TECNICO UNIVERSITARIO EN TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

MICROBIOLOGIA GENERAL TRABAJO PRCTICO N7

PRUEBAS BIOQUIMICAS

SALTA, 9 DE NOVIEMBRE, 2012 ALUMNAS: MARIA BELEN ACOSTA, ADRIANA DEL VALLE NIEVA, ROMINA ANALIA SANCHEZ TALEVI TRABAJO PRCTICO DE LABORATORIO N 7 PRUEBAS BIOQUMICAS OBJETIVOS: Identificar microorganismos Pruebas de movilidad Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometi el o los errores, para as, mediante el desarrollo experimental conocer ms profundamente las pruebas bioqumicas. Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por las pruebas bioqumicas INTRODUCCIN: Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. En este Laboratorio usaremos los medio SIM y de Citrato. SIM Medio Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2. Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Triptena 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; Peptona 6.1 calentar agitando y hervir durante un Sulfato de hierro y amonio 0.2 minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de Tiosulfato de sodio 0.2 hemlisis y esterilizar en autoclave a Agar 3.5 121C durante 15 minutos. Solidificar en posicin vertical. pH final: 7.3 0.2

Siembra A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en lnea recta. Incubacin Durante 24 horas, a 35-37 C, en aerobiosis. Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich. Resultados Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende ms all de la lnea de siembra. Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color. Limitaciones - En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede ser difcil de observar. - Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin de cido sulfhdrico. Caractersticas del medio Medio preparado: mbar. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Simmons Citrato Agar Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Citrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Cloruro de sodio 5.0 Dejar reposar 5 minutos y mezclar Fosfato dipotsico 1.0 calentando a ebullicin durante 1 o 2 Fosfato monoamnico 1.0 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar Sulfato de magnesio 0.2 en autoclave a 121C durante 15 Azul de bromotimol 0.08 minutos. Enfriar en posicin inclinada. Agar 15.0 pH final: 6.9 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero, usando un

ansa sin arrastrar el agar. Incubacin A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin. Resultados - Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. - Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Limitaciones - Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualizacin azul de un resultado positivo. - Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. - Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados falsos positivos. Caractersticas del medio Medio preparado: verde. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. MATERIAL Y EQUIPO Autoclave. Erlenmeyer. Tubos de ensayo. Ansas y agujas. Pipetas. Estufa de cultivo. Mecheros. MEDIOS DE CULTIVO Medio SIM (SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)

Medio Simmons Citrato Agar

PROCEDIMIENTO Mtodos: Trabajar con dos medios de identificacin, que son el Medio SIM, y el Agar citrato de Simmons.

Procedimiento: PARA MEDIO SIM 1. A partir de un cultivo en placa (que fue expuesto al aire por 1 hora e incubado 24 a 48 hs a 37 C) y E Coli (sembrado en agar inclinado), se tomo el inculo y se sembr por puncin profunda ,en el medio SIM slido, con ansa tipo aguja donde inoculamos el centro del tubo (la

puncin abarc 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie) sin tocar el tubo en lnea recta(como muestra figura), trabajando siempre cerca del mechero. 2. Se incub por durante 3 das en estufa, a 35-37 C, 3. Luego de la misma, agregamos 3 gotas de reactivo de Kovacs 4. Se observ y se obtuvieron los siguientes resultados, citados en la tabla adjunta. PARA AGAR DE CALDO NUTRITIVO BLANDO 1. Se esterilizo el asa de aguja de inoculacin y se tomo la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado (las placas expuestas al aire y E Coli) cerca del mechero se espera que se enfre la aguja de inoculacin y se toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2. Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira la tapa del tubo ayudndose con los dedos meique y anular, se flamea la boca del tubo. Se introduce la aguja con el inculo y sin tocar las paredes del tubo, inoculamos en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retiramos la aguja de inoculacin en la misma direccin de la siembra. 3. Retiramos el asa y flameamos de nuevo la boca del tubo y coloca su tapa. Esterilizamos el asa. 4. Se incubo a 35-37 C, durante3 das en estufa. 5. Se observo y se obtuvieron los siguientes resultados, citados en la tabla adjunta PARA MEDIO CITRATO 1. De las colonias de las placas expuestas al aire y E Coli, sembramos en superficie en tubos de ensayo con el medio citrato inclinado ,donde se introdujo el ansa de anillo con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) empezando en el rea del fondo del agar realizando zig-zag hacia fuera hasta terminar en la punta del agar(como muestra figura) 2. Se incubo a 35-37 C, durante 3 das en estufa. 3. Se observo y se obtuvieron los siguientes resultados, citados en la tabla adjunta. NOTA: Antes de una inoculacin se esteriliza el filamento del asa de siembra y al finalizar la misma se flamea la boca del tubo de nuevo y se esteriliza nuevamente el asa evitando as que el cultivo no se contamine con microorganismos no deseados. Medio SIM Muestra Escherichia coli a b c d e F Movilidad + + + + + + Indol Produccin del cido sulfhdrico -

Agar nutritivo blando Muestra g h i a Movilidad + +

Medio Simmons Citrato Muestra Escherichia coli a b c d e f g h i Crecimiento + Color Azul Verde Verde Verde Verde Verde Verde Verde Verde Verde

Diferencia

Escherichia coli

CONCLUSION Concluyendo el laboratorio, en base a los resultados obtenidos por las pruebas podemos observar que algunos datos no concuerdan con los datos de bibliografa, ya que el E. coli debera haber dado positivo respecto a la produccin de Indol y negativo frente al Medio Citrato. La falta de coloracin roja en la superficie luego de agregar el reactivo de Kovac`s, se puede deber a que quizs el reactivo era viejo, ya que el Escherichia coli si produce Indol luego de degradar metabolitamente el aminocido triptfano1. Con respecto al resultado positivo dado frente al medio Citrato, no sabemos explicar la razn, pero debera haber dado un resultado negativo2. BIBLIOGRAFIA http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htm http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm http://www.slideshare.net/Prymer/medios-bioqumicos 1- Elmer Koneman, Stephen Allen- Diagnstico microbiolgico: Texto y Atlas en color Pgina 1385

2- Elmer Koneman, Stephen Allen- Diagnstico microbiolgico: Texto y Atlas en color Pgina 218

FIN