PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARASO

FACULTAD DE INGENIERA
ESCUELA DE INGENIERA BIOQUMICA






(ICB 690): Laboratorio de Bioprocesos
FERMENTACIN PILOTO DE Kluyveromyces marxianus EN
CULTIVO POR LOTE
Muy buen trabajo, aunque los resultados no se muestran claros.
No estoy de acuerdo con la justificacin de tan elevados rendimientos,
se valora la intencin de discutir los resultados. (Aunque existe
confusin entre resultados y discusiones.)
Es interesante el balance para obtener los rendimientos.
Alumnos:
Nez, Toms
Soto, Erik
Tapia, Carlos
Wiche, Pia
Profesores:
Conejeros, Ral
Romero, Oscar






(Abril) 2009
Resumen
El presente laboratorio tuvo como objetivo principal la produccin de biomasa del
microorganismo K. marxianus utilizando como sustrato lactosa en una fermentacin a nivel
piloto. Para ello se realiz la propagacin del microorganismo en un fermentador de menor
escala (12 [l] de volumen til), lo que luego se utiliz como inculo en el reactor de tamao
piloto (120 [l] de volumen til).
El manejo de los fermentadores se realiz de acuerdo a las condiciones de esterilidad
necesarias y se operararon manteniendo la temperatura a 38C y regulando el pH entre 4,8 y
4,5.
Para la fase de propagacin, el medio de cultivo se dise para mantener la fase
exponencial de crecimiento del microorganismo desde el final del segundo da hasta inicios
del tercer da (un total de 15 [h]). Se utiliz un volumen 12 [l] de medio de cultivo, el que
contena lactosa, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, fosfato de potasio, extracto de
levadura, sulfato de hierro y cloruro de calcio. La concentracin final de clulas obtenida fue
la estimada, es decir 10[g/l].
Para la fase de fermentacin, el fermentador piloto cont con un medio de cultivo que
permitiera sostener la fase exponencial del microorganismo por las 7 [h] que se estim que
deba durar el proceso. Fue durante este tiempo que se procedi a determinar la cintica de
crecimiento del microorganismo y consumo de lactosa del mismo, tomando muestras en
intervalos de 30 [min]. Se comenz con una concentracin de 1,6[g/l] y una concentracin
final de 17,3 [g/l], siendo mucho mayor a la estimada en alrededor de 11 [g/l].
A partir de los datos obtenidos se determin que el rendimiento de lactosa en clula (YX/S)
para Kluyveromyces marxianus fue de 0,76 [g.levadura /g. lactosa], la produccin
volumtrica de biomasa fue de 3,88 [g/l*h] y el crecimiento especifico presentado fue
notablemente alto, de 0,61[h
-1
].
i
ndice General

pgina
1 Introduccin 1
2 Objetivos 2
2.1 Objetivo General 2
2.2 Objetivos especficos: 2
3 Revisin Bibliogrfica 3
3.1 Antecedentes generales de Kluyveromyces marxianus 3
3.2 Cultivo por lotes 4
3.2.1 Cintica de crecimiento 5
3.2.2 Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato en fermentacin por lotes 6
3.2.3 Consumo de Oxgeno en fermentacin por lote 7
3.2.4 Condiciones de operacin a utilizar en fermentacin por lote 8
4 Materiales y mtodos 9
4.1 Materiales 9
4.1.1 Material de laboratorio 9
4.1.2 Reactivos 9
4.1.3 Equipos 11
4.2 Mtodos 12
4.2.1 Espectrofotometra 12
4.2.2 Determinacin de la concentracin de azcares reductores 13
4.2.3 Determinacin de la concentracin celular 15
4.2.4 Diseo del medio de cultivo 16
4.2.5 Preparacin de los medios de cultivo 17
4.2.6 Control de pH 18
4.2.7 Adicin de Antiespumante 18
4.2.8 Control de la Aireacin 19
4.2.9 Calibracin de los electrodos 19
4.2.10 Esterilizacin 20
4.2.11 Traslado del medio 22
4.2.12 Manejo de la Caldera 23
4.2.13 Lavado del Fermentador Piloto y del Biolaffitte 23
5 Resultados 24
5.1 Concentracin de biomasa en el tiempo para fermentador piloto 24
5.2 Concentracin de lactosa en el tiempo para fermentador piloto 24
5.3 Rendimiento global de biomasa en sustrato 25
5.4 Productividad volumtrica de biomasa 26
5.5 Velocidad especfica de crecimiento 26
5.6 Estimacin de rendimientos de oxgeno y biomasa por medio del balance de la
reaccin 26
6 Discusiones 28
7 Conclusiones 33
8 Referencias 34
A Apndices 36
ii
ndice de Tablas
Tabla 4.1. Resumen de la composicin de los medios de cultivo utilizados. 10
Tabla 4.2 Caractersticas de los fermentadores a utilizar en la experiencia 12
Tabla 4.3. Composicin de los medios de cultivo utilizados en el desarrollo de la experiencia
y la masa de reactivo que se agreg en cada caso. 18
Tabla 5.3 Concentraciones de biomasa obtenidas al inicio y final de cada fermentacin 25
iii
ndice de Figuras
Figura 3.1 Curva tpica de crecimiento microbiano, con las 4 primeras fases del crecimiento
4
Figura 5.1Curva de crecimiento de Kluyveromyces marxianus a 38C y pH 4.8
244
Figura 5.2 Consumo de lactosa en el tiempo por Kluyveromyces marxianus en un medio a
38C y pH de 4,8
255
Figura 5.3 Curva del crecimiento logartmico de biomasa v/s tiempo, para la obtencin de la
Velocidad Especfica de Crecimiento
266
1
1 Introduccin

En la actualidad la produccin de levadura ha adquirido mucha importancia para distintos
tipos de industria, como la produccin de cerveza, pan, vino, entre otros fermentados, e
incluso para la produccin de enzimas. Para el exitoso desarrollo de la fermentacin es
necesario considerar ciertos requisitos para estimular una adecuada produccin de biomasa.

El presente informe tiene como objetivo reportar los resultados obtenidos durante la
experiencia llevada a cabo en la planta piloto, adems del anlisis de los mismos. Se realiz
la fermentacin a nivel piloto del microorganismo Kluyveromyces marxianus, con el objetivo
de generar biomasa en condiciones aerobias. Para la fermentacin con el microorganismo K.
marxianus, se utiliz como sustrato limitante la fuente de carbono (lactosa).

Una adecuada estrategia de produccin est basada en el conocimiento de distintos
parmetros caractersticos del microorganismo de inters, tales como, velocidad especfica
de crecimiento, rendimiento de fuente de carbono en biomasa y productividad volumtrica.

La esterilidad dentro del fermentador es indispensable para el buen desarrollo del proceso y
la mantencin de la cepa de inters. De haber proliferacin de otra(s) especie(s), se puede
generar competencia por los nutrientes, lo que puede reducir el rendimiento global del
proceso o simplemente inutilizarlo. Adems, el equipo debe poseer un sistema de control
que permita el manejo de las variables controladas del sistema, como el pH, temperatura,
agitacin, flujo de gas de aireacin, entre otros.

2
2 Objetivos
2.1 Objetivo General
El objetivo de esta experiencia fue determinar la cintica de crecimiento y de consumo de
lactosa de K. marxianus en una fermentacin realizada a escala piloto, a 38C y un pH de 4,8
+ 0,4, para la produccin de biomasa.
2.2 Objetivos especficos:
- Obtener un aumento de 10 veces en la concentracin de biomasa dentro del reactor.
- Lograr condiciones de esterilidad en la operacin.
- Disear y preparar un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de la levadura
Kluyveromyces marxianus.
- Controlar condiciones de operacin de forma de obtener el mximo rendimiento
posible durante la fermentacin.
- Determinar rendimiento y productividad volumtrica para una fermentacin por lote a
escala piloto de Kluyveromyces marxianus
3
3 Revisin Bibliogrfica
3.1 Antecedentes generales de Kluyveromyces marxianus
K. marxianus es una especie de levadura muy estudiada por sus aplicaciones industriales,
siendo algunas de estas la produccin de etanol y de enzima b-galactosidasa. Se ha
estudiado su uso para produccin de la enzima b-galactosidasa y etanol usando medios de
cultivo definidos y complejos, principalmente extracto de levadura y suero de queso. (Banat,
1996; Hack, Marchant, 1998; Chinappi y Snchez, 2000).
Kluyveromyces marxianus es una levadura que presenta caractersticas de Crabtree
negativa (Graciano, 2007), lo que indica que produce biomasa en presencia de altas
concentraciones de glucosa, al contrario de las Crabtree positivas, que fermentan la fuente
de carbono a alcohol cuando sta se encuentra en cantidades excesivas.
Otra caracterstica importante a sealar de K. marxianus es que presenta altas velocidades
de crecimiento, estando dentro de las ms altas de entre todas las levaduras (Graciano,
2007). Se han reportado velocidades de crecimiento de K. marxianus en lactosa de 0,59 [h
-1
]
(Krzystek, Ledakowicz, 2000). Por otro lado, estas velocidades se ven justificadas en parte
por el comportamiento termotolerante que posee esta levadura (Hack, Marchant, 1998),
pudiendo soportar temperaturas de 45C con velocidades especficas de crecimiento de 0,6
[h
-1
] en condiciones aerbicas.
Dentro de los estudios revisados, tambin se indica los rendimientos de lactosa en biomasa.
Estos rendimientos estn en el orden de 0,36 a 0,49 [g biomasa/g lactosa] (Chinappi y
Snchez, 2000; Longhi et al, 2004).
Para la fermentacin realizada con el microorganismo K. marxianus, se utiliz como sustrato
limitante la lactosa (fuente de carbono). K. marxianus es capaz de degradar la lactosa debido
a su produccin de la enzima b-galactosidasa, la que posee una accin intracelular y cuya
accin es inducida por la presencia de lactosa.

4
3.2 Cultivo por lotes
La modalidad de cultivo por lotes se caracteriza por no tener entradas ni salidas de masa
desde o hacia el sistema durante la operacin, salvo el intercambio gaseoso (inyeccin de
aire y salida de gases). Se lleva a cabo en un fermentador, en el cual se utiliza slo un 60 a
80% de su capacidad total, aproximadamente. Es aconsejable dejar una cabeza de aire en
el fermentador, para evitar el derrame de lquido por efecto de la agitacin y adems el evitar
salida de medio por causa de espuma.
El cultivo debe comenzar con una adecuada concentracin de biomasa. El tamao del
inculo debe ser de un 10% del volumen total de fermentacin, para evitar retrasos
excesivos en la proliferacin del microorganismo (Mateos, 2000).
Al monitorear la concentracin de biomasa durante un cultivo por lotes, se pueden observar
3 fases caractersticas: fase de latencia (o lag), fase de crecimiento exponencial (o fase log)
y fase estacionaria. A estas se agregan dos ms, la fase de muerte y fase de crecimiento
crptico, que se observan dependiendo del tiempo del estudio (Acevedo et al, 2002). Las
primeras 4 fases pueden observarse en la figura 3.1

Figura 3.1 Curva tpica de crecimiento microbiano, con las 4 primeras fases del crecimiento
Se puede observar que en un cultivo por lotes se trabaja en rgimen no estacionario, ya que
las condiciones ambientales (como la concentracin de nutrientes y clulas) varan en el
tiempo. Otros factores, como el pH y la temperatura, deben ser regulados durante el cultivo
si se desean mantener dentro de ciertos lmites.
5
En el desarrollo de la fermentacin se llevar a cabo dos etapas: la primera consiste en la
propagacin de los microorganismos para generar la biomasa inicial de fermentacin y la
segunda es la fermentacin de K. marxianus a escala piloto. Para cada una, se aplican los
criterios presentados en los prrafos anteriores.
3.2.1 Cintica de crecimiento
Se considera que el crecimiento microbiano, o aumento de biomasa, se puede modelar a
travs de una cintica de primer orden, que depende de la velocidad especfica de
crecimiento, como se describe a continuacin (Acevedo et al, 2002).
N
dt
dN
=
Ecuacin 1
Donde:
N
: Nmero de microorganismos

: Velocidad de crecimiento especfica [h

-1
]
: Tiempo [h]

La velocidad especfica de crecimiento depende de las condiciones de ensayo, en particular
de la disponibilidad de la fuente de carbono (u otro nutriente limitante) y oxgeno (para
cultivos aerobios), el pH y la temperatura (Atkinson et al, 1986). Es deseable mantener estas
variables controladas (y mejor an, constantes) para poder determinar con precisin la
velocidad especfica de crecimiento en tales condiciones, y de esta forma poder disear
equipos y procesos. Si alguna de estas variables cambiara notablemente durante el
desarrollo de la experiencia, lo hara tambin la velocidad de crecimiento especfica. Esta
variacin inutilizara la experiencia tanto para propsitos de diseo como de estudio, puesto
que es en base a esta velocidad que se determinan los tiempos de reaccin, y de aqu los
tamaos de los reactores.
La velocidad especfica de crecimiento tiene un comportamiento del tipo Monod,
dependiendo de la concentracin de sustrato limitante en el medio. Es decir, la velocidad
especfica aumenta si lo hace tambin la concentracin de sustrato. A altas concentraciones
de sustrato limitante, la velocidad de crecimiento especfica encuentra un valor mximo, al
que se denomina velocidad de crecimiento especfica mxima, y se denota como .
t
max

6
3.2.2 Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato en fermentacin por lotes
Las ecuaciones utilizadas en la determinacin de biomasa y sustrato en la experiencia de
laboratorio se explicitan a continuacin (Acevedo et al, 2002). El crecimiento de la biomasa
microbiana est representado por:
XV
dt
dXV
= Ecuacin 2
Dado que en un cultivo por lotes el volumen (V) se puede asumir constante, se utilizan slo
las concentraciones inicial y final para el clculo del tiempo. El tiempo calculado corresponde
slo a aquel en que se desarrolla el crecimiento exponencial de la poblacin bacteriana. Para
un cultivo por lote, la expresin es:
0
0
ln *
t
X
t o bien X X e
X

= = Ecuacin 3
Donde:
: Velocidad especfica de crecimiento, en [h
-1
]. Para el periodo exponencial, se
considera constante e igual a
max
, dado que la oferta de sustrato supera a la demanda.
X: Concentracin de biomasa a tiempo t, [g/l]
X
0
: Concentracin inicial de biomasa, [g/l]

Se define el rendimiento celular (Y
X/S
) como:
S
X
Y
S X
A
A
=
/
Ecuacin 4
Donde:
S: Concentracin de sustrato consumido por el microorganismo, [g/l]
X: Diferencia entre la concentracin inicial y final de clulas, [g/l]
Y
X/S
: Rendimiento de la clula en sustrato [g/g]
Reordenando la ecuacin anterior, se obtiene:
S Y X S Y X
S X S X
+ =
/ 0 0 /
Ecuacin 5
Se puede relacionar la velocidad de aparicin de biomasa y la de consumo de sustrato,
como sigue:
7
/
/
x s
x s
dX dS
Y
dt dt
dS X
dt Y

=
=
Ecuacin 6
El rendimiento tambin puede ser expresado como la fraccin del elemento de inters en el
compuesto partido por la fraccin del elemento en la clula, multiplicado por un factor (f).
f
E
E
Y
X
C
S X
=
%
%
/
Ecuacin 7
Donde:
C
E %
: % del elemento en la fuente
X
E %
: % del elemento en la clula
f
: Factor de correccin para el aprovechamiento de la fuente de carbono

