ANALES DE CIENCIAS. VOL. XLIV. NUMS. I - 4.

1985: 21-24 SECRETARIADO DE PUBLICACIONES - UNIVERSIDAD DE MURCIA

Estudio cintico de la fase de transicin del mecanismo de MichaeliS'Menten con inhibicin por exceso de sustrato
R. Varn Castellanos*, J. Tudela Serrano**, F. Garca Carmona**, F. Garca Cnovas** * Dpto. de Qumica Fsica. Facultad de Ciencias Qumicas y Matemticas ** Dpto. interfacultativo de Bioqumica Recibido: 22-3-85 Aceptado: 30-10-85

Kinetic study of the transient phase of the Michaelis-Menten mechanism with inhibition by substrate excess
Summary: The kinetic behaviour in the transient phase of a Michaelis-Menten mechanism with inhibition by substrate excess has been analyzed. Time dependent equalions for all species involved to mechanism are derived. Several procedures for rate constants evaluation are proposed. Key-words: Transient phase, Michaelis-Menten. Substrate inhibition.

INTRODUCCIN En la literatura cientfica, desde el ao 1965, se han descrito ms de 800 enzimas que sufren desviaciones de la cintica de Michaelis-Menten, basndose en estudios de estado estacionario '. Estos hechos han animado a distintos autores a intentar explicar los resultados experimentales bajo enfoques ms rigurosos que los utilizados previamente -. encontrando que a diferencia de la ecuacin clsica de Michaelis-Menten, que es de grado 1:1 con respecto al sustrato, podran darse grados tales como 1:2; 2:2; 2:3; 3:4; etc. Estos descubrimientos cuestionan fuertemente si debe aceptarse que las enzimas son en su mayora michaelianas, ya que si esto no es as. los parmetros clsicos tales como KM y Vma, perderan su significado fsico para tales enzimas. Es conocida la existencia de posibles causas que pueden dar lugar a desviaciones de la cintica de Michaelis-Menten *. Algunos ejemplos son: la enzima que contiene una

impureza que reacciona con el sustrato, o bien la enzima que existe en dos formas con diferentes actividades o en la que se producen agregaciones o micelas '. Algunas de las desviaciones cinticas encontradas podran deberse a tales hechos. No obstante, una vez suprimidos tales efectos donde es posible, ios hechos experimentales indican que son muchas las enzimas que dan cinticas anmalas, entre ellas se encuentran acetilcolinesterasa, fosfatasa acida, adenosn desaminasa, ariisulfatasa, bencilamina oxidasa. a-quimotripsina, fumarasa, p-galactosidasa, galactosa deshidrogenasa, peroxidasa y xantn oxidasa ~. Algunas posibles causas cinticas para explicar estas desviaciones podran ser: a) inhibicin por sustrato, b) activacin por sustrato, c) rutas al azar, d) efectos alostricos. El grupo ms numeroso de desviaciones de la cintica de Michelis-Menten corresponde a la inhibicin por sustrato (352 ejemplos). En la mayora de los casos en los que aparece este tipo de efecto, lo que se ha hecho es trabajar a bajas concentraciones de sustrato, de tal manera que se obtenga una ecuacin de velocidad 1:1 con respecto al

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sustrato y as poder definir KM y V. No obstante, se han utilizado en algunos trabajos ^ concentraciones elevadas de sustrato de tal manera que se obtiene la ecuacin de velocidad real para el mecanismo bajo estudio; la regresin no lineal permite calcular los parmetros globales que aparecen bajo estas condