cristalinas representan casi el total de la actividad proteoltica del ltex fresco.

3.4.4 Propiedades (2) 3.4.4.1 Propiedades Fsicas De acuerdo a Balls y Lineweaver la papana cristalina se presenta en forma de

agujas bajo el microscopio. Algunas veces, se presenta otra forma de cristales, lamina largas con caras hexagonales alargadas, menos solubles en agua, las cuales aparecen en las suspensiones conteniendo las agujas despus de mantenerlas a 8C durante muchos meses. La papana cristalina es soluble en agua y en alcohol etlico o metlico al 70% y notablemente estable en solucin de urea 9.0M, pero puede ser precipitada fcilmente (Salting out) en solucin, especialmente a bajas temperaturas. Cuadro N 4 Propiedades fsicas de la Papana (15) Propiedad
Punto Isoelctrico Constante de sedimentacin Constante de difusin Peso molecular Coeficiente de Extincin Rotacin ptica (pH = 5.7, 25C)

Valor
pH= 8.75 2.42 + 0.04 seg 7 2 -1 10.27+0.13x10 cm seg 23,350 Daltons 25.0 -66.7

3.4.4.2 Composicin Qumica (2) La papana existe como un monmero, consistente de 212 aminocidos. Es una protena simple conteniendo solamente aminocidos y desprovista de

40

carbohidratos. Todos los aminocidos usuales estn presentes con excepcin de la metionina. La composicin elemental de la papana cristalina ha sido reportada que contiene un 16.1% de nitrgeno y un 1.2% de azufre. El valor del azufre corresponde a 8 tomos por mol de papana. La composicin de aminocidos reportada por Smith y Kimmel (7), se muestra en el Cuadro 5.

Cuadro N 5: Composicin de la Papana AMINOACIDO

Acido asprtico Treonina Serina Acido glutmico Prolina Glicina Alanina Valina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilamina Histidina Lisina Arginina Triptfano

(5)

% DE PROTEINA
11.32 3.89 5.91 12.43 5.11 8.60 6.08 8.43 6.05 6.10 14.71 3.16 0.85 5.67 7.75 4.68

3.4.4.3 Otras propiedades y factores que influyen en la accin de la papana (2) a) Temperatura. Es de recordar que los nativos del trpico ablandaban su carne hirvindola con pedazos de papaya verde o con su jugo; ste fenmeno fue reportado por numerosos investigadores de este campo desde hace mucho tiempo. Las enzimas proteolticas son tradicionalmente poco estables al calor, pero la papana es

41

relativamente la enzima ms estable en un rango de temperatura amplio, propiedad que no es compartida por otras proteasas vegetales. Wurtz (22), encontr que una muestra de papana todava retiene actividad despus de haber sido calentada a 105C. Esto se basa en el descubrimiento que la papana resiste calor seco a 100C por 3 horas. Sin embargo cuando se us papana en solucin, su actividad fue destruida por calentamiento a 82.5C, esto se debe a que la papana es ms estable en estado slido que en solucin. b) pH del medio Una de las peculiaridades de la papana es su actividad proteoltica en un amplio rango de condiciones de pH. Declaraciones recientes muestran que la papana es activa en un medio cido, neutro y bsico, cubriendo esta actividad un rango de pH de 3 a 12. En efecto, ste es probablemente el rango efectivo ms amplio de pH que el de cualquier otra enzima proteoltica. Tambin se ha reportado que el ptimo de estabilidad de la papana en solucin es del rango de pH de 5 a 6. La accin ptima de papana sobre casena ha sido encontrada a un pH de 6.5 y 7. c) Efecto de almacenamiento. La papana pierde su actividad durante el almacenamiento, especialmente cuando esta se encuentra en solucin. Se han reportado prdidas de actividad de preparaciones comerciales de papana que se han almacenado durante varios meses o durante un ao, y tambin de

42

muestra de papana de diversos grados de pureza que han perdido, en promedio, acerca de un 30% de su actividad en 3-6 meses, cuando se han mantenido a 25C El mtodo de preparacin de la papana es muy importante en relacin a su estabilidad durante el almacenamiento. Estudios especiales sobre la estabilidad de la papana han confirmado que mucha de la actividad del ltex se pierde durante el secado y su subsecuente almacenamiento.

3.4.5 Activacin y sitio activo (2)

3.4.5.1 Activacin La papana es activada por agentes reductores y desactivada por agentes oxidantes. Los agentes ms comunes usados son cistena, cianuro y sulfuros. Es importante enfatizar que aunque la papana requiere activacin, no es requerida la presencia continua del activador, la efectividad del sistema activador depende de cual

sistema buffer sea utilizado. Esta variabilidad del sistema buffer es eliminada si EDTA (Acido-etilendiaminotetractico) es usado en unin del agente reductor. Varios agentes como el yodo, bromo, perxido de hidrgeno diluido y oxgeno atmosfrico, inactivan la papana bajo ciertas condiciones. Estos efectos han sido explicados por la naturaleza del grupo TIOL de la enzima, el cual es activo en estado reductor e inactivo en estado oxidado. 3.4.5.2 Sitio activo La interaccin entre enzima y substrato ocurre en la superficie de la molcula de papana en un surco el cual est situado entre las dos partes de la molcula. La

43

cadena lateral de Cistena 25 se encuentra en la ranura, si el grupo SH de la Cistena no se encuentra libre ya sea por bloqueo por metales pesados, por agentes alquilantes o por formacin disulftica, la actividad de la enzima desaparece completamente. Cercano al grupo sulfhdrico se encuentra el anillo imidazolico de la Histidina 159, el cual se encuentra unido a su vez, a travs de puentes de hidrgeno, con la cadena lateral de Asparagina 175; dndole forma a la triada cataltica que forma el sitio activo de la papana

3.4.6 Especificidad (2)

Se ha conocido desde hace muchos aos que la papana puede producir una degradacin de la protena en muchos sustratos, mas que cualquier otra proteasa vegetal conocida. La papana tiene una amplia especificidad, as puede hidrolizar sustratos sintticos que son los sustratos generalmente usados para tripsina, quimiotripsina o pepsina. La papana es tambin muy activa en la hidrlisis de amidas y steres. La aplicacin de sustratos sintticos simples en el estudio de la especificidad de enzimas proteolticas ha resultado con grandes progresos para el entendimiento de la accin de la papana. Usando dichos sustratos se ha encontrado que los preparados comerciales de papana no atacan los dipptidos, o si lo hacen, lo hacen muy despacio Kimmel y Smith, han reportado que el cido Carbobenzoxi-Lglutmico es un inhibidor de la papana en la regin de pH 3.9 a 4.5; tambin se ha demostrado que el cido Carbobenzoxi-L-asprtico produce inhibicin similar.

44

3.4.7 Usos y Aplicaciones de la Papana (2)

La distribucin de la utilizacin de la papana por tipo de industria ha sido estimada as: - Cervecera 75% - Carne 10% - Pescado 5% - Otras comidas 5% - Productos farmacuticos 2% - Usos diversos 3% De acuerdo a esta estimacin el 95% de la papana es utilizada en la industria de alimentos y cervecera.

3.4.8 Tipos de Papana (2)

Los principales tipos de papana que actualmente se venden el mercado Internacional son:

3.4.8.1 Papana Cruda Esta se obtiene por el secado del ltex al sol o en hornos rsticos. Es un producto de baja calidad, baja estabilidad biolgica y por lo tanto de vida corta y de una actividad proteoltica relativamente baja (aproximadamente 350 unidades

tirosina/mg), su rendimiento a partir del ltex fresco es de un 20% en peso aproximadamente.

45

3.4.8.2 Papana Semi-Refinada Es obtenida por secado del ltex bajo condiciones controladas. Sin embargo su vida es limitada a 6-8 meses, su rendimiento a partir del ltex fresco es de un 25% en peso aproximadamente y su actividad proteoltica es mas baja que la de la papana completamente refinada (450-500 unidades tirosina/mg). Su color es blanco.

3.4.8.3 Papana Refinada Este producto es biolgicamente estable y completamente libre de materia extraa, y tiene una actividad proteoltica ms alta que las anteriores (800-1000 unidades tirosina/mg y ms). Generalmente es obtenida a travs de un proceso de secado por aspersin al vaco (mtodo de Bourdart); a grandes rasgos la secuencia de operaciones que sigue este ltex son: homogenizacin, clarificacin, filtracin sobre placas clarificantes, concentracin, filtracin esterilizante y atomizacin. La relacin de ltex fresco a papana que se vende refinada es de 6:1 o 7:1. Es la papana ms purificada que se vende actualmente en el mercado internacional. Tambin existen otros mtodos para su obtencin, como el de fraccionamiento alcohlico.

3.4.9 Extraccin y Recoleccin del ltex

La extraccin del ltex se lleva a cabo por medio del estriado de los frutos verdes. El estriado consiste en hacer incisiones longitudinales en la cscara del fruto; respecto a la profundidad de las incisiones, algunos autores recomiendan que

46

stas no sean mayores de 2 mm. Mientras que otros dan un rango de variabilidad de 2 a 2.5 mm, y algunos opinan que la profundidad de stas pueden ser hasta de 3 mm. Debe de cuidarse mucho de esto, ya que incisiones profundas podran causar infecciones, echando a perder el fruto. Se recomienda utilizar materiales no oxidables para la extraccin del ltex. As, los incisores deben ser de acero inoxidable, aluminio, madera, hueso, vidrio o bamb, pero nunca de metal corriente, esto es debido a que la papana pierde su actividad fcilmente al estar en contacto con metales como el hierro y el cobre. Las hojas de afeitar de acero inoxidable de doble filo han sido utilizadas con xito para ello (1,9, 13). Generalmente el incisor consiste de una vara de madera, a la cual se le prende un trozo de la hoja de afeitar o navaja, de un tamao tal, que vaya de acuerdo con la profundidad deseada de las incisiones. Una vez realizadas las incisiones, el ltex fluye, y cae en los recipientes recolectores hechos, generalmente en forma de sombrilla y colocados alrededor del tronco.