f es un factor que da cuenta de la real utilizacin de la fuente de carbono en la clula. A
mayor f , mayor es el traspaso de carbono desde la fuente a la clula. El factor toma
diferentes valores segn el metabolismo del microorganismo. Si el microorganismo utiliza la
va aerobia, este factor tendr un valor estimado entre 0,5 a 0,6. Esto quiere decir que los
microorganismos aerobios generan ms masa celular que los anaerobios a partir de una
misma masa de fuente de carbono.
Esta forma de clculo se utiliza principalmente para estimar el rendimiento terico de cada
nutriente y principalmente del nutriente limitante, con fines de preparacin de los medios de
cultivo.
3.2.3 Consumo de Oxgeno en fermentacin por lote
Las levaduras, como Kluyveromyces marxianus, son organismos anaerobios facultativos, por
lo que pueden vivir en presencia o en ausencia de oxgeno. En condiciones aerobias, oxidan
la fuente de carbono mediante los procesos de: gliclisis, ciclo de Krebs y cadena de
transporte de electrones. En condiciones anaerobias proceden a fermentar la fuente de
carbono, produciendo etanol. En metabolismo aerobio la fuente de carbono se aprovecha
ms que en fermentativo, en trminos de produccin de biomasa (Acevedo et al, 2002).
8
La demanda de oxgeno depende de la naturaleza del microorganismo y de su medio
ambiente nutricional. Por ejemplo, al tener la glucosa una mayor tasa de consumo que otros
sustratos, la demanda de oxgeno que genera es mayor. El oxgeno que consumen los
microorganismos es aquel que se encuentra disuelto en el fermentador. Su solubilidad
depende de la composicin del medio y debe ser constantemente renovado para que las
clulas puedan seguir reproducindose. Por ejemplo, se reporta que para la respiracin de
una poblacin de levadura con una densidad de 10
9
[clulas/ml] el contenido de oxgeno en
el medio debe renovarse unas 12 veces por minuto para suplir la demanda celular de
oxgeno (Doran, 1998). Es claro, a partir de lo anterior, que la tensin de oxgeno disuelto es
un parmetro importante para el crecimiento y velocidad de crecimiento, afectando tambin
la sntesis de enzimas.
Se ha reportado en el caso especfico de K. marxianus, que al comparar esta con otras
levaduras como S. cerevisiae o K. lactis, K. marxianus posee una demanda de oxgeno
mucho mayor, por lo que se debe tener presente una aireacin adecuada para que el
sustrato limitante sea la fuente de carbono y no el oxgeno (Pinheiro et al.2002).
3.2.4 Condiciones de operacin a utilizar en fermentacin por lote
Para la eleccin de las condiciones de operacin utilizadas en la fermentacin se tomaron
valores recomendados de acuerdo a varios trabajos previamente realizados con esta cepa,
como se mostrar a continuacin.
En el caso de la temperatura, se ha reportado que la temperatura ptima para el crecimiento
de K. marxianus se encuentra alrededor de los 38 + 2C. (Longhi et al. 2004). Dentro de este
rango se observa la mayor velocidad especfica de crecimiento.
En relacin al pH ptimo para realizar la fermentacin de K. marxianus se consider dentro
del rango de 4,8 0,4 de acuerdo a estudios similares con esta cepa (Rech et al, 2007). El
pH debi ser regulado constantemente, puesto que el consumo de sulfato de amonio, con la
correspondiente liberacin de protones, produce la acidificacin del medio.
9
4 Materiales y mtodos
4.1 Materiales
4.1.1 Material de laboratorio
A continuacin se da una lista de los materiales utilizados durante la experiencia:
- Pipetas de 1 [ml], 5 [ml] y 10 [ml]
- Propipetas
- Micropipeta y puntas
- Vasos precipitados 100 [ml], 500 [ml] y 1 [l]
- Esptulas
- Pinzas
- Celdas para espectrofotmetro
- Capachos de centrifugacin
- Gradillas
- Papel aluminio
- 50 tubos de ensayo con tapa
- Matraces de aforo de 500 [ml]
- Bidn de 15 [l] para esterilizar medio de propagacin
- Algodn y gasa
- 1 matraz Erlenmeyer de 2[l] (para salida de gases desde el fermentador)
4.1.2 Reactivos
Medio de Cultivo
La composicin de los dos medios de cultivo utilizados durante la experiencia, resultaron
muy similares al ser diseados, por lo que se decidi usar la misma composicin para
ambos.
En la
10
Tabla 4.1 se resumen las cantidades de cada nutriente utilizado para los volmenes
respectivos. Adems, se agrega la cantidad de antiespumante y tampn utilizados
11
Tabla 4.1. Resumen de la composicin de los medios de cultivo utilizados.
Compuesto
Concentraci
n [g/l]
Masa agregada
medio cultivo
fermentador
Biolaffitte [g]
Volumen de
reactivo
agregada
fermentador
Biolaffitte[ml]
Masa
agregada
medio cultivo
fermentador
piloto [g]
Lactosa 22,46 224,6 2743,2
Sulfato de amonio 3,49 34,9 426
Sulfato de magnesio 0,3 3 36
Fosfato de potasio 0,86 8,6 104,4
Sulfato de Hierro 0,83 8,3 102
Cloruro de Calcio 0,05 0,5 7,2
cido Clorhdrico 0,7 7
Hidrxido de Sodio 100
cido Ctrico 10,5
Citrato Disdico 11,8
Antiespumante 1 10
Extracto de levadura 10 100 1200
Salida de aire del fermentador
- Sulfato de cobre pentahidratado
Reactivo DNS
- cido Dinitrosaliclico
- Hidrxido de Sodio
- Tartrato de Sodio y Potasio
Tampn Citrato
- cido Ctrico
- Hidrxido de sodio 1 [N]
- cido clorhdrico 0.1 [N]
Implementos de seguridad
- Cascos
- Antiparras de proteccin
- Guantes de cuero o descarne
- Guantes de ltex
12
4.1.3 Equipos
- Placa calefactora; modelo IKA RH, Alemania.
- Agitador de tubos; modelo VM-300; marca Boeco.
- Balanza analtica: Chyo JS 110, YMC Co. Japan.
- Espectrofotmetro: Shimadzu double-beam, modelo UV-150-02, Corporacin Kyoto
Japn.
- Balanza Granataria: Sartorius, 2240, Sartorius Werke ag. Alemania, rango 0 a
100[g] precisin +- 0.1 [g].
- Termmetro de mercurio; rango de 0-150 , Quimis, Brazil
- Mangueras para presin Masterflex.
- Termocirculador elctrico y mangueras
- Caldera: Marca Ingecyc, 2 [bar] de presin mxima.
- Autoclave ETS. Laqueus S.A. Modelo 19961. Francia, 1970.
- Bomba peristltica Masterflex Modelo 7549-40, Cole Palmer Instruments con
capacidad para una manguera de alimentacin 50-490 [rpm], 230 VAC, 50/60 [Hz].
- Centrifuga Tabletop, modelo PLC-05, 1000-4000 [rpm]
- Estufa, modelo ULM 600, temperatura mxima 220C.
- Reactores
En la
13
Tabla 4.2 4.2 se indican las caractersticas de los reactores a utilizar durante la primera
experiencia de laboratorio.
14
Tabla 4.2 Caractersticas de los fermentadores a utilizar en la experiencia
Caractersticas
Fermentador de
propagacin
Fermentador Piloto
Denominacin
Fermentador Biolafitte
n123770, tipo C5,
Maisons-Laffitte.
Fermentador a escala
piloto
Material Acero inoxidable Acero inoxidable
Volumen [l] 15 120
Capacidad (Volumen til) [l] 10 100
Sistema de agitacin
Rotor Antiriebstechnik 1410
rpm. Tres agitadores de
paleta plana
Rotor Siemens, Rapp Ratio
21,9. Dos agitadores de
paleta plana
N deflectores Dos Cuatro
Sistema de intercambio de
calor
Serpentn interno
Serpentn interno. Circuito
de agua externo
(chaqueta).
Sistema de aireacin
Mediante manguera de
burbujeo
Mediante dispersor en la
base del reactor
Sistema de captacin de gases
Los gases son inyectados
en una solucin de CuSO4
Los gases son inyectados
en una solucin de CuSO4
Sistema de control de pH Solucin tampn Electrodo de pH
Sistema de control de
temperatura
Control manual mediante
termmetro.
Termocirculador elctrico
que proporciona calor al
agua de calefaccin, sta
es recirculada mediante
una manguera conectada
con el serpentn interior
Control automtico.
Se utiliza vapor de la
caldera alimentada al
serpentn interior, se enfra
con una chaqueta externa
de agua fra.
4.2 Mtodos
4.2.1 Espectrofotometra
La medicin de biomasa se realiza mediante el fundamento de la ley de absorcin, tambin
llamada ley de Lambert-Beer. Esta ley indica cuantitativamente la forma en que el grado de
atenuacin de la luz depende de la concentracin de las molculas absorbentes y de la
longitud del trayecto en el que ocurre la absorcin. Cuando la luz atraviesa un medio que
contiene un analito absorbente, disminuye su intensidad como consecuencia de la excitacin
del analito (Douglas et al, 2004). Cuanto ms largo sea el medio por el que pasa la luz,
existirn ms molculas o tomos absorbentes en el trayecto, y por tanto ser ms la
atenuacin. La ley de Lambert-Beer se expresa en la Ecuacin 8.
15
c l k A = Ecuacin 8
Donde:
A
: Absorbancia
k
: Constante de proporcionalidad de absortividad, [l/(gcm)]
l
: Longitud del trayecto del medio de absorcin, [cm]
c
: Concentracin de analito absorbente, [g/l]
Sabiendo que esta relacin es directamente proporcional, se puede utilizar para hacer una
regresin lineal de absorbancia versus concentracin. As se puede obtener una ecuacin
que relacione ambas variables y permita conocer la concentracin de las muestras problema,
slo con obtener su absorbancia. Adems, para no tener problemas con las otras molculas
que no son de inters, es necesario calibrar el espectrofotmetro para la longitud de onda
caracterstica del analito a determinar.
Dentro de las limitaciones de esta ley se encuentran el que el comportamiento de absorcin
slo ocurre en soluciones diluidas. Otra de estas limitaciones es que si se est midiendo la
concentracin de levaduras, es posible que el tamao de las clulas interfiera en la medicin
de la concentracin, ya que si es relativamente grande se obtendr una mayor absorbancia
por el fenmeno descrito anteriormente.
Tanto la determinacin de biomasa como la de azcares reductores fueron realizadas a
travs de espectrofotometra, como se detallar a continuacin.
4.2.2 Determinacin de la concentracin de azcares reductores
Es una tcnica de xido-reduccin que se basa en la capacidad de los azcares reductores,
como la lactosa, para reducir el cido 3,5dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas
condiciones. Esta reduccin produce una coloracin que se hace ms intensa a medida que
aumenta la concentracin de azcares reductores. Se evidencia por medio de la lectura de la
absorbancia en espectrofotmetro, lo que conlleva a la aplicacin de la Ley de Beer-Lambert
(Miller, 1959). La longitud de onda explicitada en el mtodo es de 540 [nm].
El fundamento de esta tcnica consiste en la oxidacin de la lactosa, para lo cual es
necesario abrir la molcula, que es cclica. Esto se consigue aplicando calor y
proporcionando condiciones alcalinas. Para lograrlo, se prepara el reactivo DNS adicionando
16
hidrxido de sodio (NaOH). El grupo hidroxilo del NaOH causa la oxidacin de la lactosa. En
esta oxidacin, el carbono del grupo aldehdo se convierte en un cido carboxlico,
obtenindose cido glucnico. Por otro lado, el DNS es reducido gracias a la accin de
tartrato de sodio y potasio y a la oxidacin de la lactosa. El cido se transforma en cido 3-
amino-5-nitrosaliclico, produciendo una coloracin amarilla. Esta coloracin es proporcional
a la concentracin de lactosa, y su relacin se conoce a travs de la construccin de una
curva patrn.
La curva patrn se construye efectuando el mtodo sobre un conjunto de muestras de
concentracin de azcar reductor conocida. Los puntos se grafican como concentracin en el
eje de las abscisas, versus absorbancia en el eje de las ordenadas.
El reactivo DNS se degrada en el tiempo por factores ambientales, como la incidencia de luz,
lo que puede afectar su capacidad reductora sobre la lactosa.
Preparacin del reactivo DNS
- En 50ml de agua destilada se disuelven 1,6 [g] de NaOH
- En la solucin anterior se disuelve adems 30 [g] de tartrato de sodio potasio
- Calentar con agitacin y lentamente se agrega 1 [g] de cido dinitrosaliclico.
- Dejar enfriar
- Aforar a 100 [ml]
- Se mantiene a temperatura ambiente y protegido de la luz.
Curva patrn del DNS
- Se prepararon 500 [ml] de solucin estndar de lactosa de concentracin 1,5 [g/l] en
agua destilada. A partir de este estndar se prepar una batera de 9 tubos con
concentraciones que variaron entre los 0 y 1,5[g/l]
- Se tomaron alcuotas de 1 [ml], de cada tubo y se adicionaron a diferentes tubos de
ensayo
- Se agreg 1 [ml] de reactivo DNS en cada tubo de ensayo y se taparon
- Se pusieron los tubos de ensayo tapados en un bao en ebullicin durante 15
minutos
- Luego, los tubos fueron dispuestos en un vaso de precipitado con hielo, para detener
la reaccin
- Se agregaron 10 [ml] de agua destilada y se dejaron reposar por 15 minutos
- Se agitaron los tubos para homogenizar la mezcla
17
- Finalmente, se midi la absorbancia de la solucin en cada tubo, llenando una celda
de espectrofotmetro. La longitud de onda fue de 540 [nm].
- Los datos obtenidos se agregaron a un grfico de absorbancia versus concentracin
de lactosa
- El blanco fue agua destilada
Determinacin de la concentracin de azcares reductores
Para determinar la concentracin de lactosa en el caldo de fermentacin, se llev a cabo el
siguiente procedimiento.
- Se tomaron muestras de volumen igual o mayor a 4 [ml] y se dispusieron en tubos de
centrifugacin.
- Las alcuotas fueron centrifugadas a 10000 rpm por 15 minutos, para separar los
slidos suspendidos (clulas) de los disueltos (componentes del medio de cultivo y
productos extracelulares).
- Se extrajo el sobrenadante, y se someti a la prueba de DNS para determinacin de
azcares reductores como fue explicitado anteriormente.
- La absorbancia obtenida de las muestras se interpol en la curva de calibrado,
obtenida anteriormente con la solucin estndar de lactosa, y se obtuvo la
concentracin de lactosa en cada muestra.
4.2.3 Determinacin de la concentracin celular
Determinacin de biomasa por Turbidimetra
La concentracin celular en el medio de cultivo es determinada a travs de
espectrofotometra, correlacionando la absorcin de la luz con la concentracin celular del
medio a una determinada longitud de onda, esta longitud de onda se ajust a 620 [nm] para
el caso especfico de K. marxianus (Longhi et al, 1996). Para la medicin de la absorbancia
se utiliz un espectrofotmetro.
Protocolo para obtener curva de calibrado
Para la confeccin de esta curva se cont con una suspensin celular concentrada del
microorganismo a utilizar, proporcionada por los ayudantes.
- Se prepararon y enumeraron 3 capachos de aluminio y se pusieron a secar en la
estufa, a 105C, por aproximadamente 2 [h], hasta obtener un peso constante
- Se pes cada capacho.
18
- A partir del matraz original, con biomasa, se generaron 5 diluciones diferentes en
matraces de aforo de 50 [ml], por duplicado. La curva de calibrado se realiz a partir
de la dilucin 1/10 que otorg un valor de absorbancia cercano a 0,500 con el
objetivo de tener la mayor linealidad posible en la confeccin de la curva.
- Determinacin de la concentracin de clulas por peso seco.
- De la solucin madre se extrajeron 3 muestras de 20 [ml] cada una y se les aplic el
siguiente procedimiento 3 veces.
- Centrifugar las muestras a 10000[rpm] por 10 min.
- Retirar el sobrenadante del centrifugado
- Adicionar agua destilada y resuspender las clulas para lavarlas
- Realizado lo anterior, se resuspendi el pellet obtenido en un volumen mnimo de
agua y se verti en cada uno de los capachos secados previamente.
- Se pusieron los capachos a secar en estufa a 105C hasta peso constante.
- Se determin el peso de las clulas por diferencia con el peso del capacho vaco
- Se determin la concentracin celular de cada muestra con la masa de clulas y el
volumen sometido a centrifugacin. Se promediaron las concentraciones de las
muestras triplicadas y de esta forma se obtuvo la concentracin del inculo utilizado
