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AVVISO PER LA PRESENTAZIONE DI PROPOSTE PROGETTUALI PER LATTUAZIONE CONGIUNTA DELLA DOTE RICERCATORI E DELLA DOTE RICERCA APPLICATA

PER LO SVILUPPO DEL CAPITALE UMANO NEL SISTEMA


UNIVERSITARIO LOMBARDO

Spett.le Regione Lombardia - Direzione Generale Istruzione Formazione e Cultura Piazza di Lombardia, 1 Milano 20124

RELAZIONE SEMESTRALE DI PROGETTO


Id beneficiario: Denominazione beneficiario: Id progetto: Titolo del progetto: 4189 FENILI FABIO 16346 SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE, CHIMICHE, DELLA TERRA E LORO APPLICAZIONI Nuove poli(ammidoammine) contenenti gruppi guanidinici da utilizzare come polimeri antivirali e nanogeli di poli(ammidoammina) come sistemi per la veicolazione di proteine.

Obiettivi iniziali del progetto

In questo progetto saranno sintetizzate nuove poli(ammidoammine) (PAA) aventi diversa architettura e struttura e studiate come agenti antivirali e sistemi per la veicolazione intracellulare di proteine. Le PAA costituiscono una famiglia di polimeri versatili la cui struttura e comportamento polielettrolitico, che influenzano la loro tossicit, internalizzazione e traffico cellulare, possono essere appositamente modulati a seconda dellapplicazione biologica richiesta. La maggior parte di esse solubile in acqua, biocompatibile e biodegradabile. Il primo obiettivo del progetto si basa su una serie di risultati promettenti indicanti che una PAA anfoterica contenente gruppi carbossilici, tert-amminici e guanidinici, chiamata AGMA1, possiede una notevole attivit antivirale. Tale attivit sembra essere dovuta alla peculiare struttura del polimero ed esercitata attraverso un meccanismo diverso da tutti i polimeri anionici testati finora. Sar quindi preparata e valutata una libreria di nuove PAA di strutture e architetture diverse ma recanti gli stessi gruppi guanidinici. Sar eseguito uno screening preliminare di tutti i campioni sintetizzati in termini di attivit antivirale in vitro ed in vivo nei confronti dei virus Herpes Simplex e Papilloma umano. Questo studio ha lo scopo di ottenere informazioni sulla loro modalit dazione ed ottenere nuovi prodotti ad elevata attivit antivirale. La seconda parte del progetto riguarder lo sviluppo di nuovi nanogeli di PAA cationiche ed anfoteriche contenenti unit di , ciclodestrina. I nanogeli saranno preparati mediante omogeneizzazione ad alta pressione di sospensioni acquose e saranno studiati come sistemi per la veicolazione intracellulare di proteine sulla base di alcuni risultati preliminari ottenuti recentemente. Ciascun campione verr caratterizzato e saranno determinate la capacit di assorbire proteine ed il loro profilo di rilascio in funzione del pH. Saranno inoltre eseguiti test biologici preliminari.

Attivit svolte nel corso del progetto

Sessione1: PAA come polimeri antivirali In questo primo anno di attivit sono state sintetizzate nuove PAA aventi gli stessi gruppi funzionali di AGMA1 ma con diversa struttura ed architettura macromolecolare, in particolare: derivati di AGMA1 contenenti residui glicilici mediante reazione di poliaddizione tra acido 2,2-

bis(acrilammido)acetico e 4-(glicilammino)butilguanidina e metilenebisacrilammide con glicil-L- o Darginina; campioni ramificati di AGMA1 attraverso un metodo sintetico basato sull'introduzione di piccole quantit di etilendiammina (EDA) unitamente ad un eccesso controllato della stechiometria dei gruppi reattivi per evitare la reticolazione della miscela di reazione; campioni di AGMA1 a diverso peso molecolare che saranno utilizzati come riferimenti per lo studio dellattivit antivirale dei nuovi polimeri sintetizzati.

Infine, sono in corso le sintesi di alchilguanidine a diversa lunghezza della catena alchilica: 2-amminoetilguanidina, 3-amminopropilguanidina, 5-amminopentilguanidina e 6-amminoesilguanidina. Utilizzando questi nuovi monomeri saranno preparati campioni polimerici al fine di valutare leffetto della distanza tra i gruppi carbossilici e guanidinici sullattivit antivirale. Sessione 2: nanogeli di PAA come veicolanti intracitoplasmici di proteine In questo anno di attivit sono stati preparati nuovi nanogeli a base di PAA anfoteriche e cationiche come sistemi per la veicolazione di proteine bioattive utilizzando come reticolanti , e -ciclodestrine (-, - e -CD). Tutti gli idrogeli sintetizzati sono stati caratterizzati mediante misura del rigonfiamento in diversi solventi e degradazione in condizioni fisiologiche simulate Nanogeli di PAA sono stati ottenuti attraverso una procedura di tipo top-down che consiste in una macinazione meccanica degli idrogeli rigonfiati in soluzione acquosa attraverso un omogeneizzatore UltraTurrax seguita da omogeneizzazione ad alta pressione in acqua (HPH). I nanogeli cos ottenuti sono stati caratterizzati mediante microscopia ottica, misura delle dimensioni in soluzione e del potenziale .

Risultati ottenuti

Sessione1: PAA come polimeri antivirali In questo primo anno di attivit sono state sintetizzate nuove PAA aventi gli stessi gruppi funzionali di AGMA1 ma con diversa struttura ed architettura macromolecolare. Sono stati sintetizzati derivati di AGMA1 contenenti residui glicilici mediante reazione di poliaddizione tra acido 2,2bis(acrilammido)acetico e 4-(glicilammino)butilguanidina (schema 1) e metilenebisacrilammide con glicil-L- o Darginina (schema 2).
NH2 O O HO O O HN 1: H2O LiOH r.t. 10 giorni 2: HCl HO O

O N O NH

N H

N H NH H2N NH

N H

N H

HN H2N NH

Schema 1: Sintesi del polimero BAC-glicilammino butilguanidina

NH2 O O N H N H NH H2N NH HN H2N NH O HN O OH 2: HCl HO 1: H2O LiOH r.t. 10 giorni

O N H N H

O N O O NH

Schema 2: Sintesi del polimero MBA-glicilarginina

Le reazioni di polimerizzazione sono state condotte in acqua, a temperatura ambiente, per un tempo di reazione di 10 giorni. I polimeri sono poi stati isolati come cloridrati mediante ultrafiltrazione su membrana con cut-off 3000 e successiva liofilizzazione. 1 13 Entrambi sono stati caratterizzati mediante spettroscopia H e C NMR. I pesi molecolari sono stati determinati mediante GPC con viscosimetro e rilevatore light-scattering ottenendo i seguenti risultati: BAC-glicilammino butilguanidina (BAC-GB): MBA-glicilarginina (MBA-GA): 18600; 23500; 35800; PD: 1.52. Resa: 66%

24200; PD: 1.30. Resa: 58%

Al fine di ottenere informazioni sugli effetti del peso molecolare sullattivit antivirale, i campioni sono stati frazionati su membrane a diverso cut-off come riportato in Tabella 1. Le analisi DLS, potenziale e MALDI-TOFF sono attualmente in corso.
Tabella 1: Risultati del frazionamento dei polimeri BAC-glicilammino butilguanidina e MBA-glicilarginina Membrana Polimero cut-off (Da) BAC-GB 10 BAC-GB 20 BAC-GB 40 MBA-GA 10 MBA-GA 20 MBA-GA 40 10000 20000 40000 10000 20000 40000 Resa (%) 28.37 20.68 13.65 29.45 21.52 15.61 8100 17600 32100 7400 16300 30700 10100 20900 38500 10200 21000 39600 1.25 1.19 1.20 1.38 1.29 1.29 PD

Sono stati preparati campioni ramificati attraverso un metodo sintetico basato sull'introduzione di piccole quantit di etilendiammina (EDA) unitamente ad un eccesso controllato della stechiometria dei gruppi reattivi per evitare la reticolazione della miscela di reazione.
O N H COOH O N H H N H2N H 2N NH 2 NH

NH 2

Schema 3: Rappresentazione schematica di un polimero iper-ramificato di AGMA1 con EDA

Nelle policondensazioni coinvolgenti monomeri recanti ciascuno due funzioni complementari a e b, dove a per convenzione la funzione minoritaria, uno dei parametri pi importanti il rapporto stechiometrico iniziale r, definito come: dove Na ed Nb sono il numero di funzioni inizialmente presenti. Si puo definire il grado di avanzamento della reazione come: dove Na e il numero di funzioni di a presenti al tempo di analisi. Per definizione si ha che entrambi i valori di r e p devono essere 1. Le policondensazioni che coinvolgono monomeri con pi di due gruppi funzionali possono portare a prodotti reticolati insolubili. Quando le funzioni relative al monomero polifunzionale sono solo di un tipo, il grado di avanzamento critico pc viene rappresentato dalla formula di Flory-Stockmayer (Equazione 1): Equazione 1 dove il rapporto tra le funzioni appartenenti al monomero con funzionalita>2 rispetto al numero totale di funzioni dello stesso tipo presenti inizialmente nel sistema. Per valori di p>pc il sistema perde mobilita e per questa ragione pc e anche chiamato punto di gelazione. Si nota bene come pc ed r siano correlate. In particolare esiste un rapporto stechiometrico critico, rc, al di sotto del quale il sistema non in grado di reticolare e porta alla formazione di polimeri iper-ramificati, ma ancora solubili. Dal momento che sia p che pc non possono avere valori maggiori di 1, il valore teorico di rc (Equazione 2) si ottiene dallEquazione 1 ponendo pc=1 e risolvendo in r, ottenendo: Equazione 2 rc il parametro chiave per il controllo delle reazioni di poliaddizione in presenza di monomeri multifunzionali. Infatti, se r>rc si ottengono prodotti reticolati, mentre per r circa uguale ad rc si ottengono prodotti iper-ramificati ma ancora solubili. Si riporta di seguito una tabella riassuntiva con le percentuali di EDA utilizzata, i valori di r e rc calcolati in modo da ottenere prodotti iper-ramificati solubili, la resa di reazione ed i pesi molecolari dei polimeri ottenuti.
Tabella 2: Risultati dei polimeri iper-ramificati di AGMA1 con EDA Polimero AGMA1-EDA1 AGMA1-EDA3 AGMA1-EDA5 AGMA1-EDA7 EDA (%) 1 3 5 10 r 0.97 0.94 0.86 0,83 rc 0.9804 0.9434 0,8772 0,8333 Resa (%) 66,4 57,4 35,2 25,20 14320 10140 7980 5450 16890 13200 9850 7600 PD 1.18 1.30 1.23 1.39

Le sintesi sono state eseguitein soluzioni acquose diluite (20% in peso di solidi), a 25 C termostatati e per un tempo di reazione di 21 giorni. Eventuali microgeli sono stati eliminati per filtrazione. Tutti i polimeri sono stati caratterizzati mediante 1 13 spettroscopia H e C NMR. Le analisi DLS, potenziale e MALDI-TOFF sono attualmente in corso. Sono stati sintetizzati anche campioni di AGMA1 a diverso peso molecolare che saranno utilizzati come riferimenti per lo studio dellattivit antivirale dei nuovi polimeri sintetizzati.

H2 N O N H COOH O N H NH HN NH2 1: LiOH 2: HCl H2O N2 r.t.

O N H

COOH O N H N

HN

NH NH2

Schema 4: Sintesi del polimero AGMA1

Le frazioni a diverso peso molecolare sono state ottenute adottando tempi di reazioni diversi e differenti membrane per lultrafiltrazione durante il processo finale di isolamento come riportato in Tabella 3.
Tabella 3: Risultati delle frazioni a diverso peso molecolare di AGMA1
Tempo Polimero reazione (h) AGMA5 AGMA10 AGMA20 48 76 240 di Membrana cut-off (Da) 3000 5000 10000 Resa (%) 28.37 25.68 23.65 3700 7800 16400 5100 10100 20500 1.38 1.29 1.29 PD

Tutte le frazioni sono state caratterizzate mediante spettroscopia 1H e 13C NMR. I valori dei potenziali a diversi pH sono riportati in Tabella 3.
Tabella 4: potenziali a diversi pH dei polimeri AGMA5, AGMA10 e AGMA20 Polimero AGMA5 AGMA10 AGMA20 pH= 4.0 +23.811.25 +27.611.25 +31.611.0 pH= 6.0 +20.160.77 +18.701.5 +21.041.74 pH= 7.4 +13.290.88 +13.290.46 +13.540.74

Aliquote di 500 mg di ciascun polimero sintetizzato sono state inviate presso i laboratori della prof.ssa Cavalli Roberta dellUniversit di Torino per test biologici preliminari (effetti sulla vitalit cellulare, l'attivit emolitica, il potenziale tossicologico ed infiammatorio). Infine, sono in corso le sintesi di alchilguanidine a diversa lunghezza della catena alchilica: 2-amminoetilguanidina, 3-amminopropilguanidina, 5-amminopentilguanidina e 6-amminoesilguanidina. Utilizzando questi nuovi monomeri saranno preparati campioni polimerici al fine di valutare leffetto della distanza tra i gruppi carbossilici e guanidinici sullattivit antivirale. Dopo unaccurata ricerca bibliografica, sono stati addottati due approcci sintetici diversi: 1. Mediante reazione tra cianammide e la corrisponde alchildiammina in soluzione di acido cloridrico concentrato a reflusso per 1 ora
H2 C n HCl reflux 1h H2 C NH N nH NH2

H2 N

NH2

H2 N C N

H2 N

Schema 5: Sintesi di alchilguanidine a partire da cianammide e diammine.

2. Mediante reazione tra solfato di tiouronio e la corrisponde alchildiammina in soluzione acquosa per 8 ore

H2N

H2 C n

NH 2 NH2 H2N S SO 42 2

H 2O, r.t., 8 h H2N

H2 C

NH N nH NH2

Schema 6: Sintesi di alchilguanidine a partire da solfato di tiouronio e diammine.

Sono attualmente in corso le caratterizzazioni strutturali mediante spettroscopia 1H e 13C NMR dei prodotti sintetizzati.

Sessione 2: nanogeli di PAA come veicolanti intracitoplasmici di proteine In questo anno di attivit sono stati preparati nuovi nanogeli a base di PAA anfoteriche e cationiche come sistemi per la veicolazione di proteine bioattive. Sono stati sintetizzati idrogeli di PAA utilizzando come reticolanti , e -ciclodestrine (-, - e -CD). E stato infatti dimostrato che in condizione alcaline, le CD si comportano come monomeri polifunzionali in quanto i loro gruppi idrossilici partecipano alladdizione di Michael nei confronti di bisacrilammidi. In particolare, il lavoro svolto durante questo semestre stato focalizzato su due particolari classi di poli(ammidoammine): 1. La prima famiglia di poli(ammidoammine), codificata ISA 23, si ottiene mediante reazione di poliaddizione tra acido 2,2-bis(acrilammido) acetico (BAC) e 2-metil-piperazina (MP). E un polimero anfotero, biodegradabile e biocompatibile, dotato di propriet stealth: non viene cio riconosciuto dal sistema immunitario ed ha pertanto un tempo di permanenza prolungato nel circolo ematico.
O COOH O

N H

N H

Figura 5:Struttura del polimero ISA23

2. La seconda famiglia di poli(ammidoammine), codificata ISA 1, ottenuta per reazione di addizione di Michael tra bis(acriloil)piperazina (BP), 2-metilpiperazina (MP) e bis(idrossietil-etilendiammina) (DHEEDA). E un polimero cationico, biodegradabile e biocompatibile che possiede attivit membranolitica.
HO O O O O N N N N N N N N

OH

Figura 6:Struttura del polimero ISA1

Tutti i prodotti sono stati sintetizzati in soluzione acquosa, per un tempo di reazione di 4-10 giorni.

H O OH O OH O HO OH O O OH OH O O O OH OH OH OH HO O OH O

HO

OH O

HO HO

O O OH O O OH O OH OH N H

COOH N H

O HN NH

O HO OH O O OH O HO O OH O OH O O O OH O HOOC O NH O OH O HO O OH O OH O O O OH O HOOC O NH O OH HO OH OH HO HO O NH HO OH O O OH OH O O OH O N H HO COOH N H OH O O O OH OH HO HO HO O O OH O OH HO O O N H

COOH N H

O N N

COOH N H N H OH HO O OH O

O O OH O O HO HO OH O HO OH HO O O OH O O O OH O H O O OH HO OH O

OH

O O O

O N N N H

COOH N H

O OH

HOOC OH O OH O NH

NH

O O O OH

O N H

COOH O N H N N

OH

NH

Schema 7: Sintesi degli idrogeli di ISA23- CD

Poich in ambiente alcalino le CD si comportano da monomeri polifunzionali, sono stai addottati due diversi gradi di reticolazione impiegando 2 o 3 equivalenti di LiOH per mole di CD e quantit di - e -CD dal 5 al 50% in peso, come riportato in Tabella 4 per gli idrogeli a base di ISA23 ed in Tabella 5 per quelli a base di ISA1.
Tabella 5: Reagenti utilizzati nella sintesi degli idrogeli di ISA23 con - e -CD Grado di Tempo di reticolazione reazione (giorni) 10 15 30 50 50 50 10 8 6 6 5 4

Codice ISA23.3.10% ISA23.3.20% ISA23.2.30% ISA23.3.50% ISA23.2.50% ISA23.3.50%

BAC mmoli 9,31 9,31 3,99 5,32 5,32 9,31

MP mmoli 4,42 4,3 1,69 1,99 1,99 4,19

-CD mmoli / 0,7 / 1,33 / /

-CD mmoli 0,47 / 0,6 / 1,33 0,93

LiOH mmoli 1,4 2,09 1,2 3,99 2,66 2,79

Rapporto CD/LiOH 1/3 1/3 1/2 1/3 1/2 1/3

Tabella 6: Reagenti utilizzati nella sintesi degli idrogeli di ISA1 con - e -CD Grado di Tempo di reticolazione reazione (giorni) 10 15 30 50 10 8 6 6

Codice ISA1.3.10% ISA1.3.20% ISA1.2.30% ISA1.3.50%

BP mmoli 9,31 9,31 3,99 5.32

MP mmoli 2,21 2,15 0,845 0,995

DHEEDA mmoli 2,21 2,15 0,845 0,995

-CD mmoli / 0,7 / 1,33

-CD mmoli 0,47 / 0,6 /

LiOH mmoli 1,4 2,09 1,2 3,99

Rapporto CD/LiOH 1/3 1/3 1/2 1/3

ISA1.2.50% ISA1.3.50%

5.32 9,31

0,995 2,095

0,995 2,095

/ /

1,33 0,93

2,66 2,79

1/2 1/3

50 50

5 4

Gli idrogeli sono stati purificati mediante estrazioni con acqua ed etanolo (3 cicli, 1 ora per ciascun solvente). Sono stati eseguiti i rigonfiamenti in diversi solventi (acqua, etanolo e tampone PBS 0,02M a pH=7.4). Il rigonfiamento percentuale stato calcolato secondo lEquazione 3: Equazione 3 dove Wt il peso del campione di idrogelo dopo 5 giorni di rigonfiamento e Wo il peso del campione secco.

Figura 7:Rigonfiamento degli idrogeli di ISA1 ed ISA23 con - e -CD

Entrambe le famiglie di idrogeli con - e -CD sono materiali soffici e molto idrofilici, come dimostrano gli elevati valori di rigonfiamento percentuale. Inoltre, come si pu notare in Figura 3, il grado di rigonfiamento diminuisce allaumentare del contenuto di CD ed allaumentare del grado di reticolazione. La degradazione dei campioni di idrogelo di ISA23 con - e -CD con 2 equivalenti di LiOH stata studiata in tampone PBS 0,1 M a pH=7,4 a 37 C per mimare le condizioni fisiologiche. La degradazione del materiale espressa come perdita in peso percentuale calcolata secondo lEquazione 4: Equazione 4 dove Wt il peso del campione di idrogelo secco degradato al tempo t e Wo il peso del campione secco iniziale.

Figura 8:Degradazione in tampone PBS 0,1M a 37C degli idrogeli ISA23 con - e -CD

Tutti i prodotti mostrano una degradazione costante nel tempo. La completa degradazione stata raggiunta tra i 50 ed i 60 giorni. Nanogeli di PAA sono stati ottenuti attraverso una procedura di tipo top-down che consiste in una macinazione meccanica degli idrogeli rigonfiati in soluzione acquosa (300 mL di acqua bidistillata) attraverso un omogeneizzatore UltraTurrax (13000 rpm per 80 minuti) seguita da omogeneizzazione ad alta pressione in acqua (HPH). Questo lavoro stato effettuato presso lUniversit di Torino, in collaborazione con la Prof.ssa Roberta Cavalli. Tutti i campioni sono stati caratterizzati mediante microscopia ottica, DLS e misure del potenziale .
Tabella 7: Dimensioni delle particele e potenziali degli idrogeli di ISA23 con- e -CD Potenziale (mV) Codice Dimensioni (um) valore ISA23.3.10% ISA23.3.20% ISA23.2.30% ISA23.3.50% ISA23.2.50% ISA23.3.50% 299,00 283,00 236,00 354,00 316,00 317,00 -34,59 -27,26 -25,13 -25,50 -26,83 -27,74 0,98 0,54 0,89 0,64 0,43 0,83

Su questi campioni verranno inoltre eseguiti test biologici preliminari al fine di determinare la loro citotossicit e loading di molecole biologicamente attive e lipofile quali desametasone e progesterone, valutandone il rilascio e la solubilit.

Figura 9:Microscopia ottica dei nanogeli di ISA23 con- e -CD (40x)

Luogo e data

Milano, 21 gennaio 2013 ,

Del responsabile scientifico di Dipartimento