Hay diferentes diseos para estos recolectores; as, una tcnica comn de recoleccin en el Este de frica, consiste en instalar en torno del rbol un aro, portando plstico, cuyo dimetro sea mayor que la circunferencia del follaje y de los frutos, el cual es sostenido por tres estacas de suficiente altura, instaladas convenientemente, cada una terminada en horqueta, las cuales se entierran en el suelo hasta que el arco queda fijo y nivelado. Sobre el aro se coloca una tela de

47

plstico de forma circular y cnica para que sea sujetada en torno del tallo del rbol en un extremo y el otro a diversos puntos del aro por medio de cordeles. El plstico debe tener una depresin para que se deposite el ltex. Los recipientes en que se recolecte el ltex deben ser siempre de un material que no desactive la papana, as puede usarse acero inoxidable, porcelana, vidrio, metal esmaltado, plstico, lona, aluminio.

El ltex que coagula sobre la incisin, luego que ha cesado el flujo, se raspa con utensilios no corrosivos y se mezcla con el anterior, ya que no existe diferencia en la actividad proteoltica entre la papana obtenida del ltex fluido y del que coagula en la incisin. Luego de ser colectado el ltex, este es transportado en recipientes de material adecuado y se somete ya sea a un simple proceso de secado o directamente a un proceso de purificacin, dependiendo de su uso final.

3.4.10 Medicin de la Actividad Proteoltica (2)

3.4.10.1 Definicin La efectividad o potencia de una enzima es ms tilmente expresada en trminos de actividad. Cuando es posible sta es expresada en Unidades de Actividad las cuales se definen en trminos del peso de sustrato transformado en producto, en un tiempo determinado. En el caso de la papana, que es una enzima hidroltica, una unidad de actividad es la cantidad de enzima que cataliza la hidrlisis de un mol de sustrato en un minuto.

48

La proporcin en que la enzima cataliza las reacciones est afectada por la concentracin del sustrato, la temperatura y el pH de la solucin en que es medida, por lo tanto ambas condiciones deben ser establecidas para que la medicin tenga sentido y pueda usarse para propsitos comparativos.

Actualmente hay 3 tipos comunes de ensayos utilizados para medir la actividad de la papana: 1) El mtodo que se basa en la hidrlisis de molculas de bajo peso molecular de sustratos sintticos; estos mtodos son los ms exactos, mas caros y menos pertinentes para aplicaciones prcticas. 2) El mtodo que se basa en el grado de hidrlisis de sustratos protenicos; existen una gran variedad de stos mtodos debido a tanta combinacin de protenas y metodologa a escoger, son los mtodos ms tiles y confiables siempre que se especifique la naturaleza y fuente de protena usada as como las condiciones en que se lleva a cabo el ensayo. 3) Los mtodos que se basan en la habilidad de la enzima coagular la leche, estos mtodos son los ms baratos en trmino de materiales, pero no en el tiempo que se toman: se expresan los resultados en unidades de coagulacin de leche (m.c.u.= milk clotting unites).

Mtodo Modificado de Kunitz En esta tesis se trabajar para medir la actividad de la papana con el Mtodo Modificado de Kunitz para la determinacin de la actividad proteoltica de enzima;

49

este mtodo pertenece al segundo grupo de mtodos de medicin de actividad proteoltica antes mencionado.

3.4.10.2 Principio del Mtodo (2) Una solucin de la enzima es incubada, bajo condiciones estndar con casena desnaturalizada. La reaccin es detenida por la adicin de cido tricloroactico (TCA). La protena no hidrolizada es precipitada por el TCA aadido. El precipitado es removido por filtracin y la absorbancia de la capa sobrenadante es medida espectrofotomtricamente a 280 nm. El incremento de la absorbancia a 280 nm, despus de la incubacin es una medida de la actividad enzimtica

3.5 INMOVILIZADO DE ENZIMA (15) 3.5.1. Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente
(24).

Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte.

3.5.2 Ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas 1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

50

2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso 3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendr su actividad durante ms tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtencin de productos con mayor pureza.

3.5.3 Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin 1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte. 3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la inmovilizacin. 4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

3.5.4. Efectos en la actividad enzimtica Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser debido a que: 1. La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo est impedido,

51

2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima, 3. La inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, 4. Las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin o desactivacin de la enzima.

Efectos en la estabilidad Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones: 1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace ms resistente a la desactivacin trmica o qumica. Este tipo de estabilizacin se obtiene nicamente en aquellos mtodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unin a soportes. 2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unin de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica. 3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima retenidas en una determinada regin del espacio. 4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la interaccin de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima es sensible al oxgeno

52

(como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la superficie de un soporte cargado, la fuerza inica efectiva en el microentorno de la enzima ser muy alta y, como consecuencia, la concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa zona que en el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto tamponador de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgnicos, la acuofilia del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformacin activa. 3.5.5 Aplicaciones de la enzima inmovilizadas Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analticas: biosensores 2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentara y de tratamiento de residuos.

3.5.6 Requerimientos bsicos de un sistema inmovilizado (3) Se requieren cuatro elementos bsicos: 1. La enzima

53

2. El soporte 3. Tcnica de inmovilizacin 4. Reactor.

3.5.6.1 Soporte Los materiales utilizados como soporte incluyen tanto materiales orgnicos como inorgnicos. Los soportes orgnicos tienen ms sitios de enlace por gramo, pero a menudo no tienen las propiedades ms deseables de fluidez y son afectados por factores ambientales como pH o deterioro por microorganismos. Ejemplos de soportes orgnicos son el almidn, el dextran, la sacarosa, nylon, polmeros basados en la alquilamida. Los soportes inorgnicos incluyen vidrios slidos y porosos, tierra diatomeas, aluminio, silicn, pantalla de niquel, bolas de acero inoxidable, arena, roca. Estos soportes tienen menos sitios activos que los soportes orgnicos, pero son ms estables.

3.5.6.2 Agar El Agar es un coloide de algas extrado de especies del gnero Gelidium y otras agarofitas, todas ellas pertenecientes a las algas rojas (rodfitas), es una sustancia amorfa y se halla en el comercio en forma de polvo, escamas, tiras delgadas, es poroso, traslcido, membranoso, de color amarillo, quebradizo cuando est seco y flexible cuando est hmedo.

54

3.5.6.3 Tcnica de inmovilizacin Los mtodos para inmovilizar enzimas se pueden dividir en dos clases principales: mtodos qumicos y mtodos fsicos.

3.5.6.3.1 Mtodos Qumicos Los mtodos qumicos de inmovilizacin incluyen cualquiera de aquellos procedimientos que involucren la formacin de al menos un enlace covalente o parcialmente covalente entre una o varias molculas enzimticas y un polmero insoluble en agua. En realidad, normalmente se forma ms de un enlace covalente entre los reactantes. Ejemplos de mtodos qumicos: a) Acoplamiento de la enzima a polmeros funcionalmente insolubles en agua. b) Incorporacin de la enzima dentro de cadenas crecientes de polmeros. c) Enlazamiento intermolecular de la enzima con un reactivo multifuncional de bajo peso molecular

3.5.6.3.2 Mtodos Fsicos En los mtodos fsicos se incluyen a todos aquello procedimientos que involucren la fijacin de una enzima en un soporte, sin la formacin de un enlace covalente. En estos procedimientos, la inmovilizacin de las enzimas es dependiente de la operacin de ciertas fuerzas fsicas tales como interacciones electrostticas, formacin de enlaces inicos, interacciones protena-protena, etc. El atrapamiento en microcompartimientos o la contencin en membranas semipermeables

55

Ejemplos de mtodos fsicos: a) Adsorcin de la enzima sobre una matriz insoluble en agua. b) Atrapamiento de la enzima dentro de una matriz gelatinosa insoluble en agua (atrapamiento en gel). c) Atrapamiento de la enzima dentro de una microcpsula permanente o no permanente semipermeable. d) Retencin de la enzima dentro de dispositivos especiales dependientes de membranas semipermeables

3.5.6.4 Tcnica de Atrapamiento en Gel (4) Esta tcnica de inmovilizacin consiste en dar lugar a la formacin de un gel en presencia de la enzima. Las condiciones deben ser idneas para producir un gel con poros ms pequeos que la enzima, de manera que sta quede atrapada dentro de la matriz del gel; adems estos poros deben ser suficientemente grandes para permitir la difusin y transformacin del substrato, y finalmente la liberacin del producto

3.5.6.5 Reactores (4) Un reactor enzimtico es bsicamente, el recipiente en el cual se lleva a cabo una reaccin catalizada por enzimas o clulas libres o inmovilizadas, junto con los mezcladores, equipos de toma de muestra y aparatos de control. El reactor provee la unin central entre el lote de alimentacin inicial y el producto.

56

De acuerdo a las caractersticas de manejo del sustrato en el sistema los reactores se pueden clasificar en reactores de flujo continuo y flujo discontinuo o reactores en lotes.

3.5.6.6 Reactor semicontinuo (4): Consiste en colocar dentro de la columna de vidrio la enzima inmovilizada y la muestra de agua a tratar y dejar en contacto por un periodo de 24 horas, transcurrido ese tiempo se lee en el Spectronic 20 a 610 nm

3.6 LIOFILIZADO (16)

3.6.1 Caractersticas de la Liofilizacin La liofilizacin consiste en una desecacin del slido que contiene disolvente (generalmente agua). En primer lugar, el producto es congelado y, ms tarde, el disolvente ser eliminado por sublimacin a travs de un sistema de vaco. El slido, por ello, no pierde sus caractersticas originales. El producto resultante es un polvo liofilizado, que debe ser reconstituido en el momento de su utilizacin.

3.6.2 Etapas de la Liofilizacin Para efectuar la liofilizacin se siguen varias etapas: 1. Congelacin: Para conseguirla se somete el producto a temperaturas muy bajas (-20C), con la mayor rapidez posible para no modificar su estructura. 2. Desecacin primaria: Se realiza mediante un sistema de vaco que permite que el agua pase a gas por sublimacin a baja temperatura.

57

3. Desecacin secundaria: Consiste el eliminar la humedad residual del agua, fuertemente ligada, mediante evaporacin. 4. Rehidratacin del producto liofilizado.

