ORDEN DEL INFORME DE PASANTAS A PRESENTAR AL TUTOR ACADMICO PARA SU RESPECTIVA EVALUACIN.

Proyecto de Pasanta, Anexo A Evaluacin del Tutor Empresarial, Anexo B ( Este formato se adjunta en la carta de tutor empresarial) Evaluacin del Tutor Acadmico, Anexo C (Este formato se adjunta en la carta para el tutor acadmico) Acta de evaluacin final Anexo D (Este formato se adjunta en la carta para el tutor acadmico) Informe final del Pasante (Anexo E, o en formato de artculo cientfico) Copia del certificado emitido por la institucin cooperarte.

En el caso de pasantas internacionales el estudiante deber elaborar un instructivo de Pasantas fuera del pas (Anexo F) establecido para el efecto, y que ser validado por el Vicerrector de Docencia al que se debe anexar una carta de aceptacin de la Institucin en la que realizar la pasanta, carta notariada donde se compromete a retornar al pas al trmino de la misma as como liberar de toda responsabilidad por cualquier inconveniente que se produzca en el periodo de ejecucin de la pasanta. Es responsabilidad del estudiante el trmite migratorio y los costos que involucren esta movilizacin. anexos: anexo a PROYECTO DE PASANTIAS anexo B EVALUCION TUTOR EMPRESARIAL anexo C EVALUCION TUTOR ACADEMICO ANEXO d aCTA DE CALIFICACIN ANEXO E INFORME DE PASANTAS ANEXO f fORMATO PASANTIAS FUERA DEL PAIS anexo g cRONOGRAMA DE ACTIVIDADES COOPERANTE

DE

LA

UNIVERSIDAD

ANEXO A Ejemplar No. 1 de 1 ESPE Carrera de Ingeniera en Biotecnologa Sangolqu, Provincia de Pichincha 03 08H00- Abril - 2013 IBBNP CARRERA DE BIOTECNOLOGA PROYECTO DE PASANTIAS
Nombre del Proyecto: Tcnicas de diagnstico molecular en microbiologa e Inmunogentica Fecha de Presentacin del Proyecto: 23 de enero del 2013 Institucin donde se realizar la Pasanta: Hospital Carlos Andrade Marn (HCAM) Laboratorio de diagnstico molecular. Direccin de la Institucin: Av. 18 de septiembre S/N y Ayacucho Telfono: 022-558126 E-mail: --------------------Propietario o gerente: Dr. Marcelo Grijalva Nombre del Pasante: David Zapata Tutor Acadmico Responsable: Dra. Mara Emilia Medina Tutor Empresarial: Dr. Marcelo Grijalva Duracin de la Pasanta: 1 mes Fecha de Inicio. 23 de enero del 2013 Fecha de Finalizacin. 23 febrero 2013 Horario Establecido: 12:00 pm- 19:00 N de horas 124 horas.

JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA.
Las pasantas pre-profesionales son las primeras experiencias laborales que realiza el estudiante en el transcurso de su etapa acadmica, de all su gran importancia pues aqu se pone en prctica los conocimientos adquiridos, y de esta manera con la experiencia que va desarrollando aclara dudas y refuerza contenidos. Por otra parte, Las pasantas son una de las mejores formas de tener un primer contacto con el mundo del trabajo, de entender cmo ser una futura relacin laboral, y de conocer cmo se aplica, en la prctica, los conocimientos tericos aprendidos.

OBJETIVOS DE LA PASANTIA.
Aplicar los conocimientos aprendidos en clase y en el laboratorio en situaciones reales de trabajo. Conocer ms acerca de las funciones generales de trabajo en los diferentes campos de la Biotecnologa. Aprender las habilidades relacionadas con la carrera de Biotecnologa en el rea de Biologa Molecular. Aprender el manejo de equipos de laboratorio en situaciones reales de trabajo. Obtener una mayor conciencia de las habilidades, atributos, cualidades y valores personales.

