Normas generales de uso del laboratorio

Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad. 1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. 2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. 3. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. 4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. 5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. 6. No tacar con las manos y menos con la boca los productos qumicos. 7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. 8. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. 9. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared. 10. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: cido sobre agua. 11. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. 12. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro. 13. Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada de lquido. 14. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. 15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras.

El tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullicin rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. 16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de haberlos calentado con el fin de evitar roturas. 17. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen. Prctica en formato Word 2003: instrucciones.zip (25Kb)

Preparacin de un frotis bacteriano Tincin Gram

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano Pinzas

Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina

REALIZACIN
1. 2. 3. 4. 5. 6. Preparar los frotis bacterianos. Teir con cristal violeta 1min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

8. 9. 10. 11.

Teir con safranina 1min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.

Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho ms caro Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber.

REALIZACIN DEL FROTIS 1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse. FIJACIN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS 4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.

5. Con metanol (para bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tincin. TINCIN DEL FROTIS BACTERIANO 6. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tie slo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se producira la destruccin de las clulas. 7. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 8. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningn caso se debe frotar el porta. 9. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersin. MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIN La tcnica siguiente es de aplicacin para cualquier preparacin microscpica que se desee montar de forma definitiva. Se anotar en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparacin, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno. 10. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones mantenindolos un mnimo de 5 minutos en cada bao. La serie de alcoholes puede modificarse en funcin de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparacin quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente bao. a. Alcohol de 70 b. Alcohol de 95 c. Acetona pura d. Acetona-xilol (1:1) e. Xilol 11. Montar la preparacin. Emplear blsamo de Canad, euparal o algn medio de

montaje sinttico. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.

Observacin de bacterias
OBJETIVOS 1. Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales. 2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se recomienda una u otra. 3. Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen. 4. Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersin. MATERIAL

Mechero Bunsen o de alcohol Asa de siembra o aguja enmangada Pinzas Portaobjetos Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc.

Colorantes para tincin: a) Solucin de cristal violeta al 1% b) Solucin de safranina al 0,5% c) Azul de metileno al 1% Microscopio y aceite de inmersin

BACTERIAS DEL YOGUR El yogur es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociacin de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Adems, el tamao del lactobacilo (unos 30m de longitud) facilita la observacin aunque no se tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio. 1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota de agua. 2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa. 3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.

4. Observar al mximo aumento del microscopio. BACTERIAS DEL VINAGRE El vinagre es una solucin acuosa rica en cido actico resultante de la fermentacin espontnea del vino o de bebidas alcohlicas de baja graduacin. La acetificacin del vino es producida por bacterias aerbicas del cido actico, principalmente Acetobacter aceti, aunque tambin Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares. 1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin de madre de vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado. 2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis. 3. Dejar secar y fijar con calor. 4. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. BACTERIAS DEL SARRO DENTAL El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Est constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metablicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparacin, pero suelen abundar bacterias saprfitas, pudindose observar gran variedad de morfologas: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos. 1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos. 2. Dejar secar y fijar con calor. 3. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. BACTERIAS DEL SUELO La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prcticamente infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso, desconocidas para los microbilogos. Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardn. Despus de varios das, las bacterias se habrn adherido al vidrio y slo habr que fijarlas por calor y teirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, as como la parte que no se va a teir.

Tincin cido-alcohol resistente

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano Pinzas

Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro azul de metileno fucsina-fenol mezcla de cido y alcohol

REALIZACIN 1. Prepara un frotis bacteriano. 2. Cubrir la preparacin con carbofucsina. 3. Calentar la preparacin en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se aade ms carbofuxina para que no se seque en ningn momento. 4. Lavar con agua el resto de colorante. 5. Decolorar con la mezcla cido-alcohol. 6. Lavar con agua para que no prosiga la decoloracin. 7. Teir con azul de metileno 1 min. 8. Lavar con agua el resto de colorante. 9. Secar la preparacin. 10. Examinar al microscopio.

Tincin de esporas

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano

Pinzas Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Verde Malaquita Safranina

REALIZACIN 1. Preparar los frotis bacterianos indicados. 2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min. Aadir ms colorante si la muestra se seca. 3. Lavar con agua el resto de colorante. 4. Teir con safranina 1 min. 5. Lavar con agua el resto de colorante. 6. Secar la preparacin. 7. Observar la preparacin al microscopio.