3.6.3 El Liofilizador El liofilizador es un aparato en el que podemos distinguir una serie de partes: a) Cmara de liofilizacin o cmara de desecacin. En la que se encuentra unas bandejas huecas por las que transcurre el fluido calefactor o el refrigerante, y en las que se coloca el producto previamente congelado o no, dependiendo del liofilizador. El fluido refrigerante o calefactor se har pasar segn la fase del proceso en la que nos encontremos. b) Cmara de condensacin. Que dispone de una tubera fra (condensador) cuya funcin es enfriar el vapor de agua obtenido en la cmara de liofilizacin, quedando en forma de hielo adherido a sus paredes y evitando que ingrese en la cmara de vaco. c) Bombas de vaco. Se encuentran conectadas a las dos cmaras, de tal manera que, cuando comienza el proceso, se cierra la conexin con la cmara de liofilizacin, pero no con la de condensacin, para que as el vapor producido sea arrastrado al condensador. Por efecto del vaco, se producir sublimacin de hielo que pasa a vapor, con lo que el producto se va desecando progresivamente, descendiendo su temperatura. Por ello, es necesario aportar posteriormente calor a las placas.

58

Cuando se haya producido la sublimacin, su temperatura aumentar hasta igualar la de las placas calefactores y el vapor ser arrastrado al condensador.

Capitulo IV DISEO METODOLOGICO

60

4.0 DISEO METODOLOGICO 4.1 Tipo de Estudio El trabajo de investigacin se clasific como: Estudio retrospectivo: porque de bas en estudios anteriores Estudio prospectivo: ya que se explor posibilidades futuras basndonos en indicios presentes Estudio Experimental: porque se comprob el poder proteoltico de la papana.

4.2 Investigacin Bibliogrfica. - Biblioteca de la Facultad de Qumica y Farmacia de la Universidad de El Salvador. - Biblioteca Central de la Universidad de El Salvador. - Biblioteca de la Universidad Centroamericana Jos Simen Caas - Investigacin en Internet. - Investigacin en la Universidad Alberto Masferrer

4.3 Universo. Vertido de Aguas Residuales de Industrias Lcteas de la Ciudad de Aguilares Departamento de San Salvador.

4.4 Muestras Se recolecto 9 muestras de un litro de aguas residuales de las Industrias Lcteas.

61

4.5 Mtodos e instrumentos de recoleccin de datos. a) Llevar la prueba por duplicado para asegurar confiabilidad de los resultados. b) Espectrofotmetro Ultravioleta con = 280 nm c) Espectrofotmetro Spectronic 20 con = 610 nm. d) Liofilizador Testar Cryodos 50

4.6

Parte Experimental

4.6.1 Extraccin del ltex de papayo (Carica papaya) nacional (5) (Ver anexo 10 Figura 25) a) Sanitizar el rea de trabajo, limpiando con toalla el rea, luego agregar texapn lavando con mascn, lavar con agua destilada y por ultimo agregar cloruro de benzalconio dejando actuar por 10 minutos y secar con toalla. b) Sanitizar las papayas lavndolas con jabn luego con agua destilada, dejar que sequen solas (ver anexo 9 Fig. 14). c) Colocar mecheros alrededor del rea de trabajo para evitar la contaminacin. d) Hacer las incisiones en la papaya con un cuchillo de acero inoxidable teniendo el cuidado que no cortar el fruto. e) Recolectar el ltex en un beaker y luego trasladar a tubos previamente esterilizados, enfriar inmediatamente -20C y por un periodo entre 3 y 4 horas.

4.6.2 Liofilizacin de la enzima(28). (Ver Anexo 10 Figura 26) a) Encender el aparato liofilizador Testar Cryodos 0 hasta que la presin llegue a cero (Anexo 9 Fig. 16).

62

b) Transportar las muestras en Nitrgeno lquido al liofilizador. c) Colocar los tubos dentro de los balones y conectar a las vlvulas del

cilindro del condensador del aparato liofilizador (Anexo 9 Fig 17). d) Abrir las vlvulas con las que se efecta el vaco en el interior del recipiente comenzando la sublimacin de la muestra. e) Colocar uno por uno los balones teniendo el cuidado que la presin no baje. f) Una vez que todos los balones estn conectados, dejar en funcionamiento el equipo por un periodo de 4 a 5 horas hasta total desecacin. g) Almacenar en refrigeracin en frascos viales previamente esterilizados, dejarlos en refrigeracin (estas muestras tienen una duracin aproximadamente de 3 aos).

4.6.3 Inmovilizacin de la enzima(5). (Ver anexo 10 Figura 27) a) En una balanza granatara pesar 10 g de agar-agar. b) En un erlenmeyer de 250mL colocar Agar y adicionar 100mL de agua destilada. c) Calentar en bao de agua hasta completar disolucin, agitar constantemente. d) Esterilizar la solucin homognea en autoclave a 121C y 15 libras de presin por 15 minutos. e) Enfriar hasta 60C y mantener en bao Mara.

4.6.4 Mezcla enzima-soporte(5) ( Ver anexo 10 Figura 28 ) a) Pesar en balanza analtica 400 mg de la enzima papana.

63

b) Mezclar la enzima con la solucin de agar a 47C. c) Agitar vigorosamente por 3 minutos. d) Mantener la mezcla en bao de agua a 45C.

4.6.5 Moldeo de la enzima (5) (Ver anexo 10 Figura 29) a) Con una jeringa de 3.0cc dejar caer la mezcla agar-enzima en agua fra 5C, destilada estril formando esferas. b) Retirar las esferas del agua, lavar y obtener peso. c) Almacenar las esferas en una solucin de agua estril a 10C.

4.6.6 Ensayo general de actividad por el Mtodo Modificado de Kunitz(5) (Ver Anexo 6 figura 12) a) En cuatro tubos de ensayo, pipetear 1 mL de Sustrato de Casena ajustado a pH 9 (Con Acido ctrico 0.05M o Hidrxido sodio 0.2N). b) Etiquetar los tubos de la siguiente manera: E15, E0, I15, I0. c) Colocar los tubos en bao de agua a 40C y dejar reposar por 10 minutos. d) En el tubo E15 pipetear 1 mL de la solucin papana, agitar y colocar en el bao de agua. e) En el tubo I15 colocar una cantidad de enzima inmovilizada equivalente a 1 mL. f) Repetir el procedimiento anterior para el tubo vaco E0 el cual se le aade 1 mL de la solucin de papana y para el tubo I0 , se aade el equivalente de enzima inmovilizada. g) Incubar por 15 minutos.

64

h) Detener la reaccin adicionando 3 mL de solucin de cido tricloroactico a los tubos E15, E0, I15, I0, agitar despus de cada adicin. i) Aadir el contenido del tubos E0 en el tubo E0 y el tubo I0 en el tubo I0. j) Colocar los tubos en bao Mara a 40C durante una hora para permitir la coagulacin completa de la protena precipitada. k) Filtrar en papel filtro Whatman # 42. l) Leer las absorbancias de los filtrados a 280 nm y el blanco (solucin cido tricloroactico).

4.6.7 Recoleccin de la muestra(8) (ver anexo 30) a) Lavar los frascos de plstico de un litro dos o tres veces con el agua residual a recolectar. b) Tomar la muestra de agua residual en forma manual. c) Llenar el frasco por completo sin dejar espacios de aire. d) Identificar todas las muestras tomadas poniendo una etiqueta con la siguiente informacin: Fecha y hora de recoleccin, lugar de recoleccin, nombre de la persona que tomara la muestra, hora y anlisis a realizar. e) Almacenar en refrigeracin a 4C para conservar sus propiedades originales para su posterior anlisis.

NOTA: El periodo transcurrido entre la toma de muestra y su almacenamiento no debe sobrepasar las 6 horas.

65

4.6.8 Tratamiento de Aguas Residuales de vertido lcteo con la enzima papana inmovilizada(8) . Al tener las condiciones ptimas en la cual la enzima inmovilizada ejercer una mayor accin sobre las protenas se proceder de la siguiente manera: a) Colocar en una columna de vidrio 25.0g de enzima inmovilizada equivalente a la cantidad de enzima inmovilizada que se obtenga en 1 mL de solucin de papana. b) Tomar 50 mL de muestra de agua residual de lechera recolectada. c) Leer a una longitud de onda de 610 nm. d) Modificar el pH de la muestra, en donde se presente mayor actividad. e) Colocar dentro de la columna de vidrio 25 mL de agua residual de lechera a analizar. f) Concluidos los 15 minutos girar el regulador de flujo para extraer el agua residual tratada, y colectar en un beaker. g) Colocar el agua residual tratada dentro de la celda y leer a una longitud de onda de 610 nm. h) Seguir este procedimiento hasta que la enzima inmovilizada ya no actu sobre las protenas presentes en las aguas de vertido. i) Cuando la actividad de la enzima inmovilizada se vea disminuida se puede hacer un lavado con solucin buffer fosfato pH 6.0. j) Continuar con los tratamientos hasta que la actividad de la enzima se vea disminuida al mnimo o ya no presenta actividad

Capitulo V RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS

67

5.0 RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS La papana por ser una enzima de naturaleza proteica, factores como la temperatura y el pH son importantes ya que la desnaturalizan influyendo en su actividad. Como fue extrada en forma natural se fue necesario determinar su pH y temperatura ptima de actividad tanto cruda (sin tratamiento) como liofilizada libre e inmovilizada para luego ser comparada con una comercial.

5.1 Determinacin de pH optimo de actividad de la Enzima cruda libre e Inmovilizada Cuadro N 6: Resultados de las lecturas de la absorbancia de la enzima cruda libre e inmovilizada a 280 nm a 40C.
pH 5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0
0 15

E 0.185 0.085 0.180 0.076 0.102 0.130

E 0.270 0.579 0.254 0.110 0.343 0.147

15

I 0.226 0.255 0.103 0.062 0.196 0.323

I 0.243 0.962 0.282 0.221 0.306 0.332

15

E , E = Enzima en solucin 0 15 I ,I = Enzima Inmovilizada Clculos: Ver anexo 6.

Cuadro N 7: Actividad en Unidades Kunitz de la enzima libre e inmovilizada cruda a diferentes pH y a una temperatura constante de 40C. pH Sustrato
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0 UK: Unidades Kunitz Clculos: ver anexo 6

Actividad enzima cruda libre UK

0.28 x 10 4 1.65 x 10 4 0.25 x 10 4 0.11 x 10 4 0.80 x 10 4 0.06 x 10
4

Actividad enzima cruda inmovilizada UK

0.06 x 10 4 2.36 x 10 4 0.59 x 10 4 0.19 x 10 4 0.37 x 10 4 0.03 x 10
4

68

Cuadro N8: Porcentaje de actividad de enzima libre e inmovilizada cruda a diferentes pH y a una temperatura constante de 40C pH Sustrato
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0

Porcentaje de actividad Enzima cruda libre

16.97 100 15.15 5.67 48.49 3.64

Porcentaje de actividad Enzima cruda inmovilizada

2.54 100 25 22.46 15.68 1.27

120 100
% Actividad de Enzima

Enzima cruda libre

80 60 40 20 0 5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0

Enzima cruda inmovilizada

pH Figura N2: Grfica de porcentaje de actividad de enzima cruda libre e inmovilizada a diferente pH y a una temperatura constante de 40C

Interpretacin de Resultados: La figura N2 representa la grafica de porcentaje de actividad a diferentes pH, tanto la enzima cruda libre como la enzima cruda inmovilizada presentan un 100% de actividad a un pH 6.

69

5.2 Determinacin de Temperatura optima de la Enzima cruda libre e inmovilizada

Cuadro N 9: Absorbancias de enzima libre e inmovilizada cruda a 280 nm a pH 6.0 y a diferentes temperaturas Temperatura (C)
20 30 40 50 60 Clculos: ver anexo 6

E0
0.267 0.127 0.085 0.187 0.115

E15
0.313 0.236 0.579 0.207 0.130

I0
0.124 0.136 0.255 0.200 0.161

I15
0.242 0.236 0.962 0.279 0.200

Cuadro N 10: Actividad en Unidades Kunitz de la enzima cruda libre e inmovilizada a un pH= 6.0 a diferentes temperaturas. Temperatura (C)
20 30 40 50 60 UK: Unidades Kunitz Clculos: Ver anexo 6

Actividad enzima cruda libre UK

0.15 x 10 4 0.36 x 10 4 1.65 x 10 4 0.06 x 10 4 0.05 x 10
4

Actividad enzima natural inmovilizada UK

0.33 x 10 4 0.39 x 10 4 2.36 x 10 4 0.26 x 10 4 0.13 x 10
4

70

Cuadro N 11: Porcentaje de actividad de enzima cruda libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y a pH constante de 6. Temperatura (C)
20 30 40 50 60 Clculos: ver anexo 6

Porcentaje de actividad Enzima cruda libre

9.09 21.82 100 4.24 3.03

Porcentaje de actividad Enzima cruda inmovilizada

16.53 13.98 100 11.02 5.51

120

Enzima Cruda Libre Enzima Cruda Inmovilizada

% Actividad de Enzima

100 80 60 40 20 0 20 30 40 50

60

Temperatura C
Figura N3: Grafica de Porcentaje de actividad de enzima cruda libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y a pH constante de 6

Interpretacin de Resultados: La figura N 3 representa el porcentaje de actividad contra la variacin de la temperatura. Ambas presentan un 100% de actividad a una temperatura de 40C.

71

5.3 Determinacin de pH optimo de Enzima Liofilizada libre e Inmovilizada Cuadro N12: Resultados de las lecturas de la absorbancia de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a 280 nm a 40C. pH
5.0 6.0 7.0 Tr7.5 8.0 9.0
0 15

E0
0.173 0.140 0.124 0.084 0.194 0.154

E15
0.206 0.296 1.310 0.145 1.105 0.204

I0
0.259 0.109 0.270 0.216 0.289 0.240

I15
0.326 0.348 0.902 0.473 0.776 0.371

E , E = Enzima en solucin 0 15 I ,I = Enzima Inmovilizada Clculos: Ver anexo 6.

Cuadro N 13: Actividad de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferentes pH y a una temperatura constante de 40C. pH Sustrato
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0 UK: Unidades Kunitz

Actividad enzima liofilizada libre UK

0.11 x 10 4 0.52 x 10 4 3.95 x 10 4 0.20 x 10 4 3.04 x 10 4 0.17 x 10
4

Actividad enzima liofilizada inmovilizada UK

0.22 x 10 4 0.79 x 10 4 2.11 x 10 4 0.86 x 10 4 1.62 x 10 4 0.44 x 10
4

72

Cuadro N 14:Porcentaje de actividad de enzima Liofilizada libre e inmovilizada a diferentes pH y a una temperatura constante de 40C pH Sustrato
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0 Clculos: ver anexo 6

Porcentaje de actividad Enzima liofilizada libre

2.78 13.16 100 5.06 76.96 4.30

Porcentaje de actividad Enzima liofilizada inmovilizada

10.43 37.44 100 40.76 76.78 20.85

120 100

Enzima liof ilizada libre Enzima liof ilizada inmovilizada

% Actividad de Enzima

80 60 40 20 0 5.0 6.0 7.0

pH

7.5

8.0

Figura N4: Grafica de Porcentaje de actividad de enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferentes pH y a una temperatura constante de 40C.

Interpretacin de Resultados: La figura N4 representan las variaciones de pH contra el porcentaje de actividad de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a una temperatura constante de 40C ambas enzimas presentan dos mximos con un 100% de actividad a un pH 7 y un 76% a un pH de 8.0, por lo que a pH de 7.0 ser utilizada para los ensayos de temperatura optima de actividad.

73

5.4 Determinacin de Temperatura optima de la enzima liofilizada libre e Inmovilizada pH= 7.0 y a diferentes temperaturas

Cuadro N 15:Resultados de las lecturas de la absorbancia de la Enzima Liofilizada libre e inmovilizada a 280nm a pH 7.0 a diferente Temperatura Temperatura (C)
20 30 40 50 60 Clculos: ver anexo 6

E0
0.151 0.959 0.124 0.126 0.175

E15
0.260 0.963 1.310 0.380 0.313

I0
0.258 0.207 0.270 0.301 0.167

I15
0.463 0.363 0.902 0.335 0.338

Cuadro N 16: Actividad de la enzima liofilizada libre e inmovilizada a un pH= 7.0 a diferentes temperaturas. Temperatura (C)
20 30 40 50 60 UK: Unidades Kunitz Clculos: Ver anexo 6

Actividad enzima liofilizada libre UK

0.36 x 10 4 0.01 x 10 4 3.95 x 10 4 0.85 x 10 4 0.46 x 10
4

Actividad enzima liofilizada inmovilizada UK

0.68 x 10 4 0.52 x 10 4 2.11 x 10 4 0.11 x 10 4 0.57 x 10
4

74

Cuadro N 17: Porcentaje de actividad de enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y a pH constante de 7. Temperatura (C) Porcentaje de actividad Enzima liofilizada libre
9.11 0.25 100 21.52 11.65

Porcentaje de actividad Enzima liofilizada inmovilizada

32.23 24.64 100 5.21 27.01

20 30 40 50 60 Clculos: ver anexo 6

120

Enzima liofilizada libre Enzima Liofilizada Inmovilizada

% Actividad de Enzima

100 80 60 40 20 0 20 30 40
Temperatura C

50

60

Figura N5: Grafica de porcentaje de actividad de enzima liofilizada libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y a pH constante de 7

Interpretacin de Resultados La figura N5 muestra el porcentaje de actividad de las enzimas liofilizada libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y un pH constante de 7. Ambas enzimas a temperatura de 40C presentan un 100% de actividad.

75

5.5 Determinacin de pH ptimo de Enzima Comercial libre e Inmovilizada

Cuadro N18: Resultados de las lecturas de la absorbancia de la enzima comercial libre e inmovilizada a 280 nm a 30C. pH
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0
0 15

E0
0.126 0.064 0.042 0.032 0.046 0.040

E15
0.140 0.166 0.052 0.033 0.091 0.054

I0
0.153 0.103 0.100 0.083 0.188 0.110

I15
0.212 0.267 0.234 0.196 0.266 0.246

E , E = Enzima en solucin 0 15 I ,I = Enzima Inmovilizada Clculos: Ver anexo 6.

Cuadro N19: Actividad de la enzima comercial libre e inmovilizada a diferentes pH y a una temperatura constante de 30C. pH Sustrato
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0 UK: Unidades Kunitz

Actividad enzima comercial libre UK

0.05 x 10 4 0.34 x 10 4 0.03 x 10 4 0.003 x 10 4 0.15 x 10 4 0.05 x 10
4

Actividad enzima comercial inmovilizada UK

0.20 x 10 4 0.55 x 10 4 0.45 x 10 4 0.38 x 10 4 0.26 x 10 4 0.45 x 10
4

76

Cuadro N20: Porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferentes pH y a una temperatura constante de 30C pH Sustrato
5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0 Clculos: ver anexo 6

Porcentaje de actividad Enzima comercial libre

13.82 100 9.82 0.88 44.12 14.70

Porcentaje de actividad Enzima comercial inmovilizada

36.36 100 91.82 59.09 47.28 91.82

120

% Actividad de Enzima

Porcentaje de actividad Enzima comercial libre Porcentaje de actividad Enzima comercial inmovilizada

100 80 60 40 20 0 5 6 7 7.5 pH 8 9

Figura N6: Grfica de Porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferentes pH y a una temperatura constante de 30C.

Interpretacin de Resultados: La figura N6 muestra el porcentaje de actividad a diferente pH de la enzima Comercial libre e inmovilizada presentando un 100% de actividad por lo que se trabajo a este pH para posteriores ensayos. Adems la enzima comercial libre presenta 91.82% a pH 7 y 9.0.