Medicin de Absorbancia
- De cada dilucin, se extrajo una alcuota para determinar su absorbancia a 620 [nm]
- Se relacionaron los valores de concentracin y absorbancia en un grfico
- Se realiz una regresin lineal con los datos y se extrajo pendiente e intercepto de la
curva de calibrado
Protocolo para obtener la concentracin celular.
- Cada 30 [min] se tom una muestra del fermentador piloto
- Se ajust el espectrofotmetro a 0 con un blanco de agua destilada
- Se midi la absorbancia de la muestra a 620 [nm] Si el valor se encontraba fuera del
rango de aplicacin de la curva de calibrado, se dilua y volva a medir. Este paso fue
repetido tantas veces como fue necesario.
- Se interpol el valor de absorbancia obtenido en la curva patrn y se extrajo la
concentracin celular, aplicando el factor de dilucin correspondiente.
4.2.4 Diseo del medio de cultivo
El medio de cultivo se determin a partir de la composicin aproximada de la levadura,
extrada en parte de Acevedo (2002) y lo restante de Aiba (1973). En los Apndices A.1 y
A.2 se muestran los datos y el procedimiento realizados para determinarlo. En la
19
Tabla 4.3 4.3 se indica la composicin del medio de cultivo utilizado para la propagacin (en
el reactor Biolaffitte) y para la fermentacin (en el reactor de escala piloto).
Debe considerarse que en el caso del reactor Biolaffitte el volumen utilizado fue de 12 [l] y en
el reactor a nivel piloto fue de 120 [l].
Para el control de pH se consider el uso de tapn citrato, en el reactor Biolaffitte, y la
adicin de una solucin concentrada de NaOH, 4 [N], para el reactor piloto. La adicin de
base fue manual, en la medida que fuera necesario.
4.2.5 Preparacin de los medios de cultivo
Para el reactor Biolaffitte, en el cual se realiz la propagacin del microorganismo, los
sustratos fueron pesados en balanza granataria y mezclados con 12 [l] de agua potable
dentro de un balde plstico. Se mezcl la solucin hasta obtener una solucin homognea, la
que luego fue traspasada al bidn plstico, para posteriormente ser introducida en el auto
clave para su esterilizacin.
Para el reactor piloto, el medio de cultivo se prepar en un mezclador con capacidad 100 [l].
Los reactivos utilizados fueron pesados en una balanza balance digital y las cantidades
menores se midieron en balanza granataria. Dado que la capacidad del mezclador era menor
a la requerida para preparar el medio de cultivo, se adicion el agua faltante directo en el
reactor.
Las composiciones de los medios de cultivo se indican en la
20
Tabla 4.3
21
Tabla 4.3. Composicin de los medios de cultivo utilizados en el desarrollo de la experiencia y
la masa de reactivo que se agreg en cada caso.
Compuesto
Concentracin
deseada [g/l]
Masa agregada
medio cultivo
fermentador
Biolaffitte [g]
Volumen de
reactivo agregada
fermentador
Biolaffitte[ml]
Masa agregada
medio cultivo
fermentador
piloto [g]
Lactosa 22,46 224,6 2743,2
Sulfato de amonio 3,49 34,9 426
Sulfato de
magnesio
0,3 3 36
Fosfato de potasio 0,86 8,6 104,4
Sulfato de Hierro 0,83 8,3 102
Cloruro de Calcio 0,05 0,5 7,2
cido Clorhdrico 0,7 7
Hidrxido de Sodio 100
cido Ctrico 10,5
Citrato Disdico 11,8
Antiespumante 1 10
Extracto de
levadura
10 100 1200
4.2.6 Control de pH
Tampn citrato para fermentador Biolaffitte
El tampn citrato que se prepar en la experiencia de laboratorio, se obtuvo de mezclar 7
[ml] de una solucin de cido clorhdrico al 37% v/v con citrato disdico al 0,12 M. El citrato
disdico (base) fue preparado con 4 [g] de NaOH disueltos en 100 [ml] de agua destilada y
10,5 [g] de acido ctrico.
NaOH para reactor piloto
Se preparon 2[l] de una solucin 4 [N] de NaOH para regular el pH en el reactor piloto. Se
adicion 160 [g] de NaOH a un matraz Erlenmeyer y sobre ello se vertieron 2 [l] de agua
destilada, medida en matraz de aforo.
4.2.7 Adicin de Antiespumante
Las fermentaciones son propensas a la formacin de espuma como consecuencia de la
presencia de metabolitos con propiedades tensoactivas, principalmente las protenas
22
(Atkinson et al, 1986). Tales espumas pueden conducir a una considerable disminucin del
volumen de lquido en el recipiente durante el periodo de fermentacin, al humedecimiento
del filtro de salida de aire con los peligros consecuentes de infeccin microbiana y a un
posible decrecimiento de las velocidades de transferencia de oxgeno.
Para evitar la fuga de medio de cultivo desde el reactor por efecto de la espumacin, se
decidi agregar 1 [ml] por cada 10 [l] de medio de cultivo. El antiespumante utilizado fue un
antiespumante siliconado, en base a la recomendacin del fabricante Widetec (2008).
Para adicionar el antiespumante se procedi a disolverlo en un pequeo volumen de agua
destilada, dentro de un matraz Erlenmeyer. Esto se hizo as para facilitar el vaciado del
antiespumante desde el matraz, ya que presentaba una alta viscosidad. Luego, se esteriliz
en autoclave a 1 [atm
g
] por 15 [min] y se adicion al fermentador bajo mechero, por la misma
entrada por la cual se agreg el medio de cultivo (en el caso del reactor Biolaffitte) o por la
entrada de inculo (en el caso del fermentador piloto).
4.2.8 Control de la Aireacin
Para el fermentador Biolaffitte se fij un flujo de 14 [l aire/min] con un rotmetro, y se dej
toda la noche, sin control visual.
Para el fermentador piloto se us aireacin variable, en buena medida pues a poco andar la
fermentacin se comenz a perder mucho medio de cultivo por efecto de la turbulencia
dentro del reactor. Es por esto que en principio se oper a 1,2 [vvm], lo que luego se
disminuy a 0,6 [vvm], hasta que se resolvi el problema de la espuma (se agreg el
antiespumante) cuando se aument hasta 0,8 [vvm].
4.2.9 Calibracin de los electrodos
Electrodo de pH
La calibracin del electrodo de pH se realiz 4 horas antes de la esterilizacin, para de este
modo tener instalado el electrodo de pH dentro del fermentador antes de comenzar con la
esterilizacin. Para la calibracin se procedi a preparar una solucin a pH 7 y otra de pH 4
con tabletas buffer en matraces de 200 [ml]. Una vez preparados ambos buffer se procedi a
23
introducir el electrodo en cada solucin buffer y manualmente se ajustaron ambos pH en el
medidor de pH.
Electrodo de oxgeno
Para calibrar el electrodo de oxgeno, se debi encender el equipo 6 [h] antes de esterilizar.
Sin embargo, esta medicin no se realiz, debido al mal funcionamiento del equipo.
4.2.10 Esterilizacin
La esterilizacin de un medio o un ambiente es una operacin destinada a eliminar todas las
formas vivas, ya sea destruyndolas o removindolas (Vitalis Moritz, 2002). La esterilizacin
busca evitar los efectos adversos de la presencia de microorganismos extraos al proceso
biotecnolgico (contaminantes), que podran: consumir nutrientes, rebajando el rendimiento,
producir sustancias inhibitorias al proceso o perjudiciales a la separacin del producto o bien
formar compuestos que descomponen el producto, dentro de otras consecuencias negativas.
Protocolo para esterilizacin en el autoclave
- Abrir el autoclave cuidadosamente con el gancho.
- Verificar que el nivel de agua desionizada del autoclave se encuentre sobre la marca
roja del medidor. De no ser as, rellenar el autoclave con agua desionizada.
- Disponer el material a esterilizar dentro del autoclave. Se esterilizaron mangueras, el
filtro de aire de algodn, el medio de cultivo y solucin antiespumante
- Cerrar el autoclave, apretando las mariposas de la tapa de forma cruzada.
- Dejar la vlvula de ventilacin abierta totalmente.
- Encender el autoclave.
- Cuando comienza a salir vapor se debe dejar la vlvula cerrada de forma de no
interrumpir la salida de vapor.
- Contar 25 minutos desde cuando el manmetro indica 1 [bar] de presin dentro del
equipo (Roselfeld et al, 2003)
- Apagar el autoclave
- Esperar que disminuya tanto la presin como la temperatura.
- Soltar las mariposas de forma cruzada, y abrir la tapa del autoclave con el gancho y
guantes.
24
Esterilizacin de medio de cultivo para fermentador Biolaffitte
El medio de cultivo fue esterilizado dentro del autoclave en un bidn al cual se le dise una
tapa de gasa con algodn y se le introdujo una manguera. Por esta misma manguera se hizo
el traspaso del medio de cultivo al fermentador Biolaffitte, una vez que el medio y el
fermentador estuvieran esterilizados. El procedimiento de esterilizacin fue el de
esterilizacin en autoclave
Esterilizacin de medio de cultivo para fermentador reactor piloto
- El medio de cultivo fue esterilizado dentro del reactor, para lo cual se utiliz el calor
suministrado por el vapor que circul por el serpentn.
- Luego de cerrar todas las vlvulas, se conect la lnea de vapor al serpentn
- Se cuid de que la presin no sobrepasara los 0,5 [bar]. En tal caso, se abrieron las
vlvulas necesarias para lograr la disminucin de la presin.
- Una vez que la temperatura lleg a 100C, se contaron 20 [min] para la esterilizacin.
- Luego de los 20 [min], se cerr el paso de vapor
- Para enfriar, se conect la lnea de agua al serpentn
- Con el agua se enfri el reactor y medio de cultivo hasta la temperatura de operacin,
38C.
Esterilizacin de lnea de aire
El aire que se inyecta al reactor a fin de obtener el suministro de oxgeno debe ser
esterilizado para evitar la contaminacin por otros microorganismos. Para ello se debe pasar
el aire a travs de un filtro de a lo ms 0, 45 micrones (Estola et al, 2005).
A fines de airear el cultivo, se utilizar la lnea de aire disponible.
Para el reactor Biolaffitte, se utiliz un filtro de algodn para retener el paso de posibles
microorganismos. En el caso del reactor de fermentacin, se utilizo una corriente de aire que
fue esterilizada con el vapor que se produjo en la caldera.
Protocolo para esterilizacin del fermentador Biolaffitte
- Abrir todas las vlvulas
- Conectar la entrada de vapor a la parte inferior del reactor
- Permitir el paso de vapor por 30 [min]
25
Protocolo para esterilizacin del fermentador piloto
- Se conect el electrodo de pH al reactor, el que estaba previamente calibrado. El
electrodo de oxgeno tambin se conect, aunque no funcionaba.
- Se cerraron todas las vlvulas
- Se conect la lnea de vapor a la entrada de aire del sistema
- Se abrieron las vlvulas que permiten el paso del aire hacia el fermentador y se cerr
la vlvula que conecta la lnea de aire con el rotmetro, para evitar daos al mismo
- La vlvula de descarga del fermentador (al fondo del equipo), se dej abierta, para
permitir evacuacin del agua. Luego se dej semi-abierta la vlvula para el retiro del
vapor y para permitir el flujo de este durante 15 [min].
- Se cerraron las vlvulas y la lnea de vapor
- Se llen con agua destilada los tubos donde se ubicaban la termocupla y el
termmetro
- Se conect la lnea de vapor a la salida del toma muestras
- Se cerr la vlvula que conecta el toma muestra con la vasija de fermentacin y se
abrieron las dos vlvulas pequeas
- Se conect la lnea de vapor al reactor. Cuando comenz a salir vapor por la salida
de aire, se cerr la vlvula y se permiti el paso de vapor por 20 [min]. Las vlvulas
superiores se mantuvieron cerradas, pero si la presin suba a ms de 0,5 [bar] se
abrieron, para disminuirla.
- Se desconectaron las lneas de vapor y se conect el agua al serpentn
- La esterilizacin del medio de cultivo se realiz dentro del mismo reactor. Cuando la
aguja del manmetro marcaba 1 [bar
g
] se contaron 20 [min] con el fin de asegurar la
correcta esterilizacin del medio.
- Para enfriar, se conect la lnea de agua al serpentn
4.2.11 Traslado del medio
- El medio para propagacin fue esterilizado fuera del reactor, por lo que debi ser
incorporado al mismo de forma asptica.
- Bajo mechero, los manipuladores con guantes y mascarillas, se introdujo una
manguera previamente esterilizada en el contenedor del medio, se pas por una
bomba peristltica, y el extremo opuesto se introdujo al reactor por la entrada de
medio.
- Se encendi la bomba peristltica y se esper que se efectuara el traslado, cuidando
que la manguera siempre estuviera sumergida en el medio.
- Una vez finalizado el proceso, se extrajo la manguera, tambin cuidando la asepsia
del proceso y finalmente se cerr el reactor.
26
4.2.12 Manejo de la Caldera
- Se conecto la salida de agua desionizada a la manguera amarilla, para proveer a la
caldera con agua. Cuando el nivel del agua en el bidn que se encuentra junto a la
caldera sea inferior al lmite, debe permitirse el paso de agua desionizada para
recargarlo.
- Posteriormente se revis el nivel de agua de la caldera. Si es inferior a la marca roja,
debe rellenarse con agua desionizada.
- Asegurarse de que las 2 vlvulas que conectan el estanque con agua desionizada y
la caldera estn abiertas.
- Encender la bomba que lleva el agua desionizada hacia la caldera.
- Verificar constantemente que haya agua en el bidn para alimentar la caldera.
- Cuando la cantidad de agua en la caldera sea la apropiada, encender la caldera.
- Cuando el vapor acumulado en la lnea logre que el barmetro del intercambiador de
calor llegue a poco menos de 2 [bar], se puede iniciar la esterilizacin.
- La caldera se debe encender al menos 1 [h] antes de que sea necesaria su
utilizacin.
4.2.13 Lavado del Fermentador Piloto y del Biolaffitte
Para la limpieza del fermentador se procedi a levantar la tapa, habiendo soltado los seguros
previamente y con el equipo de proteccin adecuado.
Se lav el interior del estanque con agua y detergente utilizando un cepillo de cerdas largas,
teniendo el cuidado de remover toda la suciedad existente entre el serpentn y la pared del
fermentador. Tambin se procedi a retirar y lavar las vlvulas de toma de muestra, de
alimentacin y de adicin de soda, verificando que la goma que sella hermticamente la
unin al fermentador se encontrara en buenas condiciones y estuviera ubicada
correctamente dentro del canal del borde superior del fermentador piloto.
Para limpiar el difusor de aire, se hizo circular agua a travs de vlvulas.
El lavado sirvi adems para determinar la cantidad de lquido perdida durante la
fermentacin piloto, la que correspondi aproximadamente a 20[l].
27
5 Resultados
5.1 Concentracin de biomasa en el tiempo para fermentador piloto
De acuerdo a la curva de calibrado descrita en el apndice A.4 se logr seguir la cintica de
crecimiento de K. marxianus de acuerdo a los valores de concentracin de biomasa a travs
del tiempo total de fermentacin, mostrados en la Tabla A.5. Estos valores se representan
mediante la Figura 5.1 5.1
Figura 5.1 Curva de crecimiento de K. marxianus a 38C y pH 4.8
De acuerdo a esta figura, se determin que la fase de latencia en el medio de cultivo a las
condiciones mencionadas dur alrededor de 150 [min]. El inicio de la fase exponencial de
crecimiento de K. marxianus se aprecia con mayor claridad en la Tabla A..
5.2 Concentracin de lactosa en el tiempo para fermentador piloto
La curva de calibrado utilizada para medir la concentracin de lactosa se encuentra detallada
en el apndice A.6. De acuerdo a esta se pudo obtener las concentraciones de lactosa en las
muestras del fermentador piloto, las cuales se encuentran detalladas en la Tabla A.7
representados en la Figura 5.2 5.2.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 100 200 300 400
tiempo [min]
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

B
i
o
m
a
s
a

[
g
/
l
]
28
Figura 5.2 Consumo de lactosa en el tiempo por Kluyveromyces marxianus en un medio a 38C
y pH de 4,8
5.3 Rendimiento global de biomasa en sustrato
La Tabla 5.3 resume los principales valores de concentracin de biomasa obtenidos al inicio
y final de cada fermentacin.
Tabla 5.3 Concentraciones de biomasa obtenidas al inicio y final de cada fermentacin
Concentracin Biomasa
Inculo
(500 ml)
Inculo
(1,1l)
Fermentador
Biolaffite
Fermentador
Piloto
Concentracin Inicial Estimada [g/l] - - 0,15 1
Concentracin Inicial Obtenida [g/l] 2,6 - 0,26 1,6(*)
Concentracin Final Estimada[g/l] - - 10 11
Concentracin Final Obtenida [g/l] - 1,4 10 17,3
(*) Este valor difiere del estimado debido a un error durante la medicin
De acuerdo a estos datos, y considerando una prdida de volumen de 20[l], de acuerdo a la
Ecuacin 14 se obtuvo un rendimiento de 0,76[g biomasa/g lactosa]. De esto se desprende
que se obtuvo una produccin de biomasa de 1570[g] por cada 2027[g] de lactosa durante
los 390 [min] de cultivo en el fermentador piloto. Se alcanz una concentracin de 17,31[g/l]
a partir de tan solo 1,60 [g/l].
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 100 200 300 400
tiempo [min]
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

L
a
c
t
o
s
a

[
g
/
l
]
29
5.4 Productividad volumtrica de biomasa
La productividad volumtrica se calcul de acuerdo a la Ecuacin 11 11 del Apndice A.8,
obtenindose un valor de 3,88[g/l h] en biomasa.
5.5 Velocidad especfica de crecimiento
Los puntos utilizados para la determinacin de la velocidad especfica de crecimiento se
representan en la
Figura 5.3 5.3 mediante la siguiente grfica construida por los datos mostrados en la Tabla A
del apndice A.9

Figura 5.3 Curva del crecimiento logartmico de biomasa v/s tiempo, para la obtencin de la
Velocidad Especfica de Crecimiento

De esta recta se puede obtener la velocidad de crecimiento especfica a travs de la
pendiente, que es de 0,0102[min
-1
] la cual equivale a 0,61[h
-1
].
5.6 Estimacin de rendimientos de oxgeno y biomasa por medio del
balance de la reaccin
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
0 100 200 300 400
tiempo [min]
L
n
(
X
)
30
Los rendimientos de oxgeno en biomasa y de biomasa en sustrato se estimaron de acuerdo
a la Ecuacin 122 del apndice A.10. Los valores calculados fueron 0,3 [g clula/ gO
2
] y de
0,63 [g clula/ g lactosa] respectivamente.


