Clonagem molecular

Tpicos
Significado e objectivos da clonagem molecular Etapas da clonagem molecular Sistemas de clonagem em E. coli de fragmentos de diferentes dimenses Sistemas de clonagem em E. coli de produo de DNA de cadeia simples Preparao de bibliotecas genmicas Preparao de bibliotecas de cDNA

Desenvolvimento da clonagem molecular

An Introduction to Genetic Engineering

Definio de clonagem molecular

A clonagem molecular o processo de construo de molculas de DNA recombinante e da sua propagao em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleco do DNA recombinante. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgnicos e realizar terapia gnica. Expresses utilizadas com o mesmo significado: clonagem molecular engenharia gentica manipulao gnica clonagem gnica tecnologia do DNA recombinante modificao gentica nova gentica

Representao esquemtica da clonagem molecular

Genetics a molecular approach

Objectivos gerais da clonagem molecular (1)

Recombinant DNA. Principles and Methodologies

Objectivos gerais da clonagem molecular (2)

A clonagem molecular permite isolar e amplificar uma sequncia particular de DNA a partir de uma mistura complexa de fragmentos, porque se formam molculas de DNA recombinante independentes que replicam numerosas vezes no hospedeiro.

Papel dos cidos nucleicos na clonagem molecular

Os cidos nucleicos so as molculas centrais da clonagem molecular: O DNA utilizado como vector de clonagem ou como inserto O cDNA, obtido a partir de mRNA, utilizado como inserto DNA e RNA obtidos por clonagem molecular so utilizados como sondas de hibridao na identificao, quantificao e caracterizao de outros cidos nucleicos

Principais etapas da clonagem molecular (1)

Construo de DNA recombinante

Transformao

Principais etapas da clonagem molecular (2)

Amplificao

Isolamento de clones de DNA recombinante

Especificao das etapas da clonagem molecular

Preparao do DNA vector Preparao do DNA dador Ligao de DNA vector e DNA dador Seleco do sistema vector/hospedeiro Introduo de DNA recombinante no hospedeiro Seleco de clones recombinantes Identificao de clones recombinantes

Preparao de DNA vector e DNA dador

Preparao de DNA vector
Digesto com enzima(s) de restrio de tipo II

Mtodos de produo de fragmentos de DNA dador

Digesto com enzimas de restrio de tipo II Digesto parcial com DNase I Quebra mecnica controlada Sntese enzimtica (cDNA, PCR) Sntese qumica de oligodesoxirribonucletidos

Mtodos de modificao das extremidades do DNA

Preenchimento parcial de extremidades 3 recuadas Preenchimento total de extremidades 3 recuadas Remoo de extremidades 3 projectadas Adio de linkers Adio de adaptadores Adio de caudas de homopolmeros Desfosforilao

Nomenclatura das enzimas de restrio

Nomenclatura das enzimas: As enzimas so denominadas por abreviaturas das estirpes bacterianas a partir das quais foram isoladas. A primeira letra maiscula corresponde inicial do nome genrico e as duas letras minsculas s inicias do restritivo especfico. A numerao romana indica a ordem cronolgica de isolamento da enzima na estirpe produtora. Exemplo: AluI foi a primeira enzima de restrio a ser isolada de Arthrobacter luteus. As sequncias de reconhecimento so escritas de 5 3 (pode estar representada apenas uma das cadeias) e os locais de clivagem so indicados por setas.
R. J. Roberts, 1988, Nucl. Acids Res. 16(suppl):271.

Digesto enzimtica

As enzimas de restrio catalisam a hidrlise das ligaes fosfodister do DNA, originando extremidades 5P e 3OH (excepto NciI que origina extremidades 3P e 5OH). A ligao que clivada est representada a rosa.

Especificidades das enzimas de restrio de tipo II

Tipos de extremidades: BamHI, EcoRI e XhoI clivam a 5 do eixo de simetria, originando extremidades coesivas, 5P projectadas. HaeIII cliva segundo o eixo de simetria, originando extremidades cegas (sem projeces). HhaI cliva a 3 do eixo de simetria, originando extremidades coesivas, 3OH projectadas.