77

5.6 Determinacin de Temperatura optima de la enzima comercial libre e inmovilizada.

Cuadro N 21: Absorbancias de enzima comercial libre e inmovilizada a 280 nm a pH= 6.0 y a diferentes temperaturas Temperatura (C)
20 30 40 50 60 Clculos: ver anexo 6

E0
0.089 0.064 0.081 0.137 0.081

E15
0.121 0.166 0.112 0.145 0.148

I0
0.111 0.153 0.150 0.135 0.150

I15
0.114 0.212 0.197 0.138 0.200

Cuadro N 22: Actividad de la enzima comercial libre e inmovilizada a un pH= 6 a diferentes temperaturas. Temperatura (C)
20 30 40 50 60 UK: Unidades Kunitz Clculos: Ver anexo 6

Actividad enzima comercial libre UK

0.11 x 10 4 0.34 x 10 4 0.10 x 10 4 0.03 x 10 4 0.22 x 10
4

Actividad enzima comercial inmovilizada UK

0.10 x 10 4 0.20 x 10 4 0.16 x 10 4 0.01 x 10 4 0.17 x 10
4

78

Cuadro N 23: Porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y a pH constante de 6. Temperatura (C) Porcentaje de actividad Enzima comercial libre
32.35 100 24.41 9.82 54.71

Porcentaje de actividad Enzima comercial inmovilizada

50.0 100 90.0 3.33 95.0

20 30 40 50 60

120 100

% Actividad de Enzima

Enzima comercial libre Enzima comercial inmovilizada

80 60 40 20 0 20 30 40 50 60

Figura N7: Grfica de Porcentaje de actividad de enzima comercial libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y a pH constante de 6

Interpretacin de Resultados La figura N7 muestra el porcentaje de actividad de la enzima comercial libre e inmovilizada a diferentes temperaturas y un pH 6 constante ambas enzimas presentan un 100% de actividad a una temperatura de 30C y una mnima actividad de 3.33 % a una temperatura de 50C, evidenciando la desnaturalizacin de la enzima

79

5.7 Comparacin de Enzima Cruda, Liofilizada y Comercial Libre

Cuadro N 24: Actividad de Enzima Cruda, Liofilizada y Comercial Libre pH Sustrato Actividad de Enzima Cruda Libre UK
0.28 x 10 4 1.65 x 10 4 0.25 x 10 4 0.11 x 10 4 0.80 x 10 4 0.06 x 10
4

Actividad de Enzima Liofilizada Libre UK

0.11 x 10 4 0.52 x 10 4 3.95 x 10 4 0.20 x 10 4 3.04 x 10 4 0.17 x 10
4

Actividad de Enzima Comercial Libre UK

0.05 x 10 4 0.34 x 10 4 0.03 x 10 4 0.003 x 10 4 0.15 x 10 4 0.05 x 10
4

5.0 6.0 7.0 7.5 8.0 9.0 Clculos: Ver anexos 6 x 10

4,5 4
4

Enzima Cruda Libre Enzima Liof ilizada Libre Enzima Comercial Libre

Actividad de Enzima

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 5.0 6.0 7.0

pH

7.5

8.0

9.0

Figura N 8: Grafica de Comparacin de actividad de la Enzima Cruda, Liofilizada y Comercial Libre.

Interpretacin de Resultados: En la Figura N8 se hizo una comparacin de las tres enzimas libres, donde se puede observar que la enzima cruda libre presenta 1.65 x 10 4 UK de actividad a un pH 6.0, la enzima liofilizada libre presenta dos mximos de actividad de 3.95 x 104 a un pH 7.0 y 3.04 x 104 a un pH 8.0, y la enzima comercial libre presenta su mximo de actividad de 0.17 x 104 a pH 9.0, donde se puede observar que la presenta una mayor actividad de las tres es la enzima liofilizada libre, la comercial es la que presenta una actividad muy baja.

80

5.8 Comparacin de Enzima Cruda, Liofilizada y Comercial Inmovilizada Cuadro N 25: Actividad de Enzima Cruda, Liofilizada y Comercial Inmovilizada pH Sustrato Actividad de Enzima Cruda Inmovilizada UK
4

Actividad de Enzima Liofilizada Inmovilizada UK

0.22 x 10 4 0.79 x 10 4 2.11 x 10 4 0.86 x 10 4 1.62 x 10 4 0.44 x 10
4

Actividad de Enzima Comercial Inmovilizada UK

0.20 x 10 4 0.55 x 10 4 0.45 x 10 4 0.38 x 10 4 0.26 x 10 4 0.45 x 10
4

5.0 0.06 x 10 4 6.0 2.36 x 10 4 7.0 0.59 x 10 4 7.5 0.19 x 10 4 8.0 0.37 x 10 4 9.0 0.03 x 10 Clculos: Ver anexos 6
2,5

x 10

Enzima Cruda Inmovilizada Enzima Liof ilizada Inmovilizada Enzima Comercial Inmovilizada

Actividad de Enzima

2 1,5

1 0,5

0 5.0 6.0 7.0 pH 7.5 8.0 9.0

Figura N 9: Grafica de Comparacin de actividad de la Enzima Cruda, Liofilizada y Comercial Inmovilizada.

Interpretacin de Resultados: En la Figura N9 se hizo una comparacin de las tres enzima inmovilizadas donde la enzima cruda inmovilizada presenta su mximo de actividad de 2.36 x 10 4 a pH 6.0, la enzima liofilizada presenta dos mximos de 2.11 x 104 a pH 7 y 1.62 x104 a pH 8.0, la enzima comercial su mximo fue de 0.45 x 104 a pH 9.0; la que presento mayor actividad de las tres fue la enzima cruda inmovilizada.

81

5.9 Determinacin del tiempo de actividad de la enzima papana cruda Inmovilizada en el Control de las aguas Residuales de Lecheras. Para la aplicacin de las enzimas en las aguas residuales de lechera se utilizo solamente la enzima cruda inmovilizada a un pH 6 y a una temperatura de 40C y se midi el tiempo que dura la enzima activa.

Cuadro N 26: Absorbancias antes y despus del tratamiento de agua residual de Lecheras con enzima cruda inmovilizada y actividad de la enzima Numero de muestra Tiempo (minutos) Actividad de enzima cruda inmovilizada
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 255 270 285 300 315 330 345 360 375 390 405 420 435 450 465 480 0.87 x 10 4 0.93 x 10 4 0.93 x 10 4 089 x 10 4 1.11 x 10 4 0.95 x 10 4 1.14 x 10 4 1.13 x 10 4 1.26 x 10 * 4 1.21 x 10 * 4 1.16 x 10 4 1.11 x 10 4 1.19 x 10 4 1.20 x10 4 1.12 x 10 4 1.14 x 10 4 1.12 x 10 4 1.06 x 10 4 1.01 x 10 4 0.84 x 10 ** 4 1.11 x 10 4 1.03 x 10 4 0.98 x 10 4 1.06 x 10 4 0.89 x 10 ** 4 0.99 x 10 4 1.11 x10 4 1.16 x 10 4 1.10 x 10 4 1.10 x 10 4 1.01 x 10 4 1.14 x 10
4

82

Cuadro N 26: Continuacin Numero de muestra

33 34 35 36 37 38

Tiempo (minutos)
495 510 525 540 555 570

Actividad de enzima cruda inmovilizada

1.15 x 104 1.14 x104 1.12 x 104 1.17 x 104 1.17 x104 1.17 x 104

Figura N 10: Grafica Actividad de la enzima cruda inmovilizada vrs tiempo en el tratamiento de las aguas Residuales de lecheras.

Interpretacin de Resultados La figura N10 representa la aplicacin de la enzima cruda inmovilizada sobre aguas residuales de vertidos lcteos. La enzima mantiene durante todo el proceso su actividad constante en las muestras 9 y 10 presentan una mayor actividad de 1.26 y 1.21 x 10-4 y las muestras 20 y 25 se redujo la actividad por lo que fue necesario realizarle lavados con buffer pH 6 mejorando la actividad y alargando el tiempo de actividad a 570 minutos.

83

5.10 Determinacin del tiempo de actividad de la enzima papana liofilizada Inmovilizada en el Control de las aguas Residuales de Lecheras. Para la aplicacin de las enzimas en las aguas residuales de lechera se utilizo solamente la enzima liofilizada inmovilizada a un pH 7 y a una temperatura de 40C y se midi el tiempo que dura la enzima activa

Cuadro N27: Absorbancias antes y despus del tratamiento de agua residual de Lecheras con enzima liofilizada inmovilizada y actividad de la enzima Numero de muestra Tiempo (minutos) Actividad de enzima liofilizada inmovilizada
1 2 3 4 5 *6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 **24 **25 26 **27 28 29 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 255 270 285 300 315 330 345 360 375 390 405 420 435 0.73 x 10 4 0.83 x 10 4 0.89 x 10 4 1.03 x 10 4 1.03 x 10 4 1.14 x 10 4 1.09 x 10 4 1.12 x 10 4 1.08 x 10 4 1.15 x 10 4 1.16 x 10 4 1.21 x 10 4 1.19 x 10 4 1.21 x 10 4 1.08 x 10 4 1.15 x 10 4 1.11 x 10 4 1.13 x 10 4 1.15 x 10 4 1.11 x 10 4 1.14 x 10 4 1.09 x 10 4 1.14 x 10 4 0.85 x 10 4 0.87 x 10 4 1.04 x 10 4 0.84 x 10 4 1.00 x 10 4 0.92 x 10
4

84

Cuadro N 27: Continuacin Numero de muestra

30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Tiempo (minutos)
450 465 480 495 510 525 540 555 570 585 600 615 630

Actividad de enzima liofilizada inmovilizada

0.91 x 10 4 0.94 x 10 4 0.94 x 10 4 1.02 x 10 4 1.00 x 10 4 1.02 x 10 4 1.03 x 10 4 0.96 x 10 4 0.97 x 10 4 1.00 x 10 4 1.03 x 10 4 1.03 x 10 4 1.03 x 10
4

X 10

5 6

Figura N 11: Grafica de Actividad de la enzima liofilizada inmovilizada vrs tiempo en el tratamiento de las aguas residuales de lecheras.

85

Interpretacin de Resultados La figura N11 representa la aplicacin de la enzima papana liofilizada

inmovilizada en el control de las aguas residuales de lechera. La enzima mantiene en la muestra 12 y 14 su mayor actividad de 1.21 x 10-4 y en las muestras 24, 25 y 27 sufre una disminucin de la actividad por lo que fue necesario los lavados buffer con pH 7.0 alargando el tiempo de actividad de 630 minutos. La enzima cruda presenta mayor actividad de 1.26 x 10 -4 y la liofilizada con 1.21, con la ventaja de que la liofilizada presenta un mayor tiempo de actividad de 630 minutos contra 570 minutos de la enzima cruda. Podemos decir que la enzima liofilizada adems de presentar mayor actividad contra la enzima cruda tiene la ventaja de tener ms vida til para el tratamiento de las aguas residuales.

Capitulo VI CONCLUSIONES

87

6.0 CONCLUSIONES

1. Las papayas cultivadas en El Salvador presentaron mayor cantidad de enzima papana que las papayas importadas.

2. Los factores de pH y temperatura desnaturalizan a las protenas como la papana por lo que fue necesario determinar pH y temperatura optima a base de prueba y error.

3. Al comparar la enzima liofilizada con la enzima comercial el proceso de liofilizacin mejoro la actividad de la enzima liofilizada por lo que su mayor actividad fue de 2.11 x 10-4 a 40C, y a un pH 7.0; en cambio la enzima comercial su mximo no as con la enzima comercial que su mximo de actividad fue 0.55 x 10-4 a 30C y a un pH 6.0.

4. El proceso de liofilizacin es un mtodo que ayudo a que el producto resultante (polvo), manejado fcilmente y con un mayor tiempo de vida til.

5. Las enzimas papana cruda y liofilizada presentan mayor actividad debido a los componentes principales : Papana, Quimiopapana y Lisozima, que la enzima comercial que presento menor actividad debido a que solo contiene un componente: Papana.

88

6. El reactor semicontinuo es el indicado en el tratamiento de las aguas residuales, debido a que las protenas son megamolculas, y la enzima papana necesita ms tiempo para que realicen su funcin catalizadora.

7. Con los resultados obtenidos se confirm que la enzima papana cruda y liofilizada inmovilizada en gel de agar disminuye la actividad proteica por lo que puede ser utilizada en el tratamiento de aguas residuales de la Industria lechera.

Captulo VII RECOMENDACIONES

90

7.0 RECOMENDACIONES

1. Extraer la enzima de la papaya hacerlo en un lugar esterilizado, lavando bien la papaya con agua y jabn y luego con agua destilada porque la enzima es fcilmente degradada por microorganismos.

2. Utilizar papayas sazonas cultivadas en el pas por su mayor contenido de ltex.

3. Que en la extraccin de la enzima papana se debe utilizar materiales de acero inoxidable para evitar que el hierro que es un inhibidor degrade a la enzima papana y evitar su contaminacin.

4. Que la enzima papana se extrae haciendo incisiones no profundas en fruto de la papaya aun cuando se encuentre en la planta.

5. Almacenar

la enzima papana en viales

previamente esterilizados

almacenarlo en refrigeracin para que la enzima tenga un mayor tiempo de actividad.

6. Realizar el moldeo la mezcla enzima-soporte con el agar-agar

debe

mantenerse a temperatura constante de 45C para evitar la formacin de grumos.

91

7. Almacenar la enzima papana despus de cada tratamiento de las aguas residuales, lavar enzima con agua destilada estril

8. Realizar otras investigaciones utilizando la enzima papana en otro tipo de aguas residuales de la industria alimentara.

9. Promover la industrializacin de produccin de enzima papana para darle un mayor agregado al cultivo de este fruto y as generar ms fuentes de trabajo e ingreso de divisas por la exportacin de esta enzima.

10 Tratar las aguas residuales de las industrias lecheras con la enzima papana liofilizada inmovilizada antes de ser descartadas a los ros para ir disminuyendo la contaminacin de las aguas que estas industrias genera.

11 Realizar otras investigaciones para un mejor manejo en el mtodo de extraccin de la enzima papana.

12 Utilizar el mtodo de liofilizacin para obtener un mayor tiempo de vida til.

13 Continuar con la investigacin de la enzima papana para determinar qu cantidad puede ser utilizada para tratar las aguas de residuales de lecheras a nivel industrial.

BIBLIOGRAFIA
1 Albrecht, K., 1996. Papain, Departament of Chemistry. UWEC Wisconsin, United Status. Url: www.chem.uwec.edu/chem406/webpages/KAREN/Facts. html.

2 Boyer, Paul D. 1970. The Enzymes, 3dt Edition. New Cork, United States of Amrica, Academia Press Inc. Vol III.

3 Burke D, Lewis S. Shafer. J.A. 1974 Two Step Procedure for Purification of papain from extract of papaya latex, Archieves of Biochemistry and Biophysics,

4 Centro de Comercio Internacional, 1965. Anlisis del Mercado de la papana en los principales pases importadores de la Europa Occidental, Ginebra

5 Chavz Crisonino P., 1981. Estudio de Prefactibilidad para una planta de Papana refinada, El Salvador, Trabajo de Graduacin, Facultad de Ingeniera, Universidad Centroamericana Jos Simen Caas.

6 Chang-Tren Ch, 1980. Comunicacin Verbal. Centro Nacional de Tecnologa Agropecuaria (CENTA).

7 Cuadra Zelaya, T.E. 2000. Normalizacin de la Enzima papana inmovilizada por la Tcnica de atropamiento en gel, Trabajo de Graduacin, Facultad de Qumica y Farmacia, Universidad de El Salvador.

8 Garca Vctor, Roldan Edwin, 2005, Ensayo de actividad de la enzima papana inmovilizada y su aplicacin en las aguas residuales de la Industria Alimenticia, Facultad de Qumica y Farmacia, Universidad de El Salvador.

9 Gutirrez J.R. 1974. Papain: Isolation, Propierties and aplications Trabajo no publicado, basado en libros referentes a papana de diversos autores, presentado en materia de Enzyme Applications en Kansas Statu University.

10 Hartmeies, W 1985. Inmovilized biocatalysts: from simple to complex systems, trines biotechnology.

11 Hultin, H.D., 1983 Current and Potential uses of Inmovilizad Enzymes, Food Technology Magazine, Vol. 37 N 10.

12 Instituto Salvadoreo de Fomento Industrial (INSAFI) 1971, Extraccin de Papana

13 Instituto Salvadoreo de Fomento Industrial (INSAFI) 1991, Extraccin de Papana

14 Kirk, R.E., 1961. Enciclopedia de Tecnologa Qumica [Tr. Oscar G. Carrera, etc Al.]

15 Madrigal L. 1978. Efecto de algunas variables sobre el rendimiento de papana cruda. Tesis de Grado, Universidad de Costa Rica.

16 Marrero M. y otros 1977. Obtencin Industrial de papana purificada a partir del ltex del fruto de la Carica papaya Revista Cubana de Farmacia,

17 Martnez , K. y otro 1 987. Inmovilization of enzymes; an approach to fundamental studies in biochemistry.

18 Ortiz A. 1978. Estudios sobre la actividad proteoltica y secado del ltex de la papaya (Carica papaya) en Costa Rica, Tesis Grado, Universidad de Costa Rica.

19 Perlman, G.E., Lazlo L. 1970. Methods in enzymologist 1 Ed. New York, USA, Academia Press, Vol XIV.

20 Proyecto PNUD-ONUDI. 1979. Estudio de factibilidad para una empresa de produccin de ltex de papaya y de papana refinada.

21 Taylor, R.F. 1991. Protein inmovilization; Fundamentals and applications, Marcel Dekker; New York.

22 Tainter M.L., 1951. et al. Papain, Analysis of the New York Academy of Science. Vol 54.

23 Zabosrsky, O. 1973. Inmovilizad enzymes, 1 Edition, Cleveland, Ohio, USA, CRC, Press Inc.

24 Wingard, L.B 1972, Enzyme Engineering, Interscience Publishers, New York. 25 Zismeg J.1952. El papayo Ediciones Oriente, 1 ed. Mxico 26 www. Contaminaciondelagua.htm 27 www.inmovilizacion,com,pdf 28 www.liofilizacion.com 29 www.lapapaya-monografias.com.htm 30 http/www.monografias.com/trabajos10/09tecenz.html 31 www.papaya.com 32 www.suerodeleche.com

ANEXOS

ANEXO N 1
Cuadro N28: FORMATO DE RECOLECCION DE DATOS DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA INMOVILIZADA N de muestra 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (das) Volumen tratado (mL) Absorbancia previa al tratamiento Absorbancia despus del tratamiento

ANEXO N 2
Cuadro N 29: PREPARACION DE REACTIVOS PARA EL ENSAYO DE ACTIVIDAD. REACTIVO
Sustrato de Casena

MATERIALES
a) 1 g de Casena b) Solucin de Fosfato Trisdico 2 g/L. c) Agua Endurada a 30DH.

PROCEDIMIENTO
1) Disolver la Casena en 50 mL de Solucin de Fosfato Trisdico. 2) Ajustar el pH a 9.0 o al pH requerido con cido ctrico 0.05M o NaOH 0.2N. 3) Calentar por 15 minutos en agua hirviendo, enfriar a temperatura ambiente. 4) Colocar la solucin en un baln volumtrico de 100.0 mL y aforar con agua endurada a 30DH. 5) Ajustar el pH 9.0 o al pH requerido con acido ctrico 0.05M o NaOH 0.2N. Disolver el Cloruro de Calcio dihidratado y el Cloruro de magnesio hexahidratado en 1 Litro de agua destilada o buffer fosfato de pH requerido. Disolver el Fosfato de Sodio dodecahidratado en 1 Litro de agua destilada o buffer al pH requerido.

Agua endurada artificialmente a 30DH

Solucin de Fosfato Trisdico 2g/L

Agua endurada artificialmente a 15DH

Solucin de Fosfato Trisdico 2g/L en agua endurada a 15DH Solucin Acido Tricloroactico

a) 0.630g de CaCl2.2H2O. b) 0.466g de MgCl2. 6H20. c) 1 Litro de agua destilada o buffer a pH requerido. a) 4.63g de Na3PO4.12H2O. b) 1 Litro de agua destilada o buffer fosfato a pH requerido a) 0.315 g de CaCl2.2H2O. b) 0.233 g de MgCl2. 6H20. c) 1 Litro de agua destilada o buffer fosfato a pH requerido. a) 9.26 g de Na3PO4.12H2O. b) 1 Litro de agua endurada a 15 DH a) 5 g de cido tricloroactico. b) 100 mL de agua destilada.

Disolver el Cloruro de Calcio y el Cloruro de magnesio en 1 litro de agua destilada o buffer fosfato a pH requerido.

Disolver el Fosfato de Sodio en 1 Litro de agua endurada a 15DH y ajustar a pH requerido con cido ctrico 0.05M. Disolver el cido tricloroactico en agua y diluir a 100.0 mL.

