APOSTILA DO CURSO PRTICO DE VIROLOGIA

ENSAIO IMUNOENZIMTICO (ELISA)

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

O diagnstico de certeza de um processo infeccioso a demonstrao do patgeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biolgicos. Esta demonstrao, no caso de uma infeco viral, pode ser feita de forma direta ou indireta. Como demonstrao direta, temos o isolamento do agente etiolgico (por exemplo, ovos embrionados, animais de laboratrio ou cultura de clulas), a evidenciao das partculas virais ao microscpio eletrnico, a deteco de antgenos virais por tcnicas de hemaglutinao ou imunolgicas ou a pesquisa do genoma viral por tcnicas de biologia molecular. J a demonstrao indireta baseia-se na deteco de anticorpos produzidos pelo organismo infectado em resposta a uma determinada infeco viral. Pode ser feita pela sorologia pareada, isto , pela coleta de amostras de sangue na fase aguda e convalescente da infeco. Uma diferena de pelo menos 4 vezes no ttulo de anticorpos especficos entre as duas fases representa a converso imunolgica do indivduo. A este fenmeno denominamos converso sorolgica e a verificao de sua ocorrncia pode ser feita por testes de imunodifuso em gel de gar e inibio da hemaglutinao. Nas duas ltimas dcadas, houve um grande avano no diagnstico sorolgico com o desenvolvimento de testes que permitem uma deteco mais rpida e precisa das infeces por vrus. Dentre elas, destaca-se os testes para pesquisa de anticorpos especficos da classe IgM, que so os primeiros formados em resposta s infeces, indicando uma infeco recente e dispensando a coleta de 2 amostras para teste de converso sorolgica. Dentre as tcnicas imunolgicas mais usadas atualmente, destacam-se a imunofluorescncia, ensaio imunoenzimtico (ELISA) e radioimunoensaio (RIE). Alm destas, com o advento de pesquisas na rea de gentica e biologia molecular, foram desenvolvidas tcnica de deteco do genoma viral, sendo as mais importantes as reao de hibridizao de cido nucleicos e a reao em cadeia da polimerase (PCR).

1. Importncia da pesquisa de antgenos e/ou anticorpos no diagnstico laboratorial

O exame laboratorial de uma virose humana serve no s para confirmar uma dada infeco, ou uma suspeita clnica, mas tambm para identificar o tipo do agente causal e assim contribuir para a avaliao do clnico, para o paciente e a comunidade em geral. Situaes importantes no diagnstico virolgico:

No esclarecimento de infeces com sintomas e sinais clnicos confundveis, como

exemplo, mononucleose infecciosa-citomegalovirose-rubola e (A,B,C,D,E). hepatites virais

Quando h necessidade de confirmao de uma infeco devido s srias implicaes

que a mesma pode Ter para o paciente, como por exemplo na AIDS, hepatite virais e rubola gestacional;

Para diferenciar a fase da doena, como por exemplo, na determinao de infeces

aguda ou crnicas, no prognstico da doena (p.ex. pesquisa dos marcadores sorolgicos das hepatites virais) e como critrio de cura;

No diagnstico de doenas congnitas (p.ex. rubola), uma vez que a deteco da

imunoglobulina IgM no sangue do cordo umbilical patognomnica de doena congnita pelo fato desta imunoglobulina no atravessar a barreira placentria;

Na seleo de doadores de sangue das doenas virais transmitidas pelo sangue,

como hepatites B e C, AIDS, HTLV-I e II;

Quando a interveno quimioterpica importante e possvel, como por exemplo nas

infeces herpticas, AIDS e papilomavirose;

Durante surtos epidmicos, para que a populao e a Sade Pblica busquem as

medidas profilticas adequadas (vacinao, combate a vetores, etc.). Ex: febre amarela, dengue, sarampo, raiva, entre outras;

Na busca de um agente etiolgico de uma dada doena, seja ela nova ou no,
favorecendo assim tambm a pesquisa. Com esta viso, a maioria dos vrus hoje conhecidos foram descobertos e associados a doenas. Ex: vrus Epstein-Barr, HIV, rotavrus, hantavrus, etc.

Na avaliao da imunidade naturalmente adquirida aps uma infeco viral ou

artificialmente induzida aps vacinao, pela pesquisa de anticorpos da classe IgG;

Em

estudos

epidemiolgicos,

para

avaliao da prevalncia de diferentes

doenas virais em uma determinada comunidade pela pesquisa de anticorpos da classe IgG, bem como na verificao da erradicao de doenas (ausncia de anticorpos contra o patgeno em crianas nascidas no local) ou reintroduo de novos casos em reas consolidadas (pesquisa de anticorpos IgG ou aumento no ttulo de anticorpos IgG contra determinado patgeno).