31
6 Discusiones
- Durante la realizacin de la fermentacin se perdi una considerable cantidad de
volumen. En total, aproximadamente 20 [l]. Para determinar el volumen perdido, se marc
con un plumn el nivel de lquido que se obtuvo al final de la fermentacin y, una vez vaciada
la vasija de fermentacin, se procedi a llenarla otra vez, pero con agua, hasta el nivel
marcado. De esta forma se determin que el nivel final dentro del fermentador fue de 100 [l].
Luego, por diferencia, se defini que el volumen de medio de cultivo perdido por efecto de la
excesiva espumacin fue de 20 [l]. Debido a esto, el clculo del rendimiento de lactosa en
clulas se hizo con los valores iniciales y finales de volumen utilizados durante la
fermentacin clculados mediante la Ecuacin 10 10 detallada en el apndice A.8

- La prdida de volumen se debi a la produccin de espuma. Se trabaj con una
aireacin de entre 0,6 y 1,2 vvm. La mayora del tiempo se trabaj con una aireacin de 0,8
vvm. Se agreg 12 [ml] de antiespumante siliconado para los 120 [l] de medio de cultivo y 1
[ml] para el fermentador biolaffitte, donde se realiz la propagacin de la levadura, previo a la
fermentacin.

- La cantidad de antiespumante adicionado fue insuficiente para el alto volumen de medio
de cultivo utilizado, en la prctica se utiliz la recomendacin de 1 [ml] por cada 10[l]. Sin
embargo, otras fermentaciones similares llegan a usar hasta 3,3[ml] por cada 10[l] (Cori de
Mendoza et al, 2006) cantidad que parece mucho ms adecuada a la luz de los resultados
obtenidos en la fermentacin piloto, donde debido a la alta agitacin (300 [rpm]) y a la alta
aireacin (1,19 vvm), se lleg a perder aproximadamente 20[l] de medio de cultivo por el slo
efecto de espumacin.

- La gran cantidad de espuma generada pudo haberse debido a la alta concentracin de
extracto de levadura agregado al medio de cultivo, puesto que este componente contiene
una gran fraccin de protenas. Las protenas, por su diversidad de grupos funcionales,
presentan caractersticas tensoactivas, situndose en las interfases y dando lugar a
espumas.

- La buena cintica de crecimiento del microorganismo hace pensar que la aireacin
calculada de forma terica fue sobreestimada. Esto se apoya sobre el hecho de que el flujo
32
de aire suministrado al reactor piloto fue disminuido en un 33% desde el terico calculado
(desde 1,2 vvm a 0,8 vvm) lo que no se vio reflejado en una limitacin en el crecimiento de la
levadura. La disminucin en el flujo de aire fue motivada por la gran prdida de medio de
cultivo que estaba provocando la espuma.

- El haber trabajado con 120[l] de cultivo en el fermentador piloto dificult la operacin del
mismo debido a la alta aireacin a utilizar, lo que llev a una prdida de cultivo importante.
Esto puede ser muy perjudicial para una fermentacin real por lo que se debe trabajar con un
menor volumen til dentro del fermentador. En este caso se prefiri el dar una mayor
aireacin en desmedr de la prdida de medio de cultivo para favorecer el crecimiento, lo
que resulto en una buena decisin.

- El medio de cultivo fue diseado inicialmente para una velocidad especfica de
crecimiento mxima de 0,3[h
-1
]. Sin embargo esta velocidad durante la experiencia resulto
ser el doble (0,61 [h
-1
]) Para definir la biomasa a obtener, se fij la variable tiempo y la
concentracin inicial de la fase de propagacin y se calcul que, para esta fase, en 15[h] de
cultivo, se obtendra una concentracin celular en el reactor Biolaffitte, de 10,0 [g/l]. Este
valor coincidi con el valor obtenido al final de la fermentacin en este reactor. Sin embargo
se esperaba obtener 11,0 [g/l] de concentracin celular al final de la fermentacin piloto para
un tiempo de fermentacin de 480[min], y el resultado final fue de 17,3[g/l] para 390 [min] de
fermentacin.

- La levadura present una alta velocidad especfica de crecimiento. A pesar de ser un
evento poco frecuente, se puede encontrar referencias en que se han presentado resultados
similares (velocidad especfica de crecimiento de 0,62 [h
-1
]) utilizando condiciones de
operacin ms restringidas para el crecimiento. La experiencia a la cual se alude es aquella
realizada por Chinappi y Snchez (2000). Se cultiv K. marxianus en suero de leche para un
volumen de reaccin de 100[l], a pH 4,5, 30C, 200 rpm y entre 0,25 a 0,5 vvm. (Chinappi y
Snchez, 2000). La mayor disponibilidad de oxgeno y mejor temperatura para el
crecimiento, apoya la idea de que el resultado obtenido durante la experiencia piloto se
ajusta a los mrgenes de la realidad. Esto se justifica en parte al diseo minimalista del
medio de cultivo, el cual fue pensado utilizando condiciones infavorables de crecimiento y
sobredimensionando las cantidades a agregar de cada compuesto en el medio.
33
- Respecto del extracto de levadura, existe evidencia que indica que para el caso de un
fermentador de 100 [l], la adicin de extracto de levadura al medio de cultivo aumenta la
produccin de biomasa cerca del 50% del valor obtenido en ausencia de este (Chinappi y
Snchez, 2000). Esto explicara en parte el rendimiento observado de 0,76 [g biomasa/g
lactosa], dado que el rendimiento esperado era de 0,5 [g biomasa/g lactosa] o mayor. Otras
referencias indican que el rendimiento de lactosa en levaduras puede ser encontrado entre
50 a 57% y que puede ser mejorado agregando al medio de cultivo suplemento con extracto
de levadura de 0,2 al 5% en peso del medio de cultivo (El-Hawary & Mehanna, 1991).

- En la determinacin de la curva de consumo de sustrato, se tuvieron varios fallos en la
medicin de la concentracin de lactosa en la muestra. Esto puede deberse a un error en el
protocolo de obtencin de la muestra libre de biomasa, ya que se observ en las muestras
ms concentradas (ms cercanas al final de la fermentacin) que una sola centrifugacin no
era suficiente para remover toda la biomasa en el sobrenadante de la muestra, requirindose
hacer la separacin de fases al menos dos veces.

- Respecto a la curva de calibrado de biomasa, se tiene que la pendiente de sta posee
variaciones significativas frente a otras curvas de calibrado para el mismo microorganismo.
Sin embargo las experiencias se realizaron a distintas longitudes de onda (650 [nm] versus
620[nm]) y se le realiz un duplicado a la curva de calibrado de biomasa, por lo que no hubo
un error en la metodologa significativo (datos en apndice A.4). Sin embargo al utilizar la
curva a 650[nm] se obtiene al final de la fermentacin piloto una concentracin celular
cercana a 11[g/l], que fue la que inicialmente se estim. Esto hace pensar que la longitud de
onda elegida y utilizada durante esta experiencia no fue la ptima para la deteccin de
biomasa. Tal vez habra sido conveniente realizar un paneo en un rango de longitudes de
onda para determinar la que mejor se ajustaba a la experiencia.

- Con los datos de biomasa y lactosa obtenidos en el laboratorio, se procedi a realizar un
balance de masa estequiomtrico de la fermentacin mostrado en detalle en el apndice
A.10, utilizando la frmula emprica de K. marxianus propuesta por Krzystek y Ledakowicz
(2000). El resultado obtenido de rendimiento de lactosa en clula es similar al calculado por
el balance de masa (0,76[g/g] versus 0,63[g/g] respectivamente).

34
- Respecto del estudio del rendimiento de oxgeno en clula, se puede decir que este
sirve para poder calcular la cantidad de litros de aire por minuto que hay que alimentar al
fermentador. Sin embargo el valor de oxgeno disuelto no fue obtenido por falta de un equipo
de medicin en buen estado. A pesar de lo anterior, este valor fue estimado a partir de los
datos obtenidos durante el laboratorio y calculado a travs del balance de la reaccin de
formacin de biomasa del apndice A.10. El resultado fue un rendimiento de oxgeno (Y
O2
)
de 0,3 [g.clula/ gO
2
], el cual es menor al valor pronosticado y propuesto en el preinforme
cuyo valor fue obtenido por la ecuacin de Mateles (el cual era de 0,81 [g clula/ gO
2
]). A
pesar de que este valor es menor y por tanto el flujo de aire debera ser mayor, no hubo una
limitacin por oxgeno. Hay que considerar que Mateles propone una ecuacin para
bacterias y levaduras muy generalizadas para distintos tipos de sustratos, por lo que es
solamente una aproximacin al valor real y no se ajusta de forma exacta a especies y
variedades particulares.

- La diferencia de concentracin observada entre el inculo y el inicio de la fermentacin,
se debi a un error experimental. La concentracin final del reactor biolaffitte, se midi a 650
[nm] y no a 620 [nm]. Longitud de onda a la cual se construy la curva de calibrado. Como el
inculo tena un volumen del 10% del volumen de fermentacin, y ste present una
concentracin de 1,6 [g/l] al inicio, se puede estimar la concentracin final del inculo en 16
[g/l]. Otra razn puede ser el que la muestra obtenida al final de la fermentacin dentro del
fermentador biolaffitte no estuviera lo suficientemente homognea, debido a la detencin de
la agitacin antes del muestreo, explicando as el aumento de concentracin inicial en el
fermentador piloto. El valor de 1,6[g/l] adems concuerda con las siguientes tres muestras
obtenidas durante la fase de latencia de la cintica de crecimiento mostrada en la tabla A.5
del apndice A.5.