METAS.
Las pasantas pre-profesionales en el Hospital Carlos Andrade Marn de la Ciudad Quito, me permitirn adquirir destrezas y nuevos conocimiento en el rea de diagnstico molecular relacionada directamente a la biotecnologa.

INDICADORES DE RESULTADOS.
Cuantificacin de la infeccin por virus estimando la cantidad de partculas virales en los fluidos corporales, como por ejemplo ARN viral de HIV por milmetros de sangre, utilizando tcnicas de PCR. Determinacin y obtencin de perfiles HLA para determinar el grado de compatibilidad que exhibe la pareja receptor/donador para el trasplante de rganos slidos.

DESCRIPCIN DE LAS ACTIVIDADES QUE DESARROLLARA EN LA PASANTIA.

Extraccin de muestras sanguneas de pacientes Aprender el uso y funcin de los tubos Vaicutainer, para la recoleccin de muestras sanguneas.

Aprender el manejo, recoleccin y recoleccin de muestras biolgicas para la realizacin de los diferentes exmenes moleculares.

Anlisis de carga viral Perfil HLA Septifast Tomar las muestras de los pacientes con la posible infeccin Tomar los materiales y reactivos del kit Septifast de ROCHE. Realizar el protocolo establecido por el laboratorio. Colocar las muestras en el equipo Ligth Cycler para amplificar. Analizar y determinar el patgeno presente en la muestras. Extraer 2 alcuotas de sangre el donante y receptor. Realizar el protocolo de extraccin de ADN Determinar la Pureza del DNA de los individuos. Montar la SSP-PCR Cargar las muestras amplificadas de la PCR en el gel de agarosa Leer el perfil HLA en el gel mediante luz UV. Comparar resultados donante/receptor. Aprender los fundamentos moleculares de la tcnica CARGA VIRAL, mediante lecturas bibliogrficas. Conocer del manejo de Kit de reactivos para la ejecucin de la tcnica. Familiarizacin del protocolo de la tcnica molecular. Realizar el anlisis de carga viral mediante los resultados obtenidos de la PCR

RECURSOS.
Humanos: Pasante Jefe del Laboratorio de diagnstico molecular Encargada del Laboratorio Encargado de pasantes Tcnicos: Kits de Roche para diagnstico molecular Equipos de laboratorio de Roche o Termociclador. o Equipos para PCR o Equipos para electroforesis. o Tubos Vaicutainer o Cmaras de flujo o Magna Lyser

o o o

Centrifugas Micropipetas Agitadores

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.
(Siguiente Hoja)

PRESUPUESTO.
Transporte Alimentacin 0,50 centavos/Da 2,50 dlares/Da 12 dlares 60 dlares TOTAL: 72 dlares.

FIRMAS DE RESPONSABILIDAD. Pasante: ______________________ Tutor Acadmico: ___________________

ANEXO E Ejemplar No. 1 de 1 ESPE Carrera de Ingeniera en Biotecnologa Sangolqu, Provincia de Pichincha 03 08H00- Abril- 2013 IBBNP

CARRERA DE BIOTECNOLOGA INFORME DE PASANTIAS Nombre del Proyecto:

Tcnicas de diagnstico molecular en microbiologa e Inmunogentica.

JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA.
El diagnstico molecular engloba un conjunto de tcnicas moleculares empleadas para la determinacin de patologas humanas genticas o infecciosas, detectando marcadores celulares, material gentico patognomnico del agente etiolgico infectante en la muestra y alteraciones genticas causantes de la patologa (Universidad Catlica de la Santsima Concepcin, 20??). Las tcnicas realizadas en el Laboratorio de Diagnstico Molecular del HCAM, son de suma importancia para la deteccin de enfermedades en la poblacin del Ecuador y mediante la observacin y realizacin de las mismas podremos conseguir un conocimiento ms amplio sobre las diferentes reas de la Biotecnologa y de esta manera mejorar nuestra formacin como profesionales. Entre las que ms destacables se encuentran: Carga viral:

En los tiempos, se ha dilucidado mucho sobre la patognesis del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), mediante tcnicas moleculares y biotecnolgicas y con la informacin obtenida se han desarrollado nuevas estrategias, como la cuantificacin del RNA del HIV basada en la tecnologa (PCR, Polimerase Chain Reaction). Como resultado, han aparecido nuevas estrategias para el diagnstico y el tratamiento de la infeccin por HIV las cuales estn consiguiendo una prolongacin de la vida en los enfermos infectados (Moreno, 1998). La cuantificacin de la carga viral del virus HIV es factor muy importante para que los mdicos tomen las mejores decisiones sobre las terapias ms efectivas en este grupo de pacientes.

En estudios retrospectivos y prospectivos se ha demostrado que la medida de las concentraciones de RNA del virus HIV suministra una informacin muy til para el pronstico, debido a que ayuda a identificar a aquellos pacientes que tienen un alto riesgo de que la enfermedad progrese. Por tanto, la medida de la carga viral, permite ajustar las terapias y minimizar la potencial morbilidad relacionada con el HIV (Moreno, 1998). Septifast.

LightCycler Septi-Fast es un test multiplex de importancia ya que permite la rpida deteccin e identificacin de 25 especies patognicas, como bacterias (Gram +/-) y hongos causantes de infecciones nosocomiales, en tan slo unas horas mediante la PCR en tiempo real. SeptiFast detecta las bacterias y hongos patgenos directamente de la sangre total, sin necesidad de realizar un precultivo. Tipificacin de HLA

Antgenos Leucocitarios Humanos (HLA) HLA Clase I: HLA-A y HLA-B HLA Clase II: HLA-DR Estudio mediante el cual se determina cuales de todas las variantes conocidas del locus HLA estn presentes en un individuo determinado. El grado de semejanza que presentan los HLA del receptor y el de los posibles donantes es de gran utilidad para la seleccin del donante adecuado para trasplante de rganos y de mdula sea.

OBJETIVOS DE LA PASANTIA.
Aplicar los conocimientos aprendidos en clase y en el laboratorio en situaciones reales de trabajo. Conocer ms acerca de las funciones generales de trabajo en los diferentes campos de la Biotecnologa. Desarrollar destrezas relacionadas con la carrera de Biotecnologa en el rea de Diagnstico Molecular. Aprender el manejo de equipos de laboratorio en situaciones reales de trabajo. Obtener una mayor conciencia de las habilidades, atributos, cualidades y valores personales.

INDICADORES DE RESULTADOS.
Carga viral: Los resultados de las pruebas de carga viral se dan en copias por mililitro de sangre (C/ml). Cada virus lleva dos copias de ARN. Si se encuentran 100.000 copias de ARN del VIH, quiere decir que hay 50.000 partculas de virus (o viriones). Cobas TaqMan 48 permite de forma automtica en tiempo real la amplificacin y deteccin de RNA hasta un mnimo de 25 copias/ml de virus.

Septifast: Esta prueba es un ensayo de cidos nucleicos in vitro, que permite identificar fragmentos amplificados de DNA concretos de 25 patgenos que integran bacterias y hongos a partir de la temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature), que es especfica para el fragmento amplificado que se est buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la observacin de la curva de disociacin de las muestras de DNA analizadas Perfil HLA: Para estudiar los antgenos HLA este laboratorio utiliza la tcnica de Biologa molecular PCR-SSP (Sequence Specific Primers) de baja resolucin, la cual nos permite amplificar secuencias de DNA correspondiente a los alelos de los genes de HLA-I y HLA-2. El perfil HLA del donante y del receptor se lo obtiene mediante el anlisis de las bandas corridas en el gel de agarosa. Por cada alelo similar entre donante y receptor existe la probabilidad de un 12,5% de que el rgano no sea rechazado.

DESCRIPCIN DE LAS ACTIVIDADES DESARROLLADAS EN LA PASANTIA.

Recoleccin y procesamiento de muestras sanguneas: La muestras sanguneas se extraen mediante una jeringa de 15ml y se las coloca en tubos Vaicutainer de diferentes colores, que indican el examen diagnostico sugerido por el mdico tratante. Dichos tubos llevan un cdigo de barras que revelan la historia clnica del paciente y el tipo de examen a realizar.

Una vez recolectadas las muestras se procede a archivar en la base de datos los cdigos sealados en los tubos. Seguido a esto, las muestras sanguneas entran a la etapa de procesamiento que consiste en la centrifugacin de las muestras previamente colectadas y la toma de alcuotas en los tubos ependorf de sangre y suero. Se coloca el cdigo y el nombre del paciente en la tapa y al costado del tubo. La muestras se almacenan en el ultracongelador a -80C.

Carga viral: Para la prueba de carga viral se selecciona las muestras de plasma u otros fluidos destinados a este anlisis. Posteriormente, de las muestras hay que extraer el RNA del virus mediante un proceso de lisis viral y a continuacin se utiliza la reaccin en cadena por la polimerasa (PCR) usando el Taqman 48 para realizar una amplificacin del material gentico con objeto de poderlo cuantificar mediante una reaccin colorimtrica y el uso de un estndar de cuantificacin que se incorpora a cada una de las muestras. Estos pasos se los realiza mediante kits de biologa molecular provistos por Roche. En la amplificacin de cidos nucleicos para cuantificar la cantidad de virus HIV, CMV, HCV y HBV se requiere muy poca cantidad de muestra, obtenindose resultados precisos y seguros para cada paciente. Septifast: En esta prueba se seleccionan las muestras de sangre, principalmente de neonatos y pacientes con SIDA, los cuales presentan sntomas de enfermedades nosocomiales. Se coloca a las muestras sanguneas en el MagNa Lyser Instrument 3.0 donde se provoca la lisis celular. Seguido a esto se procesan las muestras lisadas, agregando los reactivos de Roche que contienen las sondas y los primers especficos, con los cuales se procede a realizar la PCR, amplificando as los fragmentos de DNA especficos para cada patgeno. Finalmente el software genera un reporte, que ser enviado a mdico tratante.

Perfil HLA: - Extraccin de DNA: Para proceder a la extraccin de DNA, las muestras congeladas de 1,6ml se atemperan hasta que se tornen lquidas. Las muestras son colocadas en el agitador orbital comprobando la lisis celular, se centrifuga a 10 000 rpm por 10 minutos, se descarta el sobrenadante con la ayuda de una micropipeta sin alterar el pellet. Se resuspende al pellet en agua grado biologa molecular y se agregan los buffers de lisis, ligamiento y lavado. Se calcula la pureza utilizando el espectrofotmetro. Finalmente la muestra de DNA pura se rotula y se almacena adecuadamente a -80C. - Montaje PCR SSP. La amplificacin de los alelos HLA se realiza mediante PCR-SSP (polymerase chain reactionsequence specific priming) y la especificidad se determina por los iniciadores (primers). Cada par de iniciadores utilizados amplifica uno o varios alelos. El nmero total de iniciadores utilizados deber amplificar todos los alelos conocidos para el locus a determinar. Cada pozo contienen un par de iniciadores control que reacciona con una secuencia de DNA diferente a las regiones polimrficas HLA, y que sirve como control interno para todo el proceso de amplificacin. La metodologa de esta tcnica se enumera a continuacin: 1. Obtencin del DNA con una pureza de 1.7- 1.9 (relacin entre la absorbancia del DNA y de las protenas). 2. Preparar las mezclas de reaccin. 3. Amplificacin de las mezclas de reaccin en el termociclador. Realizar electroforesis en un gel de agarosa.

La corrida electrofortica se realiza en un gel de agarosa al 2%, donde en cada posillo se coloca el DNA amplificado previamente en la PCR-SSP.

Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de alimentacin. Se comprueba que est bien conectada. Se programa la fuente a unos 100 voltios y se comienza a correr la electroforesis que durar unos 30-45 minutos.

Anlisis e interpretacin de los resultados

Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiza una fotografa de la imagen.

Finalmente, se realiza el perfil HLA del donante y receptor, mediante el conteo de las bandas amplificadas y el uso de la lista de alelos para HLA-I y HLA-2, provista por Roche.

RESULTADOS ALCANZADOS
Las pasantas pre-profesionales desarrolladas en el laboratorio de Diagnstico Molecular del Hospital Carlos Andrade Marn (HCAM), me permitieron aplicar los conocimientos aprendidos en clase en situaciones reales de trabajo. Adems pude adquirir destrezas con los equipos, instrumentos y reactivos que se utilizan en el rea de Biologa Molecular. A travs de la carga viral se report el nmero de copias de VIH presente en cada mililitro de sangre. Esta prueba se usa para control teraputico de virosis crnicas de los enfermos con HIV, a fin de mostrar la efectividad de las distintas combinaciones de antiretrovirales. Mediante la prueba Septifast se obtuvo la amplificacin de fragmentos de DNA que corresponden a los patgenos presentes en la sangre de los enfermos infectados. Mediante este reporte el mdico tratante puede recetar los antibiticos especficos para combatir la enfermedad. Por medio de la tipificacin del HLA (human leukocyte antigens) se pudo observar si dos personas donante/receptor son compatibles para realizar el trasplante de un rgano slido, medula sea y sangre de cordn umbilical.

DISCUSIN DE LOS RESULTADOS

En los ltimos aos, las tcnicas de diagnstico molecular han avanzado en formas considerables, las cuales han permitido la determinacin de patologas humanas genticas e infecciosas, detectando material gentico del agente infectante en la muestra. Se ha aprendido mucho sobre la patognesis de los virus causantes de enfermedades incurables. Con la informacin obtenida se han desarrollado nuevas terapias, como los inhibidores de la proteasa, antivirales y nuevas tcnicas diagnsticas, las cuales estn consiguiendo una prolongacin de la vida en los enfermos infectados. En cuanto a los antgenos HLA (Antgenos Leucocitarios Humanos) estos pueden ser identificados a partir del DNA obtenido de los leucocitos de los receptores y donantes mediante tcnicas moleculares avanzadas. Las antgenos HLA presentes en las superficies de las clulas nucleadas, son las encargadas de que el sistema inmune diferencie lo propio de lo extrao e induzcan una respuesta inmune de rechazo en el receptor de un trasplante, por tal motivo es importante buscar el donante ms compatible. El sistema HLA, el ms polimrfico conocido en el humano. Existen dos clases de molculas HLA, las de tipo I, HLA-A, -B y C, y las de clase II, HLA-DR, -DQ y DP. La funcin habitual del sistema HLA consiste en reconocer pptidos y exhibirlos en la superficie de las clulas presentadoras de antgenos, como los macrfagos, para que sean revisados por las clulas T y se establezca una distincin entre los antgenos propios y los extraos. Segn Araceli, 2005. Las molculas HLA de clase I son conocidas como antgenos clsicos de trasplante, ya que fueron los primeros descubiertos durante el estudio de la respuesta a un aloinjerto. Sin embargo, las de clase II, detectadas posteriormente, son las de mayor importancia para asegurar una adecuada histocompatibilidad. Las infecciones nosocomiales son un importante problema de salud pblica en los pases industrializados, principalmente en Europa y los Estados Unidos de Amrica. En el Ecuador, el inters de las infecciones nosocomiales como causa de mortalidad entre la poblacin hospitalizada es relativamente reciente. Esto se debe probablemente a que el concepto de infeccin nosocomial est fuertemente asociado a la gestin hospitalaria y a la utilizacin de antibiticos. La identificacin del agente bacteriano en una infeccin intrahospitalaria se lo puede realizar mediante tcnica moleculares basadas en la reaccin en cadena por la polimerasa (PCR).

CONCLUSIONES.
Los mtodos actuales para medir carga viral son reproducibles y fiables hasta concentraciones inferiores a 200 copias por mililitro, pudindose medir en todas las fases de la infeccin: aguda, seroconversin y cuando los pacientes son asintomticos. La determinacin exacta de patgeno causantes de enfermedades de gran relevancia, se puede realizar mediante tcnicas moleculares, las cuales permiten la amplificacin de fragmentos de DNA especficos para cada microrganismo. Con esta informacin los

mdicos pueden garantizar que el antibitico suministrado inhibir el crecimiento y causar la muerte del agente patgeno. El uso de los mtodos moleculares para la tipificacin de los alelos HLA clases I y II tienen un papel importante dentro de las tcnicas utilizadas en un laboratorio de histocompatibilidad, por ofrecer algunas ventajas en comparacin con los mtodos serolgicos tradicionales: flexibilidad en la resolucin, reproducibilidad y mayor precisin. La adecuada histocompatibilidad entre receptor y donador, establecida a travs del estudio de los antgenos del sistema HLA, es esencial para garantizar la larga duracin del injerto y la ptima supervivencia del receptor.

BIBLIOGRAFA:
1. United Network for Organ Sharing (UNOS). Disponible en: http://www.unos.org/ 2. Hopkins, Catherine A. The basic lymphocyte microcytotoxicity tests. En: American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, editor. Laboratory manual. Standard and AHG enhancement, volume I. Fourth edition. USA: ASHI; 2000. p. 1-7. 3. Gorodezky C. Manual de procedimientos serolgicos y celulares de histocompatibilidad. Mxico: INDRE;2003 p. 7880. 4. Rodey-Glenn E. HLA beyond tears. Second edition. Houston, USA: Durango, CO De Novo; 2000. p. 117-148. 5. Bunce M, Welsh K. PCR-SSP typing of HLA class I and class II alleles. En: American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, editor. Laboratory manual. Standard and AHG enhancement. Volume II. Fourth edition. USA: ASHI; 2000. p. 1-10 6. HLA Informatics Group. Disponible http://www.anthonynolan.com/HIG/index.htm en: 14. Informacin incluida en el estuche de Amplicor HIV-1 Monitor Inmunodeficiency Virus screening assays. J Clin Microbiol 1998; 36: 2235-2239. Donie F, Melchior W, Upmeier B, Seidel CH, Faatz E. A new generation of HIV diagnostic assay: Results of the evaluation of Enzymun Test HIV Combi. Roche Diagnostics, Nonnenwald 2, D-82377 Penzberg, Germany 8. Ho DD. Time to hit HIV, early and hard. N Engl J Med 1995;333:450-451 6. O'Brien WA, Hartigan PM, Martin D et al. Changes in plasma HIV-1 RNA and CD4+ lymphocyte counts and the risk of progression to AIDS. N Engl J Med 1996;334:426-431 9. Informacin incluida en el estuche de Indinavir 10. Informacin incluida en el estuche deNorvir 11. Informacin incluida en el estuche deInvirase 12. Informacin incluida en el estuche deEpivir 13. Saag MS et al. Interim guidelines for clinical use of plasma human HIV RNA levels. Nature Medicine 1996;2:625-629

7. Weber B, Mbargane Fall H, Berger A, Doerr HW. Reduction of diagnostic window by new fourth generation Human

ARCHIVO DIGITAL EN FORMATO PDF A SER ENVIADO POR MAIL A LA CORDINACIN

Certificado de la institucin donde realizo la pasanta (en caso de tener) La primera hoja del anexo A (hasta fechas de inicio y finalizacin incluido el nmero total de horas) Anexos de evaluacin: tutor empresarial anexo B), tutor acadmico (anexos C y D) Finalmente un resumen de mximo 250 palabras de su pasanta.

Mail: ravalos@espe.edu.ec