Estructuras de comprensin

membrana

revitalizantes:

Nuevas

herramientas

10 aos atrs, en un articulo anterior de estructuras lipidicas , presente en el Nature Reviews Molecular Cell Biology, se daba una ambigedad en metodologa e imprecisin en la nomenclatura. Actualmente las tcnicas estn permitiendo aprofundizar nuestra comprensin en la dinmica de la organizacin de la mebrana. En este articulo, debatimos como esta materia se ha desarrollado hasta llegar al modelo actual, en el que las membranas son ocupadas por esfingolipidos nanoescalometricos fluctuantes, colesteroles y protenas que pueden ser estabilizadas en plataformasque son importantes en transmitir informacin , infecciones virales y el trafico en la membrana. Las clulas membranosas contienen cientos de lpidos en dos estructuras en forma de hoja asimtricas, y una gran cantidad de protenas. Por muchas dcadas, la investigacin de las membranas fue dominado por el ideal de que las protenas eran factores clave para el funcionamiento de la membrana, donde los lpidos fueron denominados como fluido. Introduciendo el concepto de estructura lipida el 1997, postulamos que la proetina esfingolipidica-coleterol-proteica, pudo funcionar en el transporte de la membrana, asi como en la transmisin de informacin. Estas estructuras, se pensaban que eran caracterizadas por un empaque lipidico limitado,similar al del esteroldependiente. La novedad fue que el concepto de estructura permitia que los lpidos realicen una funcin inroduciendo qumicos especficos en la hetereogeneidad de las membranas.

Para complicar las cosas an ms fue el tamao de los esfingolpidosprotenas colesterol ensamblados siendo estudiados, que estaba por debajo de la resolucin de la microscopa de luz. Slo despus de la reticulacin hizo protenas y lpidos balsacomponentes se agrupan para formar micras de tamao, edredn-como parches. Nuestro enfoque en la primera revisin fue hacer hincapi en que balsas son pequeas y dinmica y se puede estabilizar a formar grandes que funcionan en microdominios de membrana el trfico y la sealizacin. Hemos propuesto que tres tipo de montaje deben ser reconocidos en las membranas celulares- Balsas, balsas y caveolae en clster (un subconjunto de balsas agrupados) - y que el residuo que queda insoluble despus de la extraccin de detergente debe ser llamado detergente resistentes membranas (DRM) fracciones. Nosotros tambin se resumen las herramientas que estaban disponibles para la definicin balsas y discutieron sus puntos fuertes y deficiencias. Obviamente, lo que se conoce acerca de las balsas de lpidos y organizacin membrana en el momento dependa de la metodologa disponible. El

fundamento de la presente revisin es resumir donde estamos hoy y para destacar la importancia papel que la nueva tecnologa ha tenido en el movimiento de la forwards de campo (Cuadro 1). Se describe cmo membrana balsas se definen ahora como dinmica, escala nanomtrica, con esteroles esfingolpidos enriquecido, conjuntos ordenados de protenas y lpidos, en la que la balsa metaestable estado de reposo se puede estimular a coalescer en ms grande, ms estable dominios con balsas de lpidos especficos de lpidos, protenas y lpidos- interacciones protena-protena de oligomerizacin (figura 1). La lpidos en estos conjuntos se pens para ser enriquecido en cadenas de hidrocarburos saturados. Se describen los avances en nuestra comprensin de cmo las balsas de lpidos funcionar como un membrana principio organizador en procesos celulares tales como la sealizacin de clulas T, la infeccin viral y la membrana trata de personas, y tambin tratar de identificar cuestiones que deben resolverse. Controversias Antes y ahora Un tema clave hace diez aos fue la metodologa utilizada para definir un componente de balsa. Un nmero creciente de papeles detergentes utilizados como criterio principal para la balsa asociacin; constituyentes balsa se define simplemente como la residuo insoluble que queda despus de DRM o no inico detergente solubilizacin a 4 C. Este criterio era generalmente combinado con el uso de metil--ciclodextrina para extraer el colesterol de las membranas celulares. Si el protena se convirti detergente soluble despus de ciclodextrina tratamiento, esto reforz la conclusin de que esDRM asociacin era indicativo de que es un componente balsa. Finalmente, si un proceso biolgico en las clulas vivas se interrumpida por ciclodextrina tratamiento, el procesose considera que la balsa basa. El uso indiscriminado de estos mtodos para estudiar el compleja procesos celulares provoc una inflacin de las reclamaciones que eran difciles de interpretar y reconciliar. Con razn, estas cuestiones planteadas en cuanto a si las balsas fueron un verdadero fenmenos fidiologico. Las principales crticas fueron de curso dirigido hacia el uso de resistencia a los detergentes como un factor determinante para la balsa components8. Mientras fisiolgicamente los cambios inducidos en la composicin DRM puede reflejar sesgos laterales en la membrana, detergente solubilizacin es un mtodo intrnsecamente artificial dando resultados diferentes dependiendo de la concentracin y tipo de detergente, la duracin de la extraccin y temperatura. De manera similar, los otros mtodos utilizados para definir dependientes de la balsa procesos eran propensos a objetos y interpretaciones errneas, por ejemplo, tratamiento de ciclodextrina tuvo efectos secundarios graves tales como la protena lateral immobilization10. Como membranas de plasma puede contener hasta un 40% en moles cholesterol11, tal vez no sea sorprendente que muchas funciones celulares puede ser perturbado por depletion12 colesterol. Por ejemplo, la membrana plasmtica puede despolarizar y Ca2 + tiendas pueden ser inducidas a empty13, dando lugar a los efectos globales de celulares. La dificultad de visualizacin de balsas en las membranas celulares era una preocupacin importante, discutido crticamente incluso diez ago4 aos. Aunque los parches microscpicamente observables

estaban presentes despus de la reticulacin con ligandos exgenos, la variabilidad de la colocalizacin y tamaos visto llevado a las dudas sobre su relevancia. Adems, los enfoques utilizado para estudiar la difusin de protenas de membrana, tales como recuperacin de fluorescencia despus de photobleaching (FRAP) 14, y complejos moleculares en membranas, tales como Frster resonancia transferencia de energa (FRET) 15, condujo a resultados mixtos y por lo tanto caus escepticismo sobre el concepto balsa. Estos estudios tambin pusieron de manifiesto la cuestin de lo que constituye marker16 una balsa (Cuadro 1). Hubo denuncias de que el campo balsa lipdica se encontraba en un impasse tcnico porque las herramientas fsicas para estudiar las membranas biolgicas eran lacking17. Avances con las nuevas tecnologas A pesar de las dificultades, la situacin poco a poco aclarado. Las controversias inspirado esfuerzos renovados para encontrar una metodologa que puede detectar y seguir la comportamiento de estas pequeas balsas y difcil de alcanzar. Si fueran presentarse como postulado, uno debe ser capaz de vislumbrar de ellos antes de que se agrupan en ms plataformas estables. El problema requiere el desarrollo de una temporales y espaciales de las tcnicas de resolucin para comparar la ubicacin de los diferentes constituyentes moleculares en la membrana. Visualizacin de balsas con nuevas tcnicas de microscopa. Molcula simple de espectroscopia y microscopa tcnicas fueron, en principio, muy adecuada para este desafo porque debe dar acceso al estado dinmico de la membrane18-20. En efecto, una afluencia de nuevos mtodos, tales como hetero-y homo-FRET y fluorescencia polarizacin anisotropa, revelaron que protenas ancladas a GPI y otras protenas de lpidos modificados formar cholesteroldependent, nanoescala clusters21 de 22. Una sola partcula de seguimiento tambin revel la existencia de dinmicas nanoescala dominios, y, sobre esta base, las balsas de reposo se propusieron consistir en una balsa proteins23 pocos. Otra de seguimiento mtodo empleado dual-color de reflexin interna total fluorescencia (TIRF) microscopa y nico punto cuntico de seguimiento para estudiar la difusin de colesterol dependen comportamiento de una protena anclada a GPI y mostr que esta protena dinmicamente reparti en y fuera de grupos de clulas de la superficie del ganglisido GM1 (ref. 24). Adems, espectroscopia de correlacin de fluorescencia (FCS) anlisis de cmo se comportan las protenas de membrana en clulas vivas revel colesterol y esfingolpidos basados en nanoescala dominios, en la que las protenas y lpidos de forma dinmica particin o montar con una escala de tiempo de decenas a cientos de milliseconds25. Por otra parte super-resolucin de la microscopa ptica se han incorporado mtodos que proporcionan una resolucin mucho ms all de la difraccin limit26, que incluyen estimulado

agotamiento de emisin (STED) microscopy27, fotoactivado localizacin microscopy28 y estocsticos microscopa ptica reconstruccin (PALM y STORM) 29. Microscopa STED mostr que los esfingolpidos y GPIanchored protenas estn transitoriamente atrapado en cholesteroldependent complejos moleculares en vivo cells30 (figura 2a). Super-resolucin de microscopa de campo cercano ptico de escaneado (NSOM) 31 tambin se utiliz en combinacin con cuntico puntos para mostrar que la estimulacin de clulas T desencadena nanoescala organizacin de los receptores de clulas T (TCR) en vivo cells32. En conjunto, estos mtodos de revelado diferentes aspectos de cmo el comportamiento de los lpidos y las protenas se correlaciona en la membrana plasmtica.

A pesar de la riqueza de la informacin obtenida reciente mirando desde debajo de la anteriormente inviolable 'difraccin limitar ', todas las tcnicas mencionadas anteriormente tienen su desventajas inherentes. FCS es de difraccin limitada y por lo tanto debe ser extrapolated25 33,34, o combinado con una tcnica de super-resolucin como STED30 para llegar a la mundo nanoscpico. NSOM requiere proximidad nanmetros a una punta o superficie, que puede influir en el sistema bajo study35. Un problema adicional es el uso de etiquetas que son voluminosos o qumicamente extrao a la clula, generalmente etiquetas fluorescentes, granos o puntos cunticos. Aunque hay intentos de hacer frente al volumen de estos tags36, queda por ver si estos marcados (a menudo sobreexpresado) constructos fielmente imitar el comportamiento de la nativa no modificada componentes de la membrana. A pesar de estas limitaciones, los datos de estos mtodos concluyente compatible con la existencia de nanoescala, colesterol asistida, dinmico y selectivo, asambleas. La diversidad de lpidos revelado por lipidomics. Anlisis de lpidos tiene drsticamente mejorado en el pasado decade37. El campo tiene sido energizado por las capacidades tcnicas mejoradas del espectrmetros de masas en tndem que ahora permiten rpido cuantitativo perfilado de lipidomes de pequeas cantidades de muestra. La precisin analtica de los instrumentos modernos ha hecho posible identificar de forma rutinaria los lpidos como molecular especies y para analizar la diversidad composicional de los lpidos en una forma sin precedentes. Anteriormente, la mayora anlisis de lpidos de las membranas cuantificado composicin en trminos de clases de lpidos y no la diversidad molecular en cada clase de lpidos (Figura 2c). Para entender cmo esta diversidad es utilizada por la clula, sensible y cuantitativo lipidomic tcnicas tendr que ser utilizado para definir la especificidad

que regula los lpidos assembly38. Los primeros anlisis de balsa grupos en activo TCR domains39, balsa de transporte carriers40 y viruses41 balsa revelar enriquecimiento selectivo de especies de lpidos, tal como predice la hiptesis de balsa. Conclusiones de anlisis biofsicos. En paralelo con la bioqumica estudios analticos y de organizacin de la membrana celular, biofsicos ha sido la caracterizacin de modelo sistemas que utilizan monocapas y bicapas para explorar los lquidos inmiscibilidad lquido (la incapacidad para mezclar) 42,43. Hay dos fases pertinentes de membranas: lquido desordenados y lquido ordenado. La fase lquida ordenada es tpicamente enriquecidos en lpidos balsa, tales como esfingolpidos, colesterol y saturado phospholipids42. En tres componentes lpidos mezclas reconstituida en vesculas unilamelares gigantes (GUVs) o respaldado por bilayers44, 45, tamaos variables de los fases lquido-lquido desordenados y ordenada puede ser vistos con microscopios de fuerza atmica y de luz, dependiendo en el composition46. Los tamaos de estos dominios puede ser alterado de grande a microscpicamente indetectable mediante el ajuste de la composicin de la mezcla de lpidos. Del mismo modo, balsa dominios similares son visibles en GUVs de aislado de rata membrana renal lipids47. Oligomerizacin lpidos balsa (por ejemplo, por reticulacin de un soluto menor tales como el ganglisido GM1, un lpido balsa tpica) era demostrado tener un efecto dramtico en la promocin de fase separation48 (figura 2b). Cmo estos hallazgos en modelos de sistemas simples se relacionan a las membranas celulares? Dado que las bicapas de membrana celular son asimtrico en su composicin, el comportamiento de fase en cada valva podra ser nica y acoplados por interacciones en la bicapa midplane49. Las membranas celulares son ciertamente no en equilibrio, sino que estn continuamente perturbado por fluctuaciones de composicin causadas por metabolismo de los lpidos, la accin de flippases, transportadores de membrana de lpidos y trfico, y el retorno al equilibrio puede ser lenta. Tiene ha argumentado que la composicin qumica del exterior monocapa de las membranas plasmticas celulares les confiere la propensin a la separacin de fases (si en el equilibrio) 50. Incluso si no hay separacin de fases microscpicamente observable puede ser detectada, la propensin a la sub-microscpica formacin de dominio puede existir todava. Claramente, la fase de segregacin visto en sistemas modelo en fase lquida es una manifestacin de inmiscibilidad lquido-lquido. As que si uno tuviera que dejar una membrana de plasma en un estado de reposo (sin sntesis de lpidos o el metabolismo, la exocitosis no o endocitosis, no interacciones

con protenas perifricas y no citoesqueleto de actina), hara componentes de la membrana de fase separada en dominios de gran tamao con el tiempo? Esta pregunta an no ha sido respondida, pero basada en lpidosseparacin de fases en lquido ordenada-como y-liquiddisordered al igual que las fases se ha visto en el gigante aislado vesculas de membrana plasmtica (GPMVs) formado por una membrana blebbing51, y la temperatura y cholesteroldependence de esta separacin de fases se asemeja a la de modelo simple systems52 (figura 2b). Adems, el plasma esferas de membrana (PMSS), elaborados mediante un hinchazn procedimiento y separado de la influencia del citoesqueleto y los eventos de trfico, mostr esterol-dependiente coalescencia en una fase micrmetro de escala en la agrupacin por la toxina del clera a 37 C (figura 2b). El selectivo lateral reorganizacin de las protenas y los lpidos se correlacionaron con predijo su afinidad por balsa domains53. Este comportamiento de separacin de fases es similar a la toxina del clera inducida por la separacin de fases se ve en modelo membranas, lo que sugiere que la composicin de protenas y lpidos de las membranas de plasma se coloca cerca a un lmite de fase y se puede inducir a la separacin de fases por la agrupacin de los componentes tales como la balsa ganglisido GM1. En conjunto, estos estudios han proporcionado una emocionante y una dimensin nueva e inesperada en la investigacin de membrana, mostrando que las membranas celulares de los lpidos complejos y composiciones de protenas puede fase separada de manera similar a membranas modelo simple y que la composicin Podra haber sintonizado cerca de un punto crtico (RECUADRO 2). Se debe que sealar que las dos fases inducida por el clera toxina en PMS comportamiento diferente del lquido ordenada y lquido con trastornos fases en membranas modelo en trminos de la cantidad de orden y packing54. Estas diferencias en la organizacin son quizs no sea sorprendente, teniendo en cuenta que la membrana plasmtica est lleno de protenas y especficas lpido-protena interacciones. Por lo tanto, se queda con una descripcin de las membranas plasmticas que podra corresponder a tres estados, de los cuales dos se ven en vivir cells55 (figura 1). El primer estado est representado por conjuntos dinmicos de nanoescala que se asocian y se disocian en un timescale56 debajo del segundo, 57. Estos pueden se acumulan en el segundo estado para generar ms estable, plataformas selectivos y funcionales. El tercer estado es el micrmetro de escala completa separacin de fases que se ve slo en las membranas aisladas en el equilibrio. Cmo la

fluctuaciones crticos observados en GPMVs se refieren a asociar y disociar asambleas nanoescala en que viven Las clulas todava no est claro. Obviamente, el comportamiento dinmico depender de la composicin de las membranas, y por lo tanto, en el tipo de clula que la membrana plasmtica es derivado de (recuadro 1). Funciones biolgicas de heterogeneidad balsa Los recientes avances de alta resolucin microscpica metodologa junto con las observaciones de gran escala la separacin de fases en las membranas plasmticas han confirmado el potencial de separacin de fase lipdica. Para iluminar la posibles funciones de balsas en las funciones celulares, nos centramos en cuatro reas de biologa celular-TCR de sealizacin, el VIH montaje, retculo endoplsmico (ER)-a-Golgi y-enviar Golgi trfico a la superficie celular y glycosphingolipidmediated endocitosis y examinar los progresos realizados en la ltima dcada. Clulas T de sealizacin. Una pista temprana que las balsas podra afectar clulas T sealizacin fue la observacin de que el anticuerpo mediada la reticulacin de las protenas ancladas a GPI (que no lo hacen atraviesan la membrana) podra estimular signalling58. Ms tarde, DRM anlisis mostr que los factores importantes para la clula T sealizacin eran detergente insoluble, mientras diseados deficientes palmitoilacin-protenas se convirti en detergentsoluble y alteracin de la activacin de clulas T. El colesterol agotamiento inhibe la activacin de clulas T, mientras que co-parches experimentos usando parte de la toxina del clera inducida por la Clulas T de activacin del programa y conducen a microscpicamente observables que contienen dominios de activacin de clulas T esencialesprotenas. En conjunto, estos datos sugieren que los lpidos balsas estn involucrados en la sealizacin de clulas T. Las clulas T son activadas por la conjugacin con cognado presentadoras de antgeno clulas (APC). Interactuar con el TCR pptido antignico unido a la mayor de histocompatibilidad complejo (pMHC) en APCs59, y esto conduce a la fosforilacin immunoreceptor de Tyr activacin basada en motivos en el complejo de multisubunidades TCR por linfocitos clulas especficas de protena quinasa Tyr (LCK, una quinasa de la familia Src) y el reclutamiento y la activacin subsiguiente de la Tyr quinasa 70 kDa protena asociada (ZAP70) (figura 3). En A su vez, activan ZAP70 fosforila enlazador de clulas Tactivacin (LAT), una protena transmembrana que adaptador reclutas varias molculas de sealizacin aguas abajo para iniciar eventos tales como la polimerizacin de actina, influjo de Ca2 +, Activacin de Ras y cambios transcripcionales. Esta cascada

de los resultados de los acontecimientos en la formacin de un inmunolgica ' sinapsis "entre las clulas en contacto, con un ojo de buey estructura que consta de una central de supramolecular activacin de clster (cSMAC) y un anillo circundante de molculas de adhesin. El modelo de formacin de sinapsis de clulas T estimuladas por condensacin balsa generado numerosas crticas. Los efectos del agotamiento de colesterol, por ejemplo, podra se explica por la pleiotrpica se ha mencionado anteriormente efectos de este tratamiento en, por ejemplo, Ca2 + influx13. Por otra parte, la sinapsis inmunolgica en s, examin por primera vez ser una plataforma estabilizada balsa, se encontr que era una dinmica structure59. TCR se abord por primera vez y activado en TCR microclusters, que son posteriormente transportados radialmente a los centros de contacto por la actina filamentos, generando un cSMAC, en el que los TCR muchos ya estn desfosforilado y inactive60 61,. Uso dual-color, una sola molcula de microscopa, microclusters Se han observado con las interacciones protena-protena la participacin de TCR, LAT, LCK y CD2 (pero no la fosfatasa CD45 (REF. 62)). Los datos sugirieron que difusional atrapando a travs de las interacciones protena-protena creado microdominios que incluyen la superficie especfica de la clula protenas para facilitar la sealizacin de clulas T. Un mutante no balsa de LAT que carecen de sitios palmitoylation estaba atrapado tambin por los microclusters, mientras que una construccin de balsa-asociado, la lpido modificado con amino terminal de LCK, no se concentr en el microclusters63 (Cuadro 1). Por lo tanto, no haba prueba directa de la participacin de los lpidos balsa, pero debera se observ que los lpidos no se incluyeron en el anlisis. Una cuestin importante en la sealizacin de clulas T es cmo TCR conectar a 10-100 molculas afines entre un pMHC total de clulas de la superficie de la piscina 104-105 molculas MHC en un APC64. La cintica de unin entre TCR y los cognado pMHC han sido evaluados mediante ingeniera las protenas en solucin, y slo afinidades dbiles y la disociacin tasas se observaron. Sin embargo, cuando la unin fue medido entre la TCR en la membrana celular de plasma T y los afines pMHC integrado en otra membrana, cintica acelerados y una ms de 100 veces mayor afinidad eran observed65, 66. Estos datos explican la reconocimiento rpido y eficiente de un APC y mostrar tambin que los TCR en serie pueden participar unos pocos pMHCs afines en un grande, auto-MHC fondo. El agotamiento de colesterol fue encontrado para reducir los efectivos de dos dimensiones afinidades entre TCR y pMHCs66.

Un problema en el campo es el estado oligomrico de los TCR antes de la interaccin con pMHCs. Existen informes contradictorios en cuanto a si es monovalent67, 68 o multivalent69, pero de alta resolucin de complejos mtodos de microscopa mostrar con hasta 7-20 TCR, que se manifiestan como protenas islas que son 70-140 nm de diameter70. Cmo pueden estos hallazgos se reconcilie con TCR monovalentes? Qu es el tamao molecular de un estado de reposo TCR? Uno de ellos sugiri posibilidad es que el contacto de una clula con una superficie de cristal perturba la organizacin de membrana de tal manera que la sealizacin dbil de los TCR se produce sin ligation71. Esto es una reminiscencia de clulas vivas anlisis por microscopa de fuerza fotnica, que concluy que ancladas a GPI dominios de la protena tiene un colesterol dependen de tamao de 50 nm72, mucho mayor que los <10 nm medido por homo-y hetero-FRET21. En estos experimentos, las perlas recubiertas con anticuerpos contra la protena anclada a GPI se inmovilizaron por un ptico trampa para medir la difusin sin obstculos de la clula superficie, y los efectos de la trampa de la vida y el tamao de los conjuntos de nanoescala, protenas ancladas a GPI no puede excluirse. Estos estudios por lo tanto, poner de relieve cmo condiciones experimentales pueden conducir fcilmente a divergente resultados. Si los estados de reposo de protenas balsa eran de hecho asociado con las asambleas nanoescala de lpidos balsa, tales como esfingolpidos y colesterol, a continuacin, estas variaciones en tamao podra surgir de la capacidad de estos coalescente estructuras fluctuantes. La estabilizacin de las fluctuaciones nanoescala estructuras podran reflejar un proceso fisiolgico en que aument el acceso a LCK media la estimulacin de TCR signalling73. Lipidmica se ha utilizado para medir inmunoaislados Dominios de activacin de TCR purific por recubrimiento perlas magnticas con TCR activadores de anticuerpos que se TCR induce la reticulacin. Cuando el lipidome de la inmunoaisladas dominios TCR se compar con similar reticulada receptor de transferrina de la membrana plasmtica dominios de las clulas T, los dominios de TCR fueron enriquecidos en esfingolpidos, fosfatidilcolinas saturadas (PtdChos) y plasmenyl fosfatidilserina (PtdSer) 39. En conjunto, estos datos son difciles de explicar sin suponiendo que la heterogeneidad de lpidos se funcionaliza para activar las clulas T. Lo que falta son datos sobre si y cmo el contexto de lpido alrededor de los receptores est cambiando desde el inactivo al estado activado, y viceversa. Este es un problema general en el campo balsa: cmo son los