2. Testes sorolgicos

Os testes sorolgicos ou imunoensaios so tcnicas para a deteco e quantificao de antgenos ou anticorpos, podendo utilizar reagentes no-marcados ou reagentes marcados. Os ensaios com reagentes no-marcados, como precipitao e aglutinao, possuem sensibilidade de deteco menor, pois necessrio que se formem grandes complexos antgeno-anticorpo para sua deteco. Nos ensaios com reagentes marcados, estes amplificam o sinal, aumentando a sensibilidade de deteco. Os marcadores comumente utilizados so os radioativos, enzimticos, fluorescentes e quimioluminescentes. Na ltima dcada, houve um grande desenvolvimento nos testes para imunodiagnstico, principalmente com relao aos anticorpos e antgenos empregados e. em menor escala, com relao aos mtodos. O advento dos anticorpos monoclonais proporcionou um grande avano pela possibilidade de produo, em grande quantidade, de anticorpos homogneos e totalmente caracterizveis. Esses anticorpos so altamente especficos, sendo a base de vrios testes de pesquisa de antgenos. Por outro lado, a anlise da estrutura dos principais componentes antignicos dos vrus levou identificao dos antgenos mais importantes na deteco de anticorpos. Tais antgenos podem ser preparados, em larga escala, por sntese peptdica e tecnologia recombinante, aumentando a especificidade dos testes para a pesquisa de anticorpos. Com relao aos mtodos, tem-se observado uma tendncia ao aperfeioamento e consolidao dos testes j existentes especialmente pela facilitao e reduo no tempo das reaes, em vez do desenvolvimento de tcnicas baseadas em prinpios inovadores.

Ensaio imunoenzimtico (ELISA)

O ELISA um mtodo no qual a reao antgeno-anticorpo monitorada por medida da atividade enzimtica. Desempenha um papel muito importante no laboratrio clnico, pois, alm da elevada sensibilidade comparvel do radioimunoensaio, apresenta as vantagens de utilizar reagentes estveis, estar livre das exigncias de trabalhar com radioistopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como a automao sofisticada. O ensaio pode ser empregado com uma variedade de sistemas de deteco, que vo de leituras visuais a fotomtricas, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, fato que tem contribudo para a multiplicao de seus mtodos e aplicaes nos ltimos anos. Para ser utilizada em imunoensaio, a enzima deve preencher alguns requisitos como ser estvel, facilmente obtida em forma purificada e ser facilmente conjugada a vrios antgenos e anticorpos sem perda de sua atividade. Entre as enzimas, a mais empregada a peroxidase, que alm desses requisitos, pode ser conjugada por vrios processos e ser revelada por vrias substncias cromognicas. O princpio bsico da reao de ELISA a imobilizao de um dos reagentes em uma fase slida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservao tanto da atividade enzimtica como da imunolgica do anticorpo. A fase slida pode ser constituda por partculas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno, etc. Placas plsticas so as mais difundidas, por permitirem a realizao de mltiplos ensaios e automao. Aps cada etapa, como sensibilizao, incubao com a amostra e com o conjugado, as cavidades das placas so lavadas para a remoo do material no ligado fase slida. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antgenos ou anticorpos, podendo ter elevada preciso se os reagentes e os parmetros do ensaio forem bem padronizados. O grau de pureza do antgeno ou anticorpo da fase slida muito importante, pois qualquer material heterlogo competir pelo espao na placa. Na pesquisa de antgenos, o anticorpo utilizado na sensibilizao deve ter alta afinidade, podendo ser policlonal ou monoclonal. Para pesquisa de anticorpos, o antgeno deve estar livre de impurezas, podendo-se utilizar antgenos purificados por cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais, peptdeos sintticos ou peptdeos obtidos a partir de tecnologia recombinante. Alm de se avaliar a concentrao ideal da
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amostra teste na reao, pode-se utilizar detergentes no-inicos, como Tween 20 e/ou protena (leite desnatado, gelatina, BSA, casena, etc.) no diluente da amostra para reduzir a adsoro no-especfica de componentes da amostra na placa. Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade e maximamente purificados. Os substratos cromognicos empregados pela degradao enzimtica do origem a produtos solveis coloridos, cuja determinao feita medindo-se a densidade tica da soluo no espectofotmetro. Para a peroxidase, o substrato o perxido de hic\drognio (H2O2), e os cromgenos ou doadores de hidrognio mais utilizados so ortofenilenodiamina (OPD), cido 5-amino saliclico, ortotoluidina, 2,2diazino do cido etilbenzotiazolino sulfnico (ABTS) e tetrametilbenzidina (TMB)