- Respecto a la curva de calibrado de biomasa, se tiene que la pendiente de esta posee
variaciones significativas frente a otras curvas de calibrado para el mismo microorganismo
(datos no mostrados). Sin embargo las experiencias se realizaron a distintas longitudes de
onda (650 [nm] versus 620[nm]) y se le realiz un duplicado a la curva de calibrado de
biomasa, por lo que no hubo un error en la metodologa significativo (datos en apndice A.5).
Al comparar los valores obtenidos al utilizar la curva a 650[nm] se obtiene al final de la
fermentacin piloto una concentracin celular cercana a 11[g/l], la cual es mucho ms
35
cercana a la que inicialmente se estimo. Esto hace pensar que la longitud de onda elegida y
utilizada durante esta experiencia no fue la ptima para la deteccin de biomasa.
36
7 Conclusiones
El ensayo con las condiciones de 38C a un pH de 4,8 result ser adecuado para el cultivo y
produccin de biomasa de Kluyveromyces marxianus, confirmndose esto por los excelentes
parmetros cinticos observados (velocidad de crecimiento especifico de 0,61[h
-1
] y un
rendimiento de sustrato en clula de 0,76[g biomasa/g lactosa]).
Se requiere de un nuevo estudio de la cintica de crecimiento de K. marxianus a la longitud
de onda de 650[nm] con el fin de corroborar los datos obtenidos en el presente laboratorio.

37
8 Referencias
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Zabriskie, D. 1980. Traders Guide To Fermentation Media Formulation. In: The Vitamin Content of
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39
A Apndices
A.1 Diseo del medio de cultivo
La Tabla A 1 1 muestra los datos requeridos para la determinacin de los rendimientos
tericos de sustrato en clula, que luego fueron utilizados para el diseo del medio de
cultivo.
Tabla A 1 Informacin utilizada para estimar los rendimientos tericos de los diversos
nutrientes en clula
Elemento
Compuesto
fuente
% del
elemento en
clula [g/g]
% del elemento
en el
compuesto
fuente [g/g]
PM
Fuente
[g/gmol]
Rendimiento de
compuesto en
clula terico
[g/g]
Carbono Lactosa 48 42,1 342 0,53
Nitrgeno
Sulfato de
amonio
7,5 21,2 132 2,8
Magnesio
Sulfato de
Magnesio
0,3 9,8 246 32,7
Potasio
Fosfato de
Potasio
dicido
2,5 28,7 136 11,5
Hierro
Sulfato de
Hierro
1,7 20,1 277,9 11,8
Calcio
Cloruro de
Calcio
0,2 36,1 111 180,6
Vitamina
s
Extracto de
Levadura
- - - 0,985
Para calcular el porcentaje de elemento en el compuesto fuente, presentado en la columna 4
de la Tabla A 1 se realiza el siguiente clculo.

Ecuacin 9
Donde:
C
NA
: Nmero de tomos del elemento en el compuesto
C
PM
: PM del compuesto fuente del elemento, [g/mol]
PM
: Peso molecular del elemento de inters, [g/mol]
Los clculos se desarrollaran de la siguiente manera:
40

El rendimiento terico para cada nutriente en clula fue determinado utilizando la expresin
indicada en la f
E
E
Y
X
C
S X
=
%
%
/
Ecuacin 7 de revisin bibliogrfica
y los resultados se presentan en la columna 6 de la Tabla A 1.
El rendimiento de la fuente de carbono se calcula como sigue:

]
Se utiliz el factor de 0,6 extrado de Acevedo (2002) debido al carcter aerobio de la
fermentacin.
Para el caso de los dems rendimientos se omite el factor f, quedando en el caso del sulfato
de amonio:

]
41
A.2 Adicin de extracto de levadura
A partir de informacin recopilada (El-Hawary y Mehanna, 1991; Kallel-Mhiri et al., 1994) el
utilizar una cantidad de extracto de levadura entre 0,1% a 5% permite un incremento del
rendimiento de lactosa en biomasa, el cual es del orden del 50% a 57% (Moresi et al., 1980).
Para no utilizar sugerencias empricas, se procedi a determinar el requerimiento de extracto
de levadura a partir de las necesidades de vitaminas que presenta K. marxianus y el
contenido de esas mismas vitaminas en el extracto de levadura.
Simplemente, se procedi a comparar el requerimiento y la disponibilidad y a calcular una
concentracin de extracto que las supliera. En la Tabla A 2 se indica la comparacin en base
a las vitaminas requeridas para el crecimiento de la levadura (Zabriskie. D., 1980).
Tabla A 2 Determinacin del requerimiento de extracto de levadura para satisfacer la demanda
de algunas vitaminas
Vitaminas
(g/g):
Contenido de
nutrientes en el
extracto
[ug/g](a)
Requerimiento
mnimo de
nutrientes
[ug/g](b)
Requerimiento
mximo de
nutrientes
[ug/g]
Requerimiento
mnimo de
extracto por g
de levadura [g
ext/g lev]
Requerimiento
mximo de
extracto por g
de levadura [g
ext/g lev]
Tiamina 9 29 90 3,2 10,0
Niacina 200 190 585 1,0 2,9
Ac.
Pantotnico
180 118 198 0,7 1,1
Ac. Flico 15 19 35 1,3 2,3
Biotina 0,5 0,5 1,8 1,0 3,6
Inositol 4000 4320 1,1 -
(a) Cook, A. 1958. The Chemistry and Biology of Yeasts. In: Aspects of the Chemical Composition of
Yeast. First Edition p.163. New York. Academic Press Inc.
(b) Zabriskie, D. 1980. Traders Guide To Fermentation Media Formulation. In: The Vitamin Content of
Some Industrial Culture Medium Constituents p.23. Texas, USA. Traders Protein Division.
En la tercera y cuarta columnas se indican valores mnimos y mximos de concentracin de
cada vitamina recomendados para obtener un buen crecimiento celular (Cook. A., 1958). En
base a stos, las columnas 5 y 6 presentan la cantidad de extracto de levadura por g de
levadura producida mnima y mxima que se requerira agregar para satisfacer el rango.
Para mayor claridad, se expone el siguiente ejemplo de clculo para el cido Pantotnico.
42
Contenido de cido pantotnico en 1[g] de extracto de levadura: 180[g]
Requerimiento mnimo recomendado para obtener un buen crecimiento de la levadura: 118
[g/g]
Requerimiento mximo recomendado para obtener un buen crecimiento de la levadura: 198
[g/g]
Crecimiento esperado de la levadura: 11 [g/l]
Entonces, el requerimiento de cido pantotnico que presentar el cultivo es:
| | | |
| |
| | l mg
l g
l mg l g
P / 298 . 1
/ 1
/ 118 , 0 / 11
=

=

Conociendo el contenido del cido pantotnico en el extracto de levadura, para poder suplir
esto se requiere,
| | | |
| |
| | l g
l mg
l mg l g
E / 21 , 7
/ 180 , 0
/ 298 . 1 / 1
=

=

Donde E es la concentracin de extracto de levadura requerida.
Para determinar el requerimiento de extracto de levadura por g de levadura producida, se
realiz el cuociente entre la concentracin de extracto requerida y la concentracin de
levadura que se estimaba obtener. As, se estima el rendimiento de extracto de levadura en
biomasa.
| |
| |
(

= =
levadura g
extracto g
l g
l g
R 7 , 0
/ 11
/ 21 , 7

Realizando este clculo para todos los nutrientes explicitados en la tabla, se obtienen los
valores de las columnas 5 y 6. Para determinar la concentracin de extracto de levadura a
agregar al medio de cultivo, se tom en consideracin los valores de la columna 5. Se
promediaron los requerimientos mnimos (a excepcin del referido a la tiamina) y se obtuvo
un valor cercano a 1 [g de extracto/g levadura], razn por la cual se utiliz este valor para
estimar la concentracin de extracto.
43
Para mayor claridad, se explicita la operacin realizada:
| | | | | | | | | |
(

=
+ + + +
=
levadura g
extracto g g g g g g g g g g g
99 , 0
5
/ 1 , 1 / 1 / 3 . 1 / 7 . 0 / 1
Promedio


44
A.3 Preparacin del tampn citrato
Debido a la acidificacin del medio dada por la liberacin de protones en el consumo de la
fuente de nitrgeno, es necesaria la regulacin del pH del sistema a travs de toda la
fermentacin. La reaccin se explicita a continuacin:

Para la fase de propagacin, se requiri mantener el pH del medio en torno a 4,8 + 0,4, para
lo cual se utiliz tampn citrato, que se compone de:
Solucin A: cido clorhdrico (HCl) 0,1 [N].
Solucin B: Citrato disdico 0,1 [M] (correspondientes a 21 gramos de acido ctrico
monohidratado disuelto en 200 [ml] de NaOH 1 N aforado a 1 [l])
De la tabla buffer solutions (Diem E., 1962) se obtiene que el volumen a agregar de solucin
A y B sern respectivamente de 11.8 [ml] y de 88.2 [ml].
Para considerar la fuerza inica se proceder de la siguiente manera:

Despejando en funcin de solucin A, tenemos:

Considerando que la base neutralizar la cantidad de protones liberados, se tiene que:
[Solucin B]= 0.05 M
Luego, por simple regla de 3 se obtiene que:



[

]
45
Siendo en [mol/l]
Ahora para el clculo de la preparacin del citrato disdico se procedi a calcular la
concentracin necesaria en [g/l] multiplicando por el peso molecular de acuerdo a:

] *

+ *

+
La Tabla A.3 muestra las cantidades a agregar de los reactivos para la preparacin del
citrato disodico.
Tabla A.3 Preparacin de la solucin B
Concentracin Estndar (aforado a 1 [l]) Concentracin a utilizar (aforado a 1 [l])
0.1 M 0.05 M
21 [g] acido ctrico 10.5[g] acido ctrico
200 [ml] 1 [N] de NaOH 100 [ml] 1 [N] de NaOH
Para el caso del NaOH se preparo la solucin de 1[N] de la siguiente manera:

Para obtener la masa en gramos que necesitamos de NaOH, se procedi a multiplicar los
moles ya obtenidos por el peso molecular del NaOH que es 40 [g/gmol], por lo cual tenemos:

Para el caso del cido clorhdrico se tiene:

] *

+ *

+
Ahora bien, el cido clorhdrico que se utiliz posea una concentracin de 37% p/p

+
[

]
*

+
46
Como el medio de propagacin fueron 12 litros, se tiene:
*

+
La densidad de la solucin del cido clorhdrico al 37%p/p es de 1190*

+, con lo cual se
obtiene el volumen de cido clorhdrico a utilizar:

+

47
A.4 Construccin de la curva de calibrado de biomasa
Para la cuantificacin de la biomasa en el reactor, primero se procedi a realizar la
construccin de la curva de calibrado para la biomasa, cuya absorbancia fue medida a 620
[nm]. Esta curva de calibrado se puede observar en la
Figura A. 11, la cual se obtuvo a travs de los datos de la Tabla A 4.

Figura A. 1 Curva patrn de calibrado de biomasa
La Tabla A4 detalla los valores obtenidos para la construccin de la curva de calibrado para
biomasa, indicndose el factor de dilucin utilizado y la correspondiente absorbancia medida.
Tabla A.4 Datos para la curva de calibrado de la biomasa
FD
Concentracin
[g/l]
Absorbancia
Absorbancia
Duplicado
Absorbancia
Promedio
10 0,260 0,539 0,531 0,535
15 0,173 0,383 0,370 0,377
20 0,130 0,283 0,271 0,277
30 0,087 0,162 0,179 0,171
40 0,065 0,146 0,135 0,141
- 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300
Concentracin Biomasa [g/l]
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
48
Cabe sealar que para la construccin de la curva de calibrado se utiliz el valor promedio
de las absorbancias. La concentracin de la muestra inicial, determinada por peso seco, fue
de 2,6[g/l], lo que se muestra en la Tabla A.
De este anlisis tras la regresin lineal se obtuvo la siguiente recta, poseyendo un valor de
correlacin r = 0,9976:

En donde:
A
: Absorbancia
c : Concentracin de clulas, [g/l]
49
A.5 Aumento de biomasa durante la fermentacin piloto
En la Tabla A.5 se detallan los resultados del muestreo realizado cada 30 [min] en el
fermentador piloto para la determinacin de la concentracin celular [g/l].
Tabla A.5 Datos para la obtencin de la curva de crecimiento de la biomasa a 38C, pH 4.8
limitado por lactosa como fuente de carbono

Tiempo [min] Absorbancia FD Concentracin [g/l]
0 0,334 10 1,59
30 0,334 10 1,59
60 0,336 10 1,6
90 0,396 10 1,88
120 0,424 10 2,02
150 0,283 20 2,68
180 0,395 20 3,76
210 0,493 20 4,71
240 0,534 25 6,38
270 0,345 60 9,83
300 0,264 100 12,48
330 0,303 100 14,36
360 0,329 100 15,62
390 0,364 100 17,31
50
A.6 Datos utilizados para la construccin de la curva de calibrado de
consumo de sustrato
En la Tabla A..6 se detallan los valores obtenidos en la construccin de la curva de calibrado
para la determinacin de lactosa, indicndose el factor de dilucin utilizado y la
correspondiente absorbancia medida.
Tabla A.6 Datos para la curva de Calibrado DNS
FD Concentracin Absorbancia
1,000 1,500 0,615
2,000 0,750 0,282
3,000 0,500 0,195
4,000 0,375 0,158
5,000 0,300 0,108
6,000 0,250 0,099
7,000 0,214 0,070
8,000 0,188 0,065
- 0,000 0,000

Respecto a la concentracin de sustrato, se procedi a la realizacin de una curva de
calibrado como patrn para la obtencin de la concentracin de lactosa en las muestras. La
Figura A. 2 2 muestra la curva patrn obtenida.
51

Figura A. 2 Curva patrn de Calibrado de DNS
Luego de este anlisis tras la regresin lineal se obtuvo la siguiente recta, poseyendo un
valor de correlacin r = 0,9972:

Donde
A
: Absorbancia
c
: Concentracin de lactosa, [g/l]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Concentracin lactosa [g/l]
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
52
A.7 Medicin de sustrato realizada durante la fermentacin piloto
Se muestran en la Tabla A la totalidad de los resultados obtenidos por medio del mtodo del
DNS para la medicin de azcares reductores, en este caso lactosa.
Tabla A.7 Datos para la obtencin de la curva de consumo de azcar obtenida por el mtodo
DNS
Tiempo [min] Absorbancia FD
Concentracin
[g/l]
0 0,312 22 17,19
30 0,272 22 15,05
60 0,284 22 15,69
90 0,145 20 7,51
120 0,139 20 7,22
150 0,102 20 5,42
180 0,23 10 5,82
210 0,433 5 5,38
240 0,37 5 4,61
270 0,454 3 3,38
300 0,254 3 1,92
330 0,063 3 0,53
360 0,055 2 0,31
390 0,139 1 0,36
53
A.8 Clculo de rendimiento de sustrato en biomasa y productividad
volumtrica
Para el clculo de rendimiento global de biomasa en sustrato, y en el caso especfico en que
el sistema posea un cambio de volumen significativo, se utiliza la Ecuacin 10 10
Ecuacin 10
En donde, Y
X/S
es el rendimiento, es la concentracin de clulas, es la concentracin de
sustrato y los subndices y se refieren a las condiciones iniciales y finales
respectivamente.
De esta forma se procedi a calcular el rendimiento de biomasa en lactosa, considerando la
prdida de volumen de 20 [l], obteniendo:

]
La productividad volumtrica se clculo de acuerdo a la Ecuacin 11 para cultivo por lotes

)

Ecuacin 11

Como esta frmula no considera que el volumen vara a lo largo de la fermentacin, se
calcularon las masas finales e iniciales de biomasa producidas y se tomo como volumen
promedio 110[l], as se obtiene:

+

54
Con estos valores promedio y reemplazando en la Ecuacin 11 se obtiene:

)
*

+

55
A.9 Datos utilizados para el clculo de la velocidad especfica de
crecimiento
La Tabla A.9 muestra los datos utilizados para el clculo de la velocidad especfica de
crecimiento de K. marxianus correspondientes a la zona de crecimiento exponencial. La zona
de crecimiento exponencial se defini como aquella en la cual la relacin entre el logaritmo
natural de la concentracin de clulas (Ln(X)) y el tiempo diera la mejor lnea recta. Es decir,
con un factor de correlacin r
2
mayor.
Tabla A.9 Datos utilizados para la determinacin de la velocidad especifica de crecimiento
Tiempo [min] Concentracin [g/l] Ln (X)
120 2,02 0,703
150 2,68 0,986
180 3,76 1,324
210 4,71 1,549
240 6,38 1,853
270 9,83 2,286
300 12,48 2,524
A partir de estos datos, aplicando una regresin lineal se obtuvo la siguiente recta,
poseyendo un valor de correlacin r = 0,9954. La recta result ser:
(
En donde:
X: Concentracin de biomasa [g/l]
t: Tiempo [min]

56
A.10 Balances de la reaccin de formacin de biomasa para obtener el
rendimiento de oxgeno
De acuerdo a la Ecuacin 12, extrada de Acevedo (2002), se puede modelar el mecanismo
de consumo de sustrato y oxgeno para K. marxianus:
) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (
2 2 16 , 0 54 , 0 63 , 1 2 3 11 22 12
O H F CO E N O CH D O C NH B O H C A + + + +

Ecuacin 12
Realizando el balance de materia para cada elemento, se obtienen las siguientes 4
ecuaciones:
D B N
F E D C A O
F D B A H
E D A C
16 , 0 :
2 54 , 0 2 11 :
2 63 , 1 3 22 :
12 :
=
+ + = +
+ = +
+ =

Calculando hasta el tiempo 330 [min], debido al agotamiento de la solucin de hidrxido de
sodio en el cultivo del fermentador piloto, tenemos que, dado a la reaccin:

Se tiene que se consumen 2 [l] de NaOH a 4[N] (o 4[M]), obtenindose:

Por lo cual la cantidad de OH liberados al medio de cultivo corresponde a 8 [gmol].
Considerando:

Como un mol de OH
-
neutraliza un mol de H
+
, se tiene que los moles producidos de H
+

corresponden a 8 moles. Por la estequiometra de la reaccin anterior, se observa que los
moles de NH
3
en el medio son 8 moles (B=8).
57
Para calcular la concentracin de clulas que se tiene a los 330 [min] de iniciado el cultivo,
se utilizan los datos presentados en la Tabla A. y se operan mediante la
Ecuacin 13 13.

(

Ecuacin 13
Donde:
: Concentracin de clulas al tiempo 300 minutos [g/l]
: Volumen al tiempo 330 minutos

: Concentracin de clulas al tiempo 0 (tiempo de inoculacin) [g/l]

: Volumen al tiempo 0 [l]

: Peso molecular de la clula [g/gmol]

El peso molecular de la clula (PM) se obtiene a partir de (Krzystek and Ledakowicz, 2000) y
es 24,53 [g/mol]
Reemplazando en ecuacin 2, tenemos:

(

Por lo tanto D es igual a 51 moles. Por otro lado, se puede obtener D despejando de la
relacin del balance de elementos para el N (NH
3
).
D B 16 , 0 =

Reemplazando, tenemos:
| | gmol D 50
16 , 0
8
= =

Con lo anterior, se confirma que la biomasa obtenida a travs de la medicin es
prcticamente la misma que se obtiene con la relacin de consumo de NaOH.
58
Para calcular la concentracin de lactosa que tenemos en los 330 [min] del tiempo de cultivo,
mediante la Ecuacin 14 y recurriendo a los datos entregados por las mediciones, estimando
la prdida de volumen debido a espumacin en 20[l] para tal tiempo:

(

Ecuacin 14
Donde:
: Concentracin de lactosa al tiempo 300 minutos [g/l]
Volumen al tiempo 330 minutos [l]

: Concentracin de lactosa al tiempo 0 (tiempo de inoculacin) [g/l]

: Volumen al tiempo 0 [l]

: Peso molecular de la lactosa (132 g/gmol)

Reemplazando en la ecuacin 14, tenemos:

(

Por lo tanto A=15 moles.
Ahora bien, reemplazando en los balances a los elementos que se desprenden de la
ecuacin 1, tenemos:


Reemplazando en la Ecuacin 12 12, tenemos:
) ( 5 . 135 ) ( 129 ) ( 51 ) ( 128 ) ( 8 ) ( 15
2 2 16 , 0 54 , 0 63 , 1 2 3 11 22 12
O H CO N O CH O NH O H C + + + +

Ahora se puede calcular el rendimiento de oxigeno segn:
59

Calculando el rendimiento de lactosa en clula, se obtiene:

Valor que es muy similar al obtenido con los clculos grficos, lo que valida los clculos
obtenidos experimentalmente.