Los depsitos de lpidos", los lpidos en contacto con las protenas balsa, compuesto y organized74? Hacer lpido-protena interacciones alostricamente cambiar conformaciones del receptor? La relevancia potencial de ensamblados dinmicos, Balsa de nanoescala para otros procesos de sealizacin en el que las balsas tienen han implicado es evidente, pero requiere un mayor anlisis. Un ejemplo es el concepto de prdida de sustentacin, en el cual grupos de GPI-anclado CD59 reclutar la subunidad de la protena G Gi2 y la Tyr quinasa LYN a travs de protena-protena y Balsa de las interacciones protena-, dando lugar a la inmovilizacin temporal del cluster por la unin a la actina filamentosa (F-actina) y la activacin de la seal por la fosfolipasa C2 (PLC2) 75. Virus en ciernes. Muchos virus adquirir un sobre membrana cuando gemacin de la membrana plasmtica de la clula husped. Algunos virus, incluyendo HIV76 y influenza77, parece que hacer esto mediante la organizacin de un dominio de balsa lipdica alrededor su nucleocpside que incluye glicoprotenas virales y excluye a la mayora de las protenas de la superficie celular de acogida de la naciente envoltura viral. La protena Gag del VIH, la matriz dominio de la que se ensambla con la glicoprotena Env en la membrana plasmtica, se convierte en detergente resistente mientras se conduce el proceso de gemacin (figura 4) y, adems, ciernes es el colesterol y esfingolpidos-dependiente. Si etiquetados toxina del clera se aplica a las clulas que expresan el VIH, Gag, GM1 y las protenas del virus de parches en distintos cogrupos que segregan lejos de grupos de no-balsa transferrina receptors76. Estos datos sugirieron que el montaje de la envoltura del virus en el plasma de la clula husped membrana consiste en la agrupacin de las balsas. En apoyo de esta hiptesis, la lipidome de partculas de VIH purificados mostraron que los esfingolpidos, colesterol, fosfatidiletanolamina plasmenyl (PtdEtn), PtdSer y saturados PtdChos fueron enriquecidos en la relacin membrana del VIH al total de la clula husped membranes41. Comparacin del VIH lipidome con la de la membrana plasmtica de la clula husped encontraron que el colesterol slo, el ganglisido GM3 y ceramide78 fueron altamente enriquecido en el virus envelope79. En consonancia con el enriquecimiento de los lpidos balsa, el viral membrana fue demostrado tener un embalaje de lpidos ordenados por espectroscopia utilizando la sonda fluorescente laurdan80, que informa orden membrana relativo, con la composicin lipdica siendo su principal determinante, en un experimental

de instalacin que no se ve afectada por geometry54. El fosfatidilinositol fosfoinositidos fosfato (PtdInsP) y PtdIns-4 ,5-bifosfato (PtdIns (4,5) P2) tambin son enriquecidos en el envelope79 VIH y PtdIns (4,5) P2 est obligado por Gag. Los modelos estructurales son emergiendo ahora de cmo la asociacin de PtdIns (4,5) P2 con Gag puede conducir reorganizacin membrana viral y gemacin. PtdIns (4,5) P2 est cargado negativamente debido a dos fosfatos en el grupo de cabeza y contiene inositol tanto un cido graso saturado y un poliinsaturado cido araquidnico. Por qu un fosfolpido con una cido graso poliinsaturado ser incluido en un dominio de balsa? Las protenas tales como Ala miristoilado rico en C-quinasa sustrato (MARCKS) y el crecimiento asociado a protena 43 (GAP43) que se unen a PtdIns (4,5) P2 se han propuesto para polimerizar y fuertemente racimo PtdIns (4,5) P2 en el folleto de citoslica de la membrana y la particin PtdIns (4,5) P2 en balsa domains81, 82. Pero la matriz dominio de la protena Gag puede hacer esto differenteEl dominio de la matriz de Gag, como en MARCKS, tiene un clster de aminocidos bsicos que se une al PtdIns (4,5) P2 y se tambin tiene un saturada de cido graso miristato en su trmino N enterrado en una hendidura hidrofbica. La hiptesis ha sido expuso que durante Gag multimerizes en ciernes y, sobre la unin a PtdIns (4,5) P2, el miristato de N-terminal queda expuesto en la superficie de dominio de matriz para insertar en el folleto de citoslica de la membrana plasmtica, a se sustituye por el poliinsaturado cido araquidnico flipping de la membrana en el bolsillo miristato en el dominio de la matriz. Este cambio dara como resultado un cluster de multmeros de colas de cidos grasos saturados que penetrar en la bicapa para promover la agrupacin balsa alrededor de la nucleocapsid83 Gag del VIH. Poliinsaturado cidos grasos tales como cido araquidnico tienen una extremadamente estructura flexible y muy desordenado, y el pobre embalaje con el colesterol podra promover el mover de un tirn de el poliinsaturados cadena en el bolsillo de la matriz domain84. Los virus ingeniosamente hacer uso del celular maquinaria para replicarse en las clulas husped. Si este postulado mecanismo de PtdIns (4,5) P2 interaccin con la matriz dominio es correcto, es probable que las protenas nativas celulares podra hacer uso de trucos similares para la asociacin con, o condensacin de, los dominios con balsas. Balsas en el trfico de membrana ER-a-Golgi trfico en la levadura. Protenas secretoras son insertado en la sala de emergencias y transportados por cubierta proteica II