As sequncias de reconhecimento so, em geral, constitudas por quatro a seis pares de nucletidos, e palindrmicas, isto , quando lidas na mesma orientao em ambas as cadeias, 53 ou 35, so idnticas. A clivagem ocorre dentro da sequncia de reconhecimento ou num local prximo. As setas indicam os locais de corte e os smbolos a verde assinalam o eixo de simetria.

EcoRI e metilase EcoRI

As bactrias que produzem endonucleases de restrio tambm contm as enzimas de modificao correspondentes que metilam bases no local de reconhecimento das endonucleases. A metilase EcoRI (M.EcoRI) catalisa a adio de um grupo metilo a duas adeninas da sequncia reconhecida por EcoRI. A sequncia metilada no clivada por EcoRI, assegurando que o DNA da clula que produz esta enzima de restrio no destrudo.

Isosquismeros
Reconhecem a mesma sequncia e clivam nos mesmos locais
AccIII TCCGGA AGGCCT e BspE1 TCCGGA AGGCCT

Estas enzimas geram extremidades compatveis com XmaI CCCGGG GGGCCC

Reconhecem a mesma sequncia e clivam em locais diferentes

Acc65I GGTACC CCATGG XmaI CCCGGG GGGCCC DpnII e MboI GATC CTAG Sau3A1 GATC CTAG e e e KpnI SmaI GGTACC CCATGG CCCGGG GGGCCC Gm6ATC CTAm6G

Reconhecem a mesma sequncia e tm sensibilidades diferentes metilao

DpnI Gm6ATC CTAm6G

Isosquismeros so enzimas que reconhecem a mesma sequncia de nucletidos.

Mtodos de modificao das extremidades do DNA (1)

1. Preenchimento parcial de extremidades 3 recuadas dATP 5_________ OH 3 dGTP 3_________TCGA p 5 Hind III Klenow 5 _________ AG OH 3 3 _________ TCGA p 5

dCTP 5_________ OH 3 dTTP 3_________GATC p 5 XbaI Klenow

5 _________ CT OH 3 3 _________ GATC p 5

A extremidade Hind III modificada compatvel com a extremidade XbaI modificada

Mtodos de modificao das extremidades do DNA (2)

2. Preenchimento total de extremidades 3 recuadas dATP 5_________G OH 3 dTTP 5 _________ GAATT OH3 3 _________ CTTAA p 5 3_________CTTAA p 5 Klenow dATP dCTP dGTP 5_________A OH 3 dTTP 5 _________ AAGCT OH 3 3 _________ TTCGA p 5 3_________TTCGA p 5 Klenow
As extremidades coesivas so convertidas em extremidades cegas

Mtodos de modificao das extremidades do DNA (3)

3. Remoo de extremidades 3 projectadas As enzimas utilizadas so: Polimerase de DNA do fago T4 Polimerase Klenow Nuclease S1 Nuclease mung bean
As extremidades coesivas so convertidas em extremidades cegas

4. Adio de linkers

AatII GGACGTCC CCTGCAGG Linker fosforilado 5-d (pGGACGTCC) -3 Linker no fosforilado 5-d (GGACGTCC) -3

As extremidades cegas so convertidas em extremidades coesivas

Mtodos de modificao das extremidades do DNA (4)

5. Adio de adaptadores
- Adaptador com extremidades coesivas:

XmnI 5 .......AATTCGAACCCCTTCG...................3 3 .....................GCTTGGGGAAGCCTAG.......5 EcoRI BamHI

Uma extremidade coesiva convertida numa extremidade coesiva diferente

- Adaptador com uma extremidade cega:

XmnI 5 .......AATTCGAACCCCTTCG.......3 3 .....................GCTTGGGGAAGCp..........5 EcoRI

Uma extremidade coesiva convertida em extremidade cega ou vice-versa

6. Adio de caudas de homopolmeros

As extremidades cegas so convertidas em extremidades coesivas pela transferase terminal

Mtodos de modificao das extremidades do DNA (5)

7. Desfosforilao Remoo dos grupos 5P das extremidades do DNA pela fosfatase alcalina para impedir a recircularizao do vector (aumenta a eficincia de clonagem) ou a ligao intermolecular do DNA dador, em particular, a ligao de fragmentos de DNA de regies genmicas diferentes.

Ligao de DNA vector e DNA dador

Construo de DNA recombinante Estratgias de ligao de DNA vector e DNA dador

Clonagem no dirigida (DNA vector EcoRI + DNA dador EcoRI) Clonagem dirigida (DNA vector EcoRI/PstI + DNA dador EcoRI/PstI) Construo de novos locais de clivagem

Construo de DNA recombinante

A ligase de DNA a enzima que liga extremidades 3 OH e 5 P adjacentes, produzindo uma molcula de DNA recombinante.

Ligao intermolecular do DNA dador e intramolecular do DNA vector

A tendncia para a circularizao de molculas individuais mais acentuada quando a concentrao de DNA baixa e as possibilidades de coliso entre diferentes molculas com extremidades coesivas complementares reduzida.

Seleco do sistema vector/hospedeiro

Vectores procariticos de clonagem em E. coli
Caractersticas dos vectores de clonagem Tipos de vectores e suas aplicaes Plasmdios Vectores derivados do fago lambda Cosmdios Vectores derivados do fago M13 Fagemdios Cromossomas artificiais derivados do fago P1 (PACs) Cromossomas artificiais bacterianos (BACs) Vectores shuttle

Estirpes de E. coli

Caractersticas dos vectores de clonagem

Os vectores de clonagem so molculas de DNA que permitem a propagao do inserto no hospedeiro. Caractersticas fundamentais - So molculas de DNA de cadeia dupla - Tm capacidade de replicao autnoma no hospedeiro - Possuem locais de restrio nicos para clonagem - Possuem pelo menos uma marca gentica de seleco Caractersticas adicionais vantajosas - Baixa massa molecular - Mais do que um sistema de seleco

Polylinker ou MCS
Este polylinker inclui uma cpia dos locais de reconhecimento, indicados por chavetas, de cada uma das 10 enzimas de restrio assinaladas. Est representada apenas uma cadeia. Os polylinkers so sintetizados quimicamente e inseridos nos vectores de clonagem. Em condies de reaco apropriadas, a insero de um nico fragmento de restrio maximizada. Na clonagem de fragmentos EcoRI num vector clivado com EcoRI, so reconstitudos dois locais EcoRI no DNA recombinante. MCS (multiple cloning site) local mltiplo de clonagem

Vector plasmdico pUC19

A origem de replicao (ori) deriva do plasmdio semelhante a ColE1, pMB1. A poro do gene lacZ includa no vector codifica o fragmento amino-terminal da -galactosidase. O MCS est inserido de modo a preservar a grelha de leitura e a sua correcta expresso.

Clonagem de DNA num vector plasmdico (1)

Clonagem de DNA num vector plasmdico (2)

Os clones recombinantes so colnias bacterianas.

Ciclo de vida do fago

Mapa simplificado do genoma do fago

O genoma do fago tem cerca de 50 kb. Na extremidade esquerda esto localizados os genes que codificam as protenas da cabea e cauda; os genes que codificam protenas envolvidas no ciclo ltico mapeiam na extremidade direita. A regio central do genoma pode ser removida ou substituda por DNA exgeno sem afectar a capacidade de replicao do fago, permitindo a insero de DNA exgeno at 25 kb.

Encapsidao in vivo de DNA do fago

Durante o estdio tardio da infeco fgica formam-se longas molculas de DNA, denominadas conctemeros; estas molculas multimricas consistem de cpias do genoma do fago ligadas pelas extremidades e separadas por locais cos (vermelho).
Figure 7-11. 2000 by W. H. Freeman and Company.

Encapsidao in vitro de DNA de recombinante

Sistema baseado em extractos celulares de duas estirpes de E. coli lisognicas de fagos mutantes.

Protena E protena principal da cpside

Protena D protena secundria da cpside

38-53 kb

Sistema baseado numa nica estirpe, E. coli C cI857 cos2 Sam7, lisognica do fago mutante cos2 (deleo de 22 pb de cosN que impede a formao de placas fgicas de DNA endgeno).

