RESUMEN La corriente de difusin de las aplicaciones de los nanomateriales apoya la bsqueda de nuevas posibles funciones de las partculas diminutas

tesis. La potencialidad antibacteriana de xido de zinc (ZnO), nanopartculas (NP), en comparacin con el convencional de polvo de ZnO, contra nueve cepas bacterianas transmitidas por los alimentos, en su mayora incluidos los agentes patgenos, se evalu mediante pruebas cualitativas y cuantitativas. ZnO NP fue ms eficaz como agente antibacteriano que el polvo. Bacterias Grampositivas fueron en general ms sensibles a ZnO que Gram negativos. La exposicin de Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus a sus correspondientes concentraciones mnimas inhibitorias de ZnO NP redujo el nmero de clulas a cero dentro de 8 y 4 h, respectivamente. Micrografas electrnicas de barrido de las bacterias tratadas con NP mostraron que el efecto perjudicial de ZnO en elS. aureus fue vigoroso como todas las clulas tratadas se explot por completo o lisadas despus de slo 4 horas de la exposicin.Prometedores resultados de ZnO actividad antibacteriana NP sugieren su uso en los sistemas alimentarios como agentes conservantes despus de las investigaciones ms necesarias y las evaluaciones de riesgo. APLICACIONES PRCTICAS La invasin de patgenos transmitidas por los alimentos sigue siendo un problema recurrente grave que enfrentan los investigadores y supervisores de la industria alimentaria. La introduccin de nuevos agentes antimicrobianos potentes es de gran importancia para el control de bacterias patgenas, especialmente cepas resistentes a los antibiticos. El xido de zinc (ZnO), nanopartculas (NP) podra ser una de esas posibles alternativas. Este estudio se centr en ZnO NP debido a su creciente presencia en muchos productos comercializables y que apoya su aplicacin en la industria alimentaria como un agente razonablemente seguro. La actividad antibacteriana de ZnO demostrado NP recomienda su posible aplicacin en el campo de la conservacin de alimentos, de lo contrario puede ser aplicado como un potente agente desinfectante para la desinfeccin y esterilizacin de equipos de la industria alimentaria y contenedores contra el ataque y la contaminacin con bacterias patgenas transmitidas por los alimentos. INTRODUCCIN La nanotecnologa ofrece posibilidades de grandes avances en una variedad de industrias mediante la manipulacin de materiales a nivel atmico o molecular y as obtener caractersticas novedosas y funciones de los materiales ms pequeos construidos; estos materiales ms pequeas se denominan nanomateriales y se define como una partcula inferior a 100 nm en al menos una direccin La nanotecnologa se aplica actualmente en la ingeniera elctrica, qumica, ciencias de los materiales y los cosmticos o protectores solares . Ciencias medicinales estn investigando el uso de la nanotecnologa para mejorar el diagnstico y sus tratamientos ( En la actualidad, los nanomateriales de xido de metal son algunos de los nanomateriales ms altamente elaborados, y sus aplicaciones disponibles incluyen catlisis, sensores, remediacin ambiental y de higiene personal .As, el xido de zinc (ZnO) y nanomateriales de xido de cobre se incorporan en una variedad de revestimientos mdicos y de la piel debido a sus propiedades antimicrobianas y / o antifngica. Nanopartculas de ZnO (NPS) se han aadido como fondo de pantalla a los antimicrobianos de uso en los hospitales). ZnO y TiO 2 SNs formulaciones de proteccin solar tienen un mejor desempeo, ya que dispersan la luz ultravioleta que sus formulaciones a granel respectivos .Mientras que un xido de metal, tales como dixido de titanio convencional (E 171) se utiliza ya como colorante blanco (E171), por ejemplo, para blanquear la leche desnatada . ZnO durante dcadas ha sido utilizado en la medicina como un leve tpico astringente (y agente antibacteriano es posible) en el eccema y excoriaciones leves, en las heridas, y para las hemorroides .

Hay muchos partidarios que creen que la nanotecnologa aportar grandes avances y avanzar en el mundo y la calidad de vida, mientras que hay muchos que consideran la nanotecnologa que es muy peligroso y arriesgado para continuar la investigacin ) informaron que el ZnO PN fueron el agente antibacteriano ms txica entre el otro examin xido metlico PN (aluminio, silicio y titanio) contra Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens . ZnO NP podra ser utilizado como un agente antibacteriano eficaz para proteger la seguridad agrcola y alimentaria de los agentes patgenos transmitidos por los alimentos, especialmente E. coli O157: H7 Los agentes antibacterianos usados actualmente en la industria alimentaria se pueden clasificar en dos categoras: los reactivos orgnicos e inorgnicos. Inorgnicos agentes antibacterianos son ms estables a altas temperaturas y presiones en comparacin con los materiales orgnicos, y los polvos de xido metlico podra ser sugerido como potentes agentes antimicrobianos en este campo ). Los xidos metlicos, tales como ZnO han recibido una creciente atencin como materiales antibacterianos en los ltimos aos debido a su estabilidad en condiciones duras de procesamiento, y tambin porque son generalmente considerados como materiales seguros para los seres humanos y animales Muchos estudios han demostrado que algunos parlamentos nacionales hechas de xidos metlicos, tales como ZnO NP, tienen una toxicidad selectiva para las bacterias y slo muestran un efecto mnimo en las clulas humanas, que recomiendan a sus usos potenciales en Industrias Agrarias y Alimentarias (Hoy en da, Salmonella spp. se ha considerado como los agentes causales ms importantes de una importante gama de enfermedades transmitidas por alimentos Salmonella especies han sido identificadas y son de gran preocupacin para casi todos los sectores de la industria alimentaria Aureus es tambin un grupo importante de los patgenos transmitidos por alimentos que en su mayora asociados a adquirida en la comunidad y las infecciones nosocomiales, y puede amenazar la vida en condiciones de inmunodeficiencia. Las especies ms importantes en el gnero Staphylococcus es Staphylococcus aureus . Ellos son los habitantes naturales de la piel humana y animal, pero a veces puede causar infecciones que afectan a muchos rganos . Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la actividad antimicrobiana, cualitativa y cuantitativamente, de ZnO NP contra muchas bacterias Gram-positivas y negativas-, los agentes patgenos de origen alimentario, sobre todo en comparacin con la potencialidad de polvo de ZnO. Por otra parte, este artculo tiene como objetivo estudiar el efecto a nivel celular con la captura de micrografa de las clulas de Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus tratado con ZnO NP. MATERIALES Y MTODOS Preparacin de ZnO Suspensin ZnO en polvo (~ 5 mm) y tamao de las partculas de nano-escala ( 50 nm) (PS) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).Pesos iguales de polvo de ZnO y nanopartculas (8,1 g) se esterilizaron inicialmente a 160C durante 3 h, y luego se dispers en agua ultrapura (Milli-Q , Millipore Corporation, Bedford, MA), vigorosamente vrtice durante 10 min y se sonic adicionalmente durante 30 min para evitar la agregacin y la deposicin de partculas. Las suspensiones resultantes (100 ml con una concentracin de 1 M) fueron considerados como solucin de reserva que se diluye y se utiliza para la evaluacin susceptibilidad bacteriana. Cepas bacterianas Nueve cepas de bacterias, incluyendo los patgenos transmitidos por los alimentos, en su mayora, fueron examinados por su susceptibilidad y sensibilidad hacia el tratamiento con concentraciones de ZnO. El nombre de Las cepas de, origen y la preferencia de crecimiento se muestran en la . La identidad de las cepas bacterianas aisladas fueron reconocidos y confirmados de acuerdo con las directrices de referencia microbiolgicos .

Ensayo de pruebas antimicrobianas Dos ensayos diferentes (cualitativo y cuantitativo) se llevaron a cabo para evaluar la actividad antimicrobiana de ZnO en contra examinadas las cepas bacterianas. Los cultivos bacterianos se mantuvieron en la oscuridad a lo largo de los ensayos para evitar el posible efecto de la luz sobre la actividad antibacteriana. Disco de papel ensayo de difusin. discos de papel estriles (Whatman N 1, 6 mm de dimetro) se colocaron sobre la superficie de placas de medios adecuados, recin inoculados con clulas bacterianas, a continuacin, 10 l de solucin madre de ZnO se dispens a la superficie de cada disco . Las placas fueron incubadas durante 24 horas a la temperatura ptima para cada cepa, y dimetros de las zonas de inhibicin del crecimiento se registraron en mm. Cada experimento se realiz por triplicado y las zonas de inhibicin se dan como media desviacin estndar. Determinacin de las concentraciones mnimas inhibitorias. El mtodo de microdilucin modificada segn lo descrito por .. se aplic para la determinacin de concentraciones inhibitorias mnimas (CIM) de suspensin de ZnO contra bacterias examinados. Brevemente, 20 l de 24-horas de edad, el cultivo bacteriano (~ 10 8 ufc / ml) se verti en 96-pocillos de microplacas como seguido por 100 l de una suspensin de ZnO con un volumen igual de caldo de cultivo. Las suspensiones de ZnO fueron producidos por diluciones seriadas para dar una concentracin final de ZnO en el intervalo de 1-200 mM. ZnO solucin libre se utiliz como control. Las microplacas se incubaron entonces durante la noche. p -iodonitrotetrazolio solucin acuosa violeta (l 20; INT, Sigma-Aldrich), con una concentracin de 4% w / v, se aadi a todos los pocillos como un indicador del crecimiento bacteriano por la formacin de color rojo formazn producida por las clulas biolgicamente activas. MIC se define como la concentracin ms baja de ZnO que inhibe completamente el crecimiento de bacterias, es decir, un bien incoloro. Como una prueba de confirmacin, despus de la incubacin de microplacas durante 24 horas a la temperatura ptima para cada cepa, 50 l de cada pocillo se extendieron sobre placas solidificadas medios de crecimiento y se incubaron durante 24 horas ms. Libres de Crecimiento-placas validado que la concentracin utilizada inhibe el crecimiento bacteriano. Efecto del tiempo de exposicin a ZnO NP sobre la supervivencia bacteriana. Dos mililitro de las 24 horas de edad, cultivo bacteriano (~ 10 8 ufc / ml) de Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus fueron inoculadas en 100 ml de caldo de cultivo de nutrientes que contienen el MIC a partir de ZnO NP y se incubaron a 37C. Posteriormente, alcuotas (100 l) a partir de suspensiones de clulas se diluyeron en serie y 100 l de las diluciones de cultivo se extendi sobre placas de agar nutriente. El ltimo paso se repiti hasta las 12 h, con intervalos de 1 hora despus del tratamiento. Las placas inoculadas se incubaron a 37 C durante 24 horas y las unidades formadoras de colonias (ufc) se contaron. El porcentaje de supervivencia se calcul como: N de UFC despus del tratamiento / N de ufc para la cultura de control x 100. Prueba morfolgica de las clulas bacterianas Microscopio electrnico de barrido (SEM; S-500 de Hitachi, Tokio, Japn) se utiliza para examinar los caracteres morfolgicos o cambios de las clulas bacterianas antes y despus del tratamiento con ZnO NP ). En primer lugar, las clulas fueron fijadas principalmente con un tampn de fijador (2,5% de glutaraldehdo, 2% de paraformaldehdo en 0,1 M de Na-cacodilato, pH 7,35) durante 30 min. Las muestras se lavaron luego tres veces con agua ultrapura, seguido por deshidratacin con una serie de soluciones de etanol (10, 30, 50, 70, 90 y 99%). Las muestras deshidratadas se secaron

inmediatamente por secador de punto crtico (Auto-Samdri-815 secadora automtica punto crtico; Tousimis, Rockville, MD), seguido por el montaje en talones de SEM y pulverizacin catdica recubierto con oro / paladio usando un revestidor de enfriamiento por pulverizacin catdica (E5100 II, Polaron Instruments Inc., Hatfield, PA). Las secciones se observ entonces bajo SEM a 8 kV cada hora despus del tratamiento. reas capturadas fueron seleccionadas de acuerdo con la alteracin en la morfologa de las clulas tratadas. RESULTADOS Diferentes cepas bacterianas (dos Gram positivas y Gram negativas siete) fueron examinados por su susceptibilidad a ZnO en polvo y nanopartculas ( ). Generalmente, las cepas de bacterias Gram-positivas eran ms susceptibles a las formas de ZnO usando ya sea ensayo cualitativo o cuantitativo. La forma NP (PS inferior o igual a 50 nm) de ZnO tena una actividad antibacteriana ms eficaz que la forma de polvo (PS de ~ 5 micras) contra todas las cepas examinadas ( ). El dimetro de la zona de inhibicin del crecimiento aumenta con la disminucin de MIC requerida a partir de ZnO para cada cepa, pero sin clara correlacin lineal entre los ensayos utilizados. Bacillus cereus fue la cepa ms sensible entre todas las cepas examinadas hacia formas de ZnO. Por otro lado, con respecto a sus PRM, examin Pseudomonas spp. fueron las cepas ms resistentes examinados. Al evaluar el efecto de tiempo de exposicin (h) en los recuentos de supervivencia y de clulas de Salmonella typhimurium y S. aureusdespus del tratamiento con ZnO NP, en los valores de CIM correspondientes, se comprob que Salmonella typhimurium (clulas de ) tenan tiempo que se requiere casi el doble de S. aureus clulas ( ) para que se produzca la muerte completa (8 h frente a 4 h, respectivamente). Despus de 1 h de la exposicin a ZnO NP, la reduccin de Salmonella typhimurium recuento de clulas fue de 27%, mientras que para Staphylococcus aureus el porcentaje de reduccin registrada fue del 74%. La desaparicin completa de vivosStaphylococcus aureus clulas se puso de manifiesto despus de 4 horas de la exposicin a ZnO NP, momento en el cual las clulas restantes en vivo de Salmonella typhimurium fue del 19% con respecto al nmero total control. Las micrografas electrnicas de exploracin de las clulas tratadas con el MIC bacterianas a partir de ZnO NP muestra que, para S . Typhimurium, PN se adjunta a las clulas bacterianas con una alta frecuencia despus de 1 h de tiempo de exposicin ( ). Las paredes celulares de las bacterias de Salmonella typhimurium se haba suavizado y ampliado despus de las 4 h de exposicin, muchas clulas lisadas fueron y sus componentes internos comenzaron a lanzar ( ). Despus de 7 horas de exposicin, la mayora de los tratados Salmonella typhimurium clulas se lisaron y las pocas clulas intactas restantes se observaron en un estanque de Autorizaciones de componentes celulares internas . En cuanto al impacto de Staphylococcus aureus exposicin 'a ZnO NP sobre la morfologa de sus clulas, se expuso que las clulas bacterianas tena una estructura unificada suave al comienzo de la exposicin ( ); No se observa una partcula de ZnO se pudo detectar la adhesin a las clulas en esta fase. El efecto de ZnO NP era extremadamente vigorosa en las clulas despus de 2 h de exposicin ); la mayora de las clulas se lisaron y liber su contenido internas y las otras paredes intactas de clulas se especifica con apariencia suave ampliada y unida con notable cantidades de ZnO PN. Al final del perodo de exposicin (4 h), todos los tratados Staphylococcus aureus clulas se explot plenamente o lisadas, y las fracciones slo observables fueron liberados de sus contenidos internos combinan con ZnO DISCUSIN