ANEXO N 3
Cuadro N 30: PREPARACION DE BUFFER FOSFATO A pH 5.5, 6.0, 7.0, 7.5 y 8.0 REACTIVO
Fosfato de Potasio Monobsico 0.2M Buffer Fosfato pH 5.5

MATERIALES
a) 23.22 de KH2PO4. b) Agua libre de CO2. a) 50 mL de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2 M. b) 3.3 mL de NaOH 0.2N c) Agua libre de CO2. a) 50 mL de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2 M. b) 5.6 mL de NaOH 0.2N c) Agua libre de CO2. a) 50 mL de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2 M. b) 40.7 mL de NaOH 0.2N c) Agua libre de CO2. a) 50 mL de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2 M. b) 46.1 mL de NaOH 0.2N c) Agua libre de CO2.

PROCEDIMIENTO
Disolver el KH2PO4 en agua libre de CO2 y aforara a 1000.0 mL. Colocar la solucin de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2M en un baln volumtrico de 200.0 mL, agregar el NaOH indicado y aforar con agua libre de CO2. Colocar la solucin de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2M en un baln volumtrico de 200.0 mL, agregar el NaOH indicado y aforar con agua libre de CO2. Colocar la solucin de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2M en un baln volumtrico de 200.0 mL, agregar el NaOH indicado y aforar con agua libre de CO2. Colocar la solucin de Fosfato de Potasio Monobsico 0.2M en un baln volumtrico de 200.0 mL, agregar el NaOH indicado y aforar con agua libre de CO2.

Buffer Fosfato 6.0

pH

Buffer Fosfato 7.5

pH

Buffer Fosfato 8.0

pH

ANEXO N 4 DETERMINACION DE LA CANTIDAD ENZIMA INMOVILIZADA EQUIVALENTE A 1 mL DE SOLUCION DE PAPAINA. NATURAL

Como se determin la cantidad a pesar de enzima inmovilizada equivalente a la solucin de papana. 1. 2. Pesar la mezcla enzima-soporte, ya inmovilizada Determinar el peso de la enzima papana, presente en un mL de la solucin de papana. 3. Determinar la cantidad a pesar de mezcla enzima soporte equivalente al peso en 1 mL de solucin de papana. PROCEDIMIENTO: 1. 2. Peso mezcla enzima soporte = 44.0g 0.015g papana X X= 0.0003 g enzima en 1 mL 50.0 mL de agua 1.0 mL de agua

3.

1.2 g enzima a inmovilizar 0.0003 g enzima en 1 mL

44.0 g peso mezcla-soporte X

X= 0.011 g de enzima inmovilizada NOTA: Se pesa 0.011 g de la mezcla enzima soporte, en el cual se encuentra un equivalente de 0.0003g de papana.

ANEXO N 5 DETERMINACION DE LA CANTIDAD ENZIMA INMOVILIZADA LIOFILIZADA EQUIVALENTE A 1 mL DE SOLUCION DE PAPAINA.

Como se determin la cantidad a pesar de enzima inmovilizada equivalente a la solucin de papana. 1. Pesar la mezcla enzima-soporte, ya inmovilizada 2. Determinar el peso de la enzima papana, presente en un mL de la solucin de papana. 3. Determinar la cantidad a pesar de mezcla enzima soporte equivalente al peso en 1 mL de solucin de papana.

PROCEDIMIENTO: 1. Peso mezcla enzima soporte = 40.8 g 2. 0.015g papana X X= 0.0003 g enzima en 1 mL 3. 1.2 g enzima a inmovilizar 0.0003 g enzima en 1 mL X= 0.010 g de enzima inmovilizada NOTA: Se pesa 0.010 g de la mezcla enzima soporte, en el cual se encuentra un equivalente de 0.0003g de papana. 40.8 g peso mezcla-soporte X 50.0 mL de agua 1.0 mL de agua

ANEXO N 6 Clculos para el mtodo modificado de kunitz

Anexo N6 Clculos para el Mtodo Modificado de Kunitz

Actividad enzima solucin E15 E0 x 104 C

E15 = Absorbancia despus de 15 minutos E0 = Absorbancia inicial C= Concentracin solucin enzimtica original en mg/mL 104 = Constante del mtodo

Actividad enzima inmovilizada I15 I0 x 104 C

I15 = Absorbancia despus de 15 minutos I0 = Absorbancia inicial C= Concentracin solucin enzimtica original en mg/mL 104 = Constante del mtodo

Figura N12 Diagrama del mtodo modificado de kunitz.

Modelo de clculos de actividad Actividad de la enzima natural libre e inmovilizada a diferentes pH a temperatura constante de 20C. pH 5.0 Solucin E15 E0 x 104 = C I15 I0 x 104 = C 0.664 0.212 = 1.506 x 104 0.3 mg/mL 0.235 0.293 = 0.080 x 104 0.3 mg/mL

Inmovilizada

pH 6.0 Solucin E15 E0 x 104 = C I15 I0 x 104 = C 0.313 0.267 = 0.153 x 104 0.3 mg/mL 0.242 0.124 = 0.393 x 104 0.3 mg/mL

Inmovilizada

pH 7.0 Solucin E15 E0 x 104 = C I15 I0 x 104 = C 0.162 0.158 = 0.013 x 104 0.3 mg/mL 0.156 0.143 = 0.043 x 104 0.3 mg/mL

Inmovilizada

pH 7.5 Solucin E15 E0 x 104 = C I15 I0 x 104 = C 0.150 0.091 = 0.200 x 104 0.3 mg/mL 0.211 0.202 = 0.03 x 104 0.3 mg/mL

Inmovilizada pH 8.0

Solucin

E15 E0 x 104 = C I15 I0 x 104 = C

0.225 0.134 = 0.303 x 104 0.3 mg/mL 0.357 0.164 = 0.643 x 104 0.3 mg/mL

Inmovilizada

pH 9.0 Solucin E15 E0 x 104 = C I15 I0 x 104 = C 0.203 0.176 = 0.090 x 104 0.3 mg/mL 0.289 0.153 = 0.453 x 104 0.3 mg/mL

Inmovilizada

Clculos para determinar porcentaje de actividad 1. Se toma el mayor valor de la actividad como 100% Para enzima libre es 1.506 x 104 Para enzima inmovilizada es 0.643 x 104

2.

Por regla de tres se determinara el porcentaje a cada pH Ej: 1.506 x 104 0.153 x 104 100% x X = 10.16% de enzima libre 0.643 x 104 0.080 x 104

100% x X = 12.44% de enzima inmovilizada

ANEXO N 7 Resultados de lecturas de La enzima cruda, liofilizada y comercial.

Anexo N7: Resultados de lecturas de La enzima cruda, liofilizada y comercial. Cuadro N31: Resultados de Enzima Libre, Liofilizada y Comercial libre e inmovilizada a pH 5
Temperatura 20C Absorbancia 15 E Solucin de papana natural 15 E Solucin de papana Liofilizada 15 E Solucin de papana comercial 0' E Solucin de papana natural 0' E Solucin de papana Liofilizada 0' E Solucin de papana comercial 15 I Enzima inmovilizada natural 15 I Enzima inmovilizada liofilizada 15 I Enzima inmovilizada comercial 15 I Enzima natural 15 I Enzima liofilizada 15 I Enzima comercial 0' I Enzima inmovilizada natural 0 I ' Enzima inmovilizada liofilizada 0 I ' Enzima inmovilizada comercial 0' I Enzima natural 0' I Enzima liofilizada 0' I Enzima comercial 0.664 0.293 0.187 0.212 0.245 0.110 0.235 0.413 0.290 0.397 0.387 0.231 0.209 0.217 0.206 0.245 0.281 0.142 30C 0.218 0.421 0.140 0.192 0.268 0.126 0.349 0.253 0.267 0.610 0.344 0.245 0.199 0.226 0.103 0.292 0.314 0.145 40C 0.270 0.206 0.153 0.185 0.173 0.136 0.243 0.326 0.248 0.392 0.383 0.189 0.226 0.259 0.181 0.240 0.298 0.170 50C 0.194 0.228 0.270 0.167 0.192 0.174 0.745 0.171 0.213 0.173 0.258 0.197 0.197 0.162 0.092 0.160 0.237 0.093 60C 0.218 0.201 0.267 0.204 0.173 0.109 0.261 0.252 0.152 0.270 0.547 0.147 0.224 0.211 0.148 0.245 0.452 0.140

Cuadro N32: Resultados de Enzima Libre, Liofilizada y Comercial libre e inmovilizada a pH 6

Temperatura 20C Absorbancia 15 E Solucin de papana natural 15 E Solucin de papana Liofilizada 15 E Solucin de papana comercial 0' E Solucin de papana natural 0' E Solucin de papana Liofilizada 0' E Solucin de papana comercial 15 I Enzima inmovilizada natural 15 I Enzima inmovilizada liofilizada 15 I Enzima inmovilizada comercial 15 I Enzima natural 15 I Enzima liofilizada 15 I Enzima comercial 0' I Enzima inmovilizada natural 0 I ' Enzima inmovilizada liofilizada 0 I ' Enzima inmovilizada comercial 0' I Enzima natural 0' I Enzima liofilizada 0' I Enzima comercial 0.313 1.019 0.121 0.267 0.138 0.089 0.236 0.318 0.114 0.560 1.226 0.135 0.136 0.244 0.111 0.194 0.209 0.111 30C 0.236 1.063 0.166 0.127 0.177 0.064 0.242 0.162 0.212 0.678 1.432 0.211 0.124 0.129 0.153 0.252 0.188 0.163 40C 0.579 0.296 0.112 0.085 0.140 0.081 0.962 0.348 0.197 0.961 1.463 0.196 0.255 0.109 0.150 0.045 0.143 0.109 50C 0.207 0.983 0.145 0.187 0.106 0.137 0.279 0.303 0.138 1.554 1.757 0.154 0.200 0.299 0.135 0.245 0.160 0.115 60C 0.130 0.112 0.148 0.115 0.123 0.081 0.200 0.219 0.210 1.297 1.363 0.152 0.161 0.141 0.150 0.311 0.145 0.133

Cuadro N33: Resultados de Enzima Libre, Liofilizada y Comercial libre e inmovilizada a pH 7