Vector de insero

Clonagem de DNA num vector de substituio

As enzimas Sau3A e BamHI geram extremidades coesivas compatveis. Os fagos recombinantes infectam E. coli, originando em meio slido placas fgicas (clones recombinantes).
Figure 7-12. 2000 by W. H. Freeman and Company

Cosmdio
O cosmdio um plasmdio que contm um local cos.

MboI e BamHI geram extremidades coesivas compatveis

A clonagem em cosmdios conjuga a elevada eficincia de infeco associada clonagem no fago com a facilidade de manipulao de DNA plasmdico, dado que o DNA recombinante replica como um plasmdio.

Clonagem de DNA num cosmdio

Da infeco de E. coli com os viries recombinantes resultariam quatro tipos diferentes de colnias, embora esteja representada apenas uma.

Figure 7-16. 2000 by W. H. Freeman and Company

Caractersticas do fago M13

- M13 um fago filamentoso
- Tem um genoma circular de DNA de cadeia simples (cadeia +) de 6,4 kb - Infecta E. coli F - O ciclo de vida permite a sua utilizao como vector de clonagem - As partculas virais so libertadas no meio de cultura sem lise de E. coli ( 200 partculas/clula/gerao) - Forma placas fgicas anlogas s do fago - 90% do genoma codifica protenas indispensveis realizao do ciclo de vida

Caractersticas dos vectores M13 (srie mp)

- utilizada a forma replicativa (RF) do DNA vector - O DNA recombinante introduzido por transformao em clulas de E. coli F - Existem dois tipos de vector com o polylinker nas duas orientaes - Adjacente ao polylinker est clonada a regio 5 do opero lac - A seleco de recombinantes baseada na -complementao - O DNA recombinante de cadeia simples extrado das partculas fgicas e utilizado como molde para sequenciao, na obteno de sondas de hibridao e em mutagnese stio-dirigida - A capacidade de clonagem oscila entre 300-400 nucletidos (sequncias clonadas maiores do que 1000 nucletidos so instveis, originando delees durante a propagao dos fagos)

Clonagem de DNA num vector M13

Transformao

RF Forma replicativa, de cadeia dupla

Clonagem de DNA num fagemdio

O fagemdio um vector hbrido que possui uma origem de replicao plasmdica e uma origem de replicao fgica (M13, f1).

Capacidade de clonagem dos vectores de E. coli

Tipo de vector Plasmdio Fago Cosmdio PAC (cromossoma artificial derivado do fago P1) BAC (cromossoma artificial bacteriano) DNA clonado (kb) 10 25 45 100 300

Vector shuttle

Gentipos de estirpes de E. coli

All genes in the bacterium are presumed to be in the wild-type state, except for those listed, which are mutant alleles carried by that bacterium. Genes listed on the F episome, however, represent wild-type alleles unless specified otherwise. Strains are unless specified otherwise. BL21(DE3) F-, ompT, hsdSB, (rB-, mB-), dcm, gal, (DE3) BL21(DE3)pLysS F-, ompT, hsdSB, (rB-, mB-), dcm, gal, (DE3), pLysS (Cmr) DH5 8OdlacZM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdRl7 (rK-, mK+), supE44, relA1, deoR, (lacZYA-argF)U169

Significado das marcas genticas de estirpes de E. coli (1)

Symbol dam Description Adenine methylase mutation Cytosine methylase mutation Endonuclease mutation Restriction minus, modification positive Effect Blocks methylation of adenine residues in the sequence 5GmATC3. Blocks methylation of cytosine in the sequence 5CmCAGG...3or 5...CmCTGG...3. Improves quality of plasmid DNA isolations. Allows cloning without cleavage of transformed DNA by endogenous restriction endonucleases. DNA prepared from this strain can be used to transform rK+ E. coli strains. Allows cloning without cleavage of transformed DNA by endogenous restriction endonucleases. DNA prepared from this strain is unmethylated by the hsdS2O melhylases.

dcm endA1 hsdR (rK- , mK+)

hsdS20 (rB-, mB-) Restriction minus, modification minus

lacIq

Overproduction of the lac repressor protein Leads to high levels of the lac repressor protein, inhibiting transcription from the lac promoter.

Significado das marcas genticas de estirpes de E. coli (2)

Symbol lon mcrA Description Deletion of lon protease Mutation in restriction system Mutation in restriction system Mutation of protease VII, an outer membrane protein P2 bacteriophage lysogen present in host Mutation in recombination Effect Reduces proteolysis of expressed fusion proteins. Blocks restriction of DNA methylated at the sequence 5..GmCGC.,3. Blocks restriction of DNA methylated at the sequence 5..AGm CT. .3. Reduces proteolysis of expressed fusion protein. phages containing the red and gam genes of are growth inhibited by P2 lysogens . Prevents recombination of introduced DNA with host DNA, ensuring stability of inserts. Inserts are more stable in recAl than recAl3 hosts.

mcrB

ompT

P2 recA1, recAl3

Caractersticas do hospedeiro do fago M13

GENOMA: (lac-proAB)[F traD36, proAB, lacIqlacZM15] (lac-proAB) Deleo cromossmica de um segmento de DNA que inclui o opero lac e os genes vizinhos que codificam enzimas envolvidas na biossntese da prolina. proAB Genes proAB existentes no epissoma F, podendo complementar a auxotrofia para a prolina do hospedeiro (lac-proAB). A manuteno de F no hospedeiro tem que ser garantida isolando a estirpe em MM/Glu. lacZM15 Deleo parcial no gene lacZ, correspondente aos aa 11-41 da -galactosidase. Permite a -complementao. traD36 Mutao no factor de transferncia que evita a transferncia do epissoma F (por conjugaco).

Mtodos de introduo de DNA no hospedeiro (1)

Transformao bacteriana Transfeco Electroporao Microinjeco Bombardeamento com microprojcteis Infeco viral

Mtodos de introduo de DNA no hospedeiro (2)

Mtodos de seleco de clones recombinantes (1)

Seleco indirecta
Inactivao de genes de resistncia a antibiticos

Seleco directa
Gene lacZ
Seleco pela cor - -complementao

Fentipo Spi-

Mtodos de seleco de clones recombinantes (2)

A insero de DNA em pBR322 detectada por inactivao de um gene de resistncia a um antibitico (tetR), indicada pelo fentipo sensvel TetS. Em pUC18 ocorre inactivao da galactosidase (lacZ), resultando na incapacidade de converter o substrato artificial X-Gal num corante azul.

Mtodos de identificao de clones recombinantes

Anlise do padro de restrio Sequenciao de DNA Hibridao de cidos nucleicos Complementao gnica de estirpes mutantes PCR Anlise de produtos gnicos (reconhecimento imunolgico)

Identificao do clone recombinante relevante

Anlise do padro de restrio

Identificao de clones com fragmentos de DNA inseridos em orientaes opostas.

Identificao de clones recombinantes por hibridao de colnias

Identificao de clones recombinantes por hibridao de placas fgicas

Hibridao Southern

Construo de sondas degeneradas

Uma curta sequncia de aminocidos da protena relevante utilizada para construir um conjunto de sondas oligonucleotdicas que servem para identificar o gene que codifica a protena. Uma das sondas do conjunto de sondas degeneradas ter um emparelhamento perfeito com o gene.
Figure 12-11. From H. Lodish, D. Baltimore, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, and J. Darnell, Molecular Cell Biology, 3d ed. Copyright 1995 by Scientific American Books, Inc..

Triagem de bibliotecas YAC por PCR

Identificao de clones recombinantes com anticorpos

Figure 12-12. Recombinant DNA, 2d ed. Copyright 1992

Estratgias de clonagem

Bibliotecas genmicas
Chromosome walking

Bibliotecas de cDNA

Preparao de uma biblioteca de DNA genmico

A digesto enzimtica parcial do DNA dador origina fragmentos sobreponveis, isto , com sequncias de DNA comuns.

Chromosome walking (1)

Esta tcnica utilizada para isolar fragmentos de DNA sobreponveis partindo de um fragmento de DNA previamente clonado que mapeia prximo do gene de interesse (representado a vermelho), permitindo identificar o clone que contm o gene.
Figure 12-15. From J. D. Watson et al., 1992, Recombinant DNA, 2d ed., W. H. Freeman and Company, p. 128.