(COPII) vesculas para el aparato de Golgi y, posteriormente, a su destinos finales. En el ER de levadura, protenas secretoras se clasifican en al menos tres tipos de salida ER site85. Dos de estos sitios se concentran principalmente soluble o transmembrana carga, maquinaria y principios COPII se encontr que ser necesario para estas funciones. El sitio tercera salida tambin produce vesculas COPII, pero COPII maquinaria no es obligado a concentrar su mayor parte anclada a GPI cargo85. Esta concentracin depende de la remodelacin de anclajes GPI con un anillo saturado, de cadena larga de cidos grasos o una ceramida que confiere detergente resistance86, 87. Defectos en GPI-ancla sntesis reducir drsticamente el total esfingolpidos levels88, y ER salida de protenas ancladas a GPI depende de ceramida synthases89, 90. Por lo tanto, la clasificacin mecanismo para este tipo de sitio de salida puede ser un concentracin de ceramidas que atrae a GPI-anclado protenas pero tiende a excluir a la mayora de transmembrana proteins85. Post-Golgi trfico a la superficie celular. Uno de los principales principios de la hiptesis de los lpidos balsa fue la prediccin que la maquinaria de transporte en la red trans-Golgi (TGN) de clulas epiteliales ordena los lpidos y protenas en vesculas portadoras comunes para la administracin dirigida a la surface91 apical o basolateral. El postulado apicalsurface portadores balsa se han mantenido esquivo y tener as ahora no ha sido aislado. En la levadura, tambin hay dos principales vas para acceder a la celda surface92: uno que transporta el plasma protenas de membrana (incluyendo protenas ancladas a GPI) directamente, y otro que utiliza endosomal compartimentos como una estacin intermedia para transportar soluble secretada protenas tales como la invertasa a la superficie celular (parecido al lo que se ha sugerido para la ruta basolateral en epitelio Madin-Darby de rin canino (MDCK) clulas). Una pantalla visual en todo el genoma identificado varios enzimas implicadas en la sntesis de esteroles y esfingolpidos que son esenciales para la entrega de una protena marcadora balsa a la clula surface93. As, los lpidos balsa de levadura, que son el ergosterol homlogo colesterol y tres clases de esfingolpidos (inositolphosphoceramide, manosil-inositolphosphoceramide y mannosyldiinositolphosphoceramide) 94, se muestra para regular la entrega de la carga detergente resistente al plasma membrana. De acuerdo con la nocin de balsa enriquecido transportistas, inmuno-aislamiento y cuantitativo posterior El anlisis por espectrometra de masas de TGN derivados de vesculas aislado utilizando una protena marcadora balsa como cebo mostr que ergosterol y esfingolpido levadura ms complejo,

manosil-diinositolphosphoceramide, fueron selectivamente enriquecida y fueron los lpidos ms abundantes en la vesicles40 transporte (figura 2). Estos fueron los primeros datos a dar apoyo experimental directa a la hiptesis de que protenas balsa carga sean entregados a partir del complejo de Golgi a la superficie celular en un vehculo balsa. Curiosamente, laurdan anlisis de las vesculas portadoras inmunoaisladas levadura mostr que sus membranas fueron ms condensada que la membrana del compartimiento donador, apoyando un cambio en la membrana de embalaje durante la clasificacin. El proceso de clasificacin de protenas y lpidos, por lo tanto, probablemente consiste en la agrupacin balsa para conducir la segregacin en el membrana de la TGN95. Estudios biofsicos de la levadura lpidos balsa han demostrado que pueden separarse en fases en dominios de lquido ordenadas y desordenadas-lquido en GUVs96. Por lo tanto, la formacin de la balsa-selectivo 100-nm vesculas portadoras, en la membrana de Golgi de levadura se concibe como una interaccin entre la agrupacin balsa (Inducida por protenas no identificadas), lnea de tensin y curvatura y la maquinaria adicional, incluyendo tensional fuerzas generadas por actina basada motores (figura 5b). La curvatura se probablemente facilitado por las protenas de flexin, como la barra de levadura (Bin-anfifisina-RVS) de protenas Rvs161 (reduccin de la viabilidad en protena inanicin 161), que se identific en la entrega membrana plasmtica pantalla. Glicoesfingolpidos endocitosis mediada. Las toxinas y los virus han demostrado ser herramientas importantes para el estudio de la endocitosis, ya que puede ser absorbido por la internalizacin diversos mechanisms97. En este sentido, consideramos que la toxina Shiga y el virus de polioma virus de simio 40 (SV40), ambos de los glicoesfingolpidos que se unen a receptores de la superficie como se internalizan por un glicoesfingolpido mediada agrupacin de proceso. Toxina Shiga utiliza tanto mediada por clatrina y nonclathrin dependiente endocytosis98. No clathrindependent endocitosis ha sido estudiada en detalle. La homopentameric toxina Shiga puede unir hasta 15 copias de su receptor globotriaosilceramida (Gb3) 99. Encuadernacin en la membrana de plasma causa la formacin de estrecha invaginaciones tubulares que utilizan la escisin dynamin maquinaria para ser liberado de la membrana plasmtica en el cytoplasm100. Formacin de tbulos no requiere energa, pero est regulado por tensin de la membrana. Estudios utilizando fases separadas GUVs mostr que la uninde la toxina Shiga a Gb3 se lleva a cabo en el lquido ordenada

fase, que induce una fase ms condensada y la segregacin de Gb3 en agrupaciones de alta densidad. Por otra parte, Toxinas Shiga a nivel local puede crear una tensin asimtrica en la hoja externa de la bicapa que conduce a la flexin hacia la protena; este efecto parece depender en forma de cua Gb3 species100 (figura 5a). Adems, las molculas de toxina en el cluster Gb3 puede experimentar interacciones atractivas, que se producan nicamente como resultado de membrana bending101. Estos efectos podran conducir juntos la formacin de tubules102. Adems, la fisin tbulo Tambin se ha propuesto que se produzca por una lnea impulsados por energa mechanism103. Cundo dynamin se inhibe en clulas, tbulos largos se crean en respuesta a la toxina de Shiga, que pueden ser liberados en una manera dependiente de colesterol por las condiciones que formacin dominio a favor como la refrigeracin o la actina polymerization103. La escisin tanto, se propone derivar de pellizco fsica como la recin creada dominios de minimizar la interaccin desfavorable con la membrana a granel, y no desde el 'pellizco' actividad de las GTPasas. De manera similar a la toxina Shiga, el virus SV40 se une a un glicoesfingolpido, el ganglisido GM1 (REF. 97). En este caso, la unin est mediada por la protena de la cpside pentamrica VP1. Despus de la unin, el parche GM1 se invagina hacia el citoplasma, generalmente encierra un virus en una vescula destinado para la ER. La unin de SV40 tambin puede ocurrir en caveolae, pero stas siguen siendo en su mayora en la celda surface97. En de fases separadas GUVs que contienen GM1, las estructuras virales se unen a la phase104 lquido ordenada. A diferencia nativo GM1 molculas que contienen largas cadenas de acilo que apoyan lnea de tensin basada en tubulacin, sinttico GM1 molecular especies con hidrocarburos corto particin cadenas a la lquido-fase desordenada y deteriorar la internalizacin y infeccin cuando se introduce en clulas husped que carecen de la versin original de este glicoesfingolpidos. La saturacin nivel de las cadenas de hidrocarburos afecta GM1 particionamiento de una manera similar. Finalmente, la separacin de multivalente unin por las toxinas y el virus parece ser importante como agrupacin anticuerpo no induce internalization104. Los estudios de protenas ancladas a GPI utilizando clathrinindependent vas de internalizacin han demostrado que protenas con lpidos artificial, insaturados pueden anchors105 se endocitosis junto con protenas ancladas a GPI que

tener anclajes normales, saturados, aunque no est claro cmo. Los enlazadores pueden formar enlaces de hidrgeno con ms '' Raftophilic molculas, como nativo GPI-anclado las protenas y las protenas podra ayudar ectodominios unidad internalizacin por interactions101 curvatura mediada. Un explicacin alternativa es que las protenas ancladas a GPI utilizar un simple, no especfica, por defecto (o mayor) para el proceso la captacin de lpidos unidos a protenas presentes en la exoplasmic (Luminal) Folleto del plasma membrane105. Los principios que emergen de estos estudios son que la agrupacin balsa puede llevar a la formacin de la membrana dominios que pueden brote fuera para formar las compaas que distribuyen balsa conjuntos especficos de los lpidos y de las protenas a diferentes post-Golgi destinos del secretora y endoctica vas. Estos mecanismos difieren de los utilizados por las compaas de transporte conocidos mediadas escudo, pero los mecanismos que rigen su generacin es poco entendido. Adelante mviles con balsas Aunque muchas funciones celulares tienen lugar en las membranas donde las protenas y los lpidos estn ntimamente mezclado, la investigacin en este campo ha evitado el estudio de cmo los lpidos y protenas funcionan juntos. Esta falta de atencin ahora est siendo subsanada por la constatacin de que las membranas se hacen funcional por lpido-lpido, lpido-protena y protenalas interacciones protena. Por ejemplo, ha sido recientemente muestra que las protenas de ajustar su longitud transmembrana y la composicin con las propiedades fsicas especficas de la diferentes membranas subcelulares en los que reside106,