Temperatura 20C Absorbancia 15 E Solucin de papana natural 15 E Solucin de papana Liofilizada 15 E Solucin de papana comercial 0' E Solucin de papana natural 0' E Solucin de papana Liofilizada 0' E Solucin de papana comercial 15 I Enzima inmovilizada natural 15 I Enzima inmovilizada liofilizada 15 I Enzima inmovilizada comercial 15 I Enzima natural 15 I Enzima liofilizada 15 I Enzima comercial 0' I Enzima inmovilizada natural 0 I ' Enzima inmovilizada liofilizada 0 I ' Enzima inmovilizada comercial 0' I Enzima natural 0' I Enzima liofilizada 0' I Enzima comercial 0.162 0.260 0.144 0.157 0.151 0.069 0.156 0.463 0.284 1.858 1.713 0.159 0.143 0.258 0.198 0.193 0.265 0.146 30C 0.375 0.963 0.052 0.344 0.959 0.042 0.359 0.363 0.234 1.698 1.110 0.239 0.342 0.207 0.100 0.329 1.047 0.232 40C 0.254 1.310 0.084 0.180 0.124 0.061 0.282 0.902 0.168 0.950 1.753 0.205 0.103 0.270 0.155 0.258 0.157 0.089 50C 0.257 0.380 0.070 0.227 0.126 0.069 0.346 0.335 0.276 0.512 1.323 0.119 0.278 0.301 0.181 0.285 0.308 0.085 60C 0.236 0.313 0.168 0.228 0.175 0.158 0.263 0.338 0.252 0.798 1.595 0.363 0.184 0.167 0.225 0.302 0.191 0.264

Cuadro N34: Resultados de Enzima Libre, Liofilizada y Comercial libre e inmovilizada a pH 8

Temperatura 20C Absorbancia 15 E Solucin de papana natural 15 E Solucin de papana Liofilizada 15 E Solucin de papana comercial 0' E Solucin de papana natural 0' E Solucin de papana Liofilizada 0' E Solucin de papana comercial 15 I Enzima inmovilizada natural 15 I Enzima inmovilizada liofilizada 15 I Enzima inmovilizada comercial 15 I Enzima natural 15 I Enzima liofilizada 15 I Enzima comercial 0' I Enzima inmovilizada natural 0 I ' Enzima inmovilizada liofilizada 0 I ' Enzima inmovilizada comercial 0' I Enzima natural 0' I Enzima liofilizada 0' I Enzima comercial 0.150 0.200 0.139 0.091 0.109 0.118 0.211 0.502 0.328 0.592 1.300 0.148 0.202 0.148 0.117 0.189 0.103 0.070 30C 0.153 0.869 0.033 0.098 0.127 0.032 0.179 0.407 0.196 1.265 1.687 0.220 0.174 0.219 0.083 0.164 0.158 0.101 40C 0.110 0.145 0.154 0.076 0.084 0.125 0.221 0.473 0.198 0.772 0.607 0.162 0.062 0.216 0.160 0.167 0.057 0.017 50C 0.181 0.202 0.074 0.136 0.169 0.048 0.248 0.391 0.143 0.903 1.720 0.162 0.163 0.188 0.093 0.280 0.358 0.070 60C 0.170 0.239 0.156 0.139 0.110 0.138 0.323 0.500 0.294 1.488 1.392 0.267 0.228 0.260 0.135 0.283 0.247 0.179

Cuadro N35: Resultados de Enzima Libre, Liofilizada y Comercial libre e inmovilizada a pH 9

Temperatura 20C Absorbancia 15 E Solucin de papana natural 15 E Solucin de papana Liofilizada 15 E Solucin de papana comercial 0' E Solucin de papana natural 0' E Solucin de papana Liofilizada 0' E Solucin de papana comercial 15 I Enzima inmovilizada natural 15 I Enzima inmovilizada liofilizada 15 I Enzima inmovilizada comercial 15 I Enzima natural 15 I Enzima liofilizada 15 I Enzima comercial 0' I Enzima inmovilizada natural 0 I ' Enzima inmovilizada liofilizada 0 I ' Enzima inmovilizada comercial 0' I Enzima natural 0' I Enzima liofilizada 0' I Enzima comercial 0.225 0.852 0.096 0.134 0.151 0.080 0.357 0.253 0.156 1.237 1.449 0.215 0.164 0.168 0.110 0.223 0.178 0.108 30C 0.240 0.857 0.091 0.191 0.142 0.046 0.310 0.352 0.266 0.894 1.456 0.218 0.150 0.325 0.188 0.236 0.146 0.186 40C 0.343 1.105 0.093 0.102 0.194 0.036 0.306 0.776 0.120 1.590 0.392 0.090 0.196 0.289 0.102 0.409 0.250 0.079 50C 0.226 0.632 0.067 0.112 0.163 0.056 0.284 0.463 0.149 1.293 1.683 0.131 0.203 0.167 0.127 0.213 0.161 0.084 60C 0.155 0.525 0.126 0.142 0.125 0.072 0.190 0.372 0.183 1.467 1.480 0.169 0.143 0.209 0.145 0.248 0.144 0.054

ANEXO N 8
Material, reactivos y equipo de laboratorio

Anexo N 8 Material, Reactivos y Equipo de Laboratorio Guantes Gabacha Mallas de asbesto Aro metlico Pinzas de sostn Pinzas de extensin Soporte Cuchillos de acero Inoxidable Esptulas Microesptulas Gradilla Papel de empaque Papel Whatman # 42 Goteros Perillas Hielera Mechero Bunsen Papel pH Jeringa de hemodilisis de 3cc Termmetro Embudos de vidrio Erlenmeyer de 100mL, 250mL, 1000 mL

Pipetas volumtricas de 1mL y 3mL Tubos de ensayo con rosca Columna de vidrio Baln volumtrico de 25.0mL, 50.0mL, 100.0mL y 200.0mL Agitadores de vidrio Beaker de 30mL, 50mL, 100mL, 250mL y 1000mL Probetas de vidrio de 10mL, 25mL y 100Ml

REACTIVOS Texapn Cloruro de benzalconio Alcohol isoproplico Agar-agar Casena Fosfato trisdico Hidrxido de sodio Acido ctrico Cloruro de calcio dihidratado Cloruro de magnesio hexahidratado Fosfato de sodio dodecahidratado Acido tricloroactico Fosfato de sodio monobsico Agua estril

Agua destilada

EQUIPOS Bao Maria Balanza Granataria y Analtica Incubadora Autoclave Estufa Espectrofotmetro Spectronic 20 Ultravioleta visible Liofilizador Cryodos 50 Freezer

ANEXO N 9 Fotografas del diseo metodolgico.

ANEXO N 9. Fotografas del diseo metodolgico

Extraccin del ltex de papayo (Carica papaya)

Figura N13: Sanitizacin del rea de Trabajo

Figura N14: Sanitizar las Papaya con agua y jabn y dejar secar.

Figura N15: Incisiones en la Papaya y recolectarla en tubos estriles

Liofilizacin de la Enzima Papana

Figura 16. Aparato Liofilizador Cryodos-50

Figura N17: Conectar los Balones al Liofilizador Testar Cryodos-50

Inmovilizacin de Enzima Papana

Figura N18: Moldeo de la Enzima Papana

Ensayo de Actividad por el Mtodo Modificado de Kunitz

Figura N19: Los tubos que contienen la Enzima Papana en Bao Maria para permitir la coagulacin completa de la protena precipitada.

Figura 20: Filtrar en papel filtro Whatman # 42

Figura N21: Leer las absorbancias de filtrados a 280 nm en el Espectrofotmetro Ultravioleta- Visible

Recoleccin de la Muestra

Figura N22: Agua Residual (Suero) recolectada en Aguilares

Figura N23: Frascos que se utilizaron para la recoleccin de la muestra

Anlisis de la Muestra

Figura N 24: Reactor utilizado para el tratamiento de las aguas residuales utilizando el mtodo semicontinuo.

ANEXO N 10 Esquemas del diseo metodolgico.

ANEXO N 10 Esquemas del diseo metodolgico EXTRACCION DEL LATEX DE PAPAYO

Sanitizar el rea de trabajo

Sanitizar las papayas

Colocar mecheros en el rea de trabajo

Congelar la muestra a -20C

Recolectar el ltex

Hacer incisiones en la papaya

Figura N 25: Esquema de Extraccin del ltex de papayo

LIOFILIZACION DE LA ENZIMA PAPAINA Encender el aparato Liofilizador Transportar las muestras al liofilizador Colocar los tubos dentro de los balones

Dejar en funcionamiento el equipo hasta su total desecacin del producto

Colocar uno por uno los balones

Abrir las vlvulas del Liofilizador

Despus de terminar el liofilizado recolectar el polvo obtenido en viales esterilizados Figura N 26: Esquema de Liofilizacin de la Enzima Papana

INMOVILIZACION DE LA ENZIMA PAPAINA

Pesar 10g de Agar-Agar

Adicionar 100 mL de agua destilada

Calentar el bao de agua hasta completa disolucin

Enfriar hasta 60C y mantener en Bao Maria

Esterilizar la solucin homognea en autoclave

Figura N27: Esquema de Inmovilizacin de la Enzima Papana

MEZCLA ENZIMA-SOPORTE

Pesar 400mg de la enzima papana

Mezclar la enzima con la solucin de agar a 47 C

Mantener en Bao de agua a 45C

Agitar vigorosamente por 3 minutos

Figura N28: Esquema de Mezcla Enzima-Soporte

MOLDEO DE LA ENZIMA

Agregar la mezcla enzimasoporte sobre agua destilada estril a 5C utilizando jeringas de 30cc

Dejar caer las gotas de la mezcla, formando esferas.

Almacenar las esferas en una solucin de agua estril a 10C

Retirar las esferas del agua, lavar y obtener peso

Figura N29: Esquema de Moldeo de la Enzima RECOLECCION DE LA MUESTRA (SUERO)

Sanitizar los frascos de plstico

Lavar el frasco dos o tres veces con el agua a recoger

Llenar el frasco por completo sin dejar espacios de aire.

Almacenar en refrigeracin a 4C. El periodo transcurrido entre la toma de muestra y su almacenamiento no debe sobrepasar las 6 horas.

Etiquetar las muestras

Figura N30: Esquema de recoleccin de la Muestra (suero)