Principais mtodos de ELISA empregados para a pesquisa de anticorpos e antgenos

1. Ensaios para antgenos A fase slida sensibilizada com anticorpo especfico. A amostra em teste, onde se vai pesquisar o antgeno, incubada com a fase slida e, a seguir, incuba-se com excesso de anticorpo especfico marcado com a enzima. A reao revelada pela adio do substrato. A taxa de degradao proporcional a concentrao do antgeno

E lavagem + E

anticorpo

antgeno

Anticorpo marcado

S U B S T R A T O

2. Ensaios para anticorpos

2.1 Mtodo direto As placas so sensibilizadas com antgenos, que reagiro com os anticorpos da amostra., incubando-se em seguida com o antgeno especfico marcado com a enzima.
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2.2 Mtodo indireto As placas so sensibilizadas com o antgeno. Segue-se a incubao com a amostra teste. O conjugado empregado utilizada antiimunoglobulina humana que reage com o anticorpo da amostra capturado pelo antgeno e a reao e revelada com a soluo cromgena. O grau de degradao do substrato, indicado normalmente pela intensidade da cor da soluo, proporcional concentrao de anticorpo.

2.3 Mtodo para captura para anticorpos IgM A fase slida sensibilizada com anti-IgM especfico para a regio Fc. Os soros em teste so incubados, havendo a captura de qualquer IgM da amostra. A seguir incuba-se com antgeno marcado ou antgeno no marcado, seguindo de anticorpo especfico marcado

AULA PRTICA: Ensaio imunoenzimtico para deteco do antgeno de superfcie do vrus da hepatite B (HBsAg)

Este ensaio baseia-se na metodologia direta do tipo sanduche. Anticorpos antiHBs so adsorvidos nas cavidades da fase slida. Antgeno HbsAg, caso presente na amostra do soro teste, ir reagir especificamente com o anticorpo anti-HBs capturado na fase slida. A placa em seguida incubada com o conjugado anti-HBs/peroxidase. O anticorpo do conjugado s se ligar se a amostra de soro for positiva para a presena de HbsAg. A reao ser revelada mediante adio do substrato da enzima em soluo que inclui um cromgeno (TMB), que ao ser oxidado, se converte em um complexo de colorao azul. Amostras negativas se apresentaro incolores. A reao paralizada pela adio de cido sulfrico, que muda a colorao das amostras positivas para amarelo. Amostras negativas permanecem incolores.
E lavagem + E E E S U B S T R A T O

anticorpo

antgeno

Anticorpo marcado

AULA PRTICA: Ensaio imunoenzimtico para detecco do antgeno de superfcie do vrus da hepatite B (HBsAg)
Metodologia da aula 1. Em placas previamente sensibilizadas com anticorpos anti-HBs, lavadas e aps a incubao com as amostras de soro-teste, proceder com a lavagem (3X/PBST) com intervalos de 1 min entre as lavagens. Deve-se tomar cuidado para no deixar transbordar. Ao fim da lavagem, bater a placa em papel de filtro para retirar o excesso de tampo. 2. Diluir o conjugado: 5 l de conjugado anti-HBs/HRP em 1 ml de tampo (PBS). Adicionar 100 l do conjugado diludo por cavidade. 3. Tampar a placa, identificar e incubar 37C/30 min. 4. Lavar a placa como descrito no tem7 1.

5. Adicionar a soluo de substrato pronta para uso (50 l por cavidade), tampar a placa e incubar a T.A. por 3-5 min. 6. Parar a reao adicionando 50 l H2SO4 em todas as cavidades e proceder com a leitura visual da reao.

Leitura visual Observar a placa ligeiramente inclinada sobre uma superfcie branca, com boa iluminao. Considerar como positivas as amostras que apresentarem qualquer diferena perceptvel de cor em relao aos controles negativos, que devem ser incolores. positivo forte (igual ao controle positivo)= +++ positivo mdio= ++ positivo fraco= + negativo

Leitura no espectrofotmetro (450 nm) Considerar como positivas as amostras que apresentarem uma densidade tica pelo menos 2.1 maior do que a mdia dos controles negativos.

Protocolo da reao (amostras 1-4) H 1 G 2 F 3 E 4 D CP C CP B CN A CN