Para la amplia investigacin de ZnO capacidad antimicrobiana, nueve cepas bacterianas, de ambos Gram positivos y negativos, se utilizaron en este estudio. Las cepas examinadas incluyen muchas cepas patgenas transmitidas por los alimentos para aumentar la objetividad y la aplicabilidad del estudio. La inhibicin del crecimiento bacteriano, por el tratamiento con ZnO, se registr en ambos slido (ensayo cualitativo) y caldo (ensayo cuantitativo) medios que dan ms probabilidad para el uso de ZnO en diferentes condiciones de aplicacin.Los nanomateriales de xido de metal aument la muerte celular con concentraciones crecientes, la funcin mitocondrial inducida afectada, las fugas de lactato deshidrogenasa y la morfologa anormal de las clulas generadas en concentraciones tan bajas como 50 a 100 mg / L .La actividad antibacteriana de ZnO NP era mucho ms fuerte que la de polvo de ZnO. Esto podra explicarse simplemente como partculas ms pequeas tienen normalmente una mayor superficie en relacin al volumen que proporciona un medio ms eficaz para la actividad antibacteriana ( ). La generacin de perxido de hidrgeno (H 2 O 2 ) presenta otra elucidacin de la actividad antibacteriana de ZnO, H 2 O 2 que genera a partir de la superficie de ZnO se considera como un medio eficaz para la inhibicin del crecimiento bacteriano ( Se puede suponer que la concentracin de H 2 O 2 generado a partir de la superficie aumenta con el tamao de partcula disminuye, porque el nmero de partculas de polvo de ZnO por unidad de volumen de suspensin de polvo aumenta con el tamao de partcula disminuye. Otro posible mecanismo para la actividad antibacteriana de ZnO es la liberacin de Zn + 2 iones. Es bien conocido que el ZnO normalmente se vuelve inestable en la solucin, y cuando H 2 O 2 se produce, el Zn 2 +concentracin de iones se incrementa como resultado de la descomposicin de ZnO .Los datos obtenidos, con respecto a la sensibilidad bacteriana a ZnO, indicaron que las bacterias Gram-positivas eran ms sensibles que las bacterias Gram-negativas a ZnO en polvo y PN, lo que podra ser explicado como la accin antibacteriana de ZnO Se sugiere que se produzca a travs de su interaccin con especfica compuestos de clulas; estos compuestos se pueden encontrar o aumento en bacterias Gram-positiva en lugar de en bacterias Gram-negativas. Contendientes potenciales de estos compuestos son la capa exterior peptidoglicano de espesor y su constituyente de aminocidos, protenas de superficie (por ejemplo, adherencias) y cidos teicoicos ms lipoides (formando cidos lipoteicoicos), que actan como agentes quelantes y tambin ejecutar ciertos tipos de adherencia. Otra hiptesis es que algunos componentes que se encuentran en bacterias Gram-negativas, y no en Gram positivos, que pueden oponen fijacin de ZnO en las paredes celulares; los candidatos posibles incluyen las membranas adicionales exteriores y los patrones moleculares asociados a patgenos que incluyen lipopolisacrido (que consta de lpido A , y el antgeno polisacrido de la O), porinas y fragmentos particulares de peptidoglicano. La tercera suposicin es que la pared celular Gram-negativos, de acuerdo con su estructura y su espesor, puede impedir la penetracin de ZnO en las clulas y la interaccin con sus componentes internos. Sin embargo, se necesitan ms estudios para investigar las interacciones entre las partculas de ZnO definidos y cada uno de los componentes de clulas individuales para aclarar el mecanismo antibacteriano exacta. Se propuso (que carboxilo, amida, grupos fosfato, hidroxilo y restos de hidratos de carbono relacionadas con la pared celular bacteriana puede proporcionar sitios para las interacciones a escala molecular con el NPS de xido. Adems, se demostr ( ) que el ZnO era ms eficaz para matar bacterias Gram-positivas que bacterias Gram-negativas, porque tienen una estructura ms simple membrana celular. afirm que la exposicin de las bacterias Gram-positivas que carboxyfullerene NP dio lugar a la perforacin de la bacteria y la muerte celular. Otra manera propuesta en la que se puede comprometer la membrana es la alteracin de los componentes lipdicos de membrana ( ).

La mayora de los estudios anteriores sugieren que el mecanismo de toxicidad NP puede estar relacionada con su fotosensibilidad y la produccin de especies de oxgeno reactivas (ROS), bajo la luz de longitud de onda especfica de alta intensidad, por lo tanto, los nanomateriales que generan ROS indirectamente pueden daar las membranas celulares. La arquitectura de la membrana celular podra verse afectada a travs de la peroxidacin lipdica por ROS. El dao y la desorganizacin en la pared celular se observaron en las bacterias expuestas a MgO (y ZnO ( ) PN. En la investigacin actual, todos los pasos del ensayo se lleva a cabo bajo condiciones de oscuridad para evitar los posibles efectos de Autorizaciones de ROS de ZnO NP. Esto indica que la probable produccin de radicales libres en condiciones de oscuridad, como se sugiri anteriormente ( u otros mecanismos de toxicidad adicionales para la produccin de ROS. Dos ensayos se aplicaron diferentes en la presente investigacin, ensayo de inhibicin del crecimiento de la zona expresaron tanto las acciones bacteriostticos y bactericidas de ZnO, mientras que la determinacin de MIC acompaada por la tincin de INT se centr en la accin bactericida de los PN. Despus de la evaluacin general del nivel de ZnO antibacteriano, Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus fueron elegidos como modelos para investigar el modo de accin antibacteriana de ZnO NP, puesto que hubo una resistencia relativamente alta a concentraciones de ZnO y debido a su riesgo significativo como graves patgenos transmitidos por los alimentos y las zoonosis . En el presente estudio, el MIC alta aplicada a partir de ZnO para inhibir Salmonella typhimurium (22 mM), en comparacin con la concentracin aplicada por Staphylococcus aureus (10 mM), el aumento de probabilidad PN de unir a la Salmonella typhimurium ms all de Staphylococcus aureus clulas, al comienzo de la exposicin. Se propuso que los nanomateriales que fsicamente se pueden adherir a una clula puede ser bactericida si entran en contacto con esta clula ( ). Si la membrana de una bacteria se ve comprometida, la clula puede repararse a s mismo o, si el cero es grave, el componente de la clula puede liberar y, finalmente, la clula morir . Se demostr que el PN de ZnO poseen actividad antimicrobiana frente a Listeria monocytogenes y Salmonella enteritidis en huevo lquido blanco y los medios de cultivo, y E. coli O157: H7 en la cultura de los medios de comunicacin recomienda varios enfoques (polvo, PVP tapado, pelculas y) para la incorporacin de ZnO en el sistema de alimentacin. ) revel que el ZnO nanorod en la fase lquida conduce a la muerte celular bacteriana que se produjo debido al dao de la membrana celular. El impacto de los nanomateriales en las clulas vivas, incluyendo bacterias, tambin puede ser dilucidado por las interacciones entre los nanomateriales y los componentes de las clulas individuales. La primera interaccin entre un material y una celda se encuentra en la interfaz de la membrana, las nanopartculas se sugiri que se incrustan en la membrana celular ) indicaron que el ZnO NP puede distorsionar y daar la membrana celular bacteriana, resultando en una fuga del contenido intracelular y finalmente la muerte de las clulas bacterianas; los efectos inhibidores contra E. Escherichia coli O157: H7 incremento como la concentracin de ZnO NP aumentado. Sin embargo, todava existe una falta actual de informacin exacta con respecto a la interaccin de PN con la pared celular bacteriana y la permeacin posible de los PN en las clulas bacteriana. Podemos concluir, con respecto a los resultados obtenidos, que el ZnO NP puede ser propuesto como un agente antibacteriano eficaz y contundente contra dos bacterias Gram-positivas y negativas bacterias. El tratamiento con ZnO NP result en explosin de clulas bacterianas o de lisis, y su accin antibacteriana fue ms vigorosa en bacterias Gram-positivas. La aplicacin de ZnO NP puede ser recomendado como un agente conservante contra los patgenos transmitidos por los alimentos, en la produccin y procesamiento de alimentos, ya sea despus de confirmar la seguridad de la biotecnologa o la toxicidad.