Chromosome walking (2)

Neste exemplo, os fragmentos de DNA cromossmico esto clonados no fago . O clone inicial da biblioteca genmica, representado a verde, utilizado como sonda na triagem de sequncias sobreponveis presentes noutros clones da biblioteca. O walk conduzido em ambas as direces, dado que em geral no se sabe a que distncia o gene de interesse est do clone inicial, ou se est para a esquerda ou para a direita. Para simplificar est representado um walk unidireccional. Os clones isolados no walk so utilizados como sondas em hibridaes Southern com DNA genmico de mutantes. Esta anlise permite detectar delees cromossmicas e rearranjos no DNA, mas normalmente no detecta mutaes pontuais, a no ser que alterem as sequncias reconhecidas pelas enzimas de restrio utilizadas na anlise. Deste modo, o clone de DNA contendo a regio correspondente ao gene de interesse identificado. Normalmente, um walk envolve mais do que as trs etapas representadas na figura. Nalguns casos, parte do gene pretendido pode j estar clonado, sendo o walking de DNA necessrio para isolar o gene completo. Iniciar walks em paralelo a partir de vrios clones diferentes (estes walks sero eventualmente ligados), acelera o processo de isolamento de clones sobreponveis em longas extenses contguas de DNA.

Isolamento de mRNA (1)

Isolamento de mRNA (2)

A cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT utilizada no isolamento de mRNA eucaritico. O RNA citoplsmico constitudo fundamentalmente por RNAs ribossmicos (rRNAs) e RNAs de transferncia (tRNAs). Os RNAs mensageiros (mRNAs), so muito menos abundantes, mas tm caudas poli-A que hibridam com oligo-dTs covalentemente ligados matriz da coluna. Aps hibridao, os rRNAs e tRNAs so removidos da coluna por lavagem, sendo os mRNAs depois eludos com um tampo de baixa concentrao salina. A preparao de mRNA purificado resultante contm muitas molculas de mRNA diferentes que codificam diferentes protenas.

Preparao de cDNA (1)

Para se obter uma representao mais normal das sequncias, em vez do primer oligo(dT), so utilizadas misturas de primers oligonucleotdicos aleatrios.

Preparao de cDNA (2)

Preparao de uma biblioteca de cDNA num vector (1)

Preparao de uma biblioteca de cDNA num vector (2)

Uma mistura de mRNAs utilizada para produzir cDNAs correspondentes a todos os mRNAs celulares (etapas 1 a 3). Os cDNAs de cadeia simples (verde claro) so depois convertidos em cDNAs de cadeia dupla, que so tratados com metilase EcoRI para impedir posterior digesto com EcoRI (etapas 4 a 6). Os cDNAs de cadeia dupla previamente protegidos so ligados a linkers EcoRI de cadeia dupla sintticos, em ambas as extremidades, e depois clivados com a enzima de restrio correspondente, produzindo cDNAs com extremidades coesivas (letras vermelhas). Os cDNAs com extremidades coesivas so inseridos em vectores de clonagem, e os viries recombinantes resultantes so utilizados para infectar E. coli que depois plaqueada em meio slido nutritivo (etapas 7 a 9).

Obteno de clones genmicos e de cDNA por PCR e RT-PCR (1)

Obteno de clones genmicos e de cDNA por PCR e RT-PCR (2)

(A) Os clones genmicos podem ser obtidos por PCR a partir de DNA cromossmico extrado das clulas. So adicionados primers que ladeiam a regio de DNA que se pretende clonar, sendo amplificado apenas o DNA entre os primers (incluindo os primers). Esta tcnica permite obter selectivamente uma curta extenso de DNA cromossmico. (B) Os clones de cDNA podem ser obtidos por RT-PCR a partir de mRNA extrado das clulas, e purificado por cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT. O primeiro primer (oligo-dT) depois adicionado populao de mRNAs, sendo utilizada a transcritase reversa para produzir a cadeia de cDNA complementar. Aps adio do segundo primer, a molcula de DNA de cadeia simples amplificada atravs de muitos ciclos de PCR, originando cDNA de cadeia dupla. Em ambos os tipos de clonagem, a sequncia de nucletidos de pelo menos parte da regio que se pretende clonar deve ser previamente conhecida.

Diferenas entre clones de DNA genmico e clones de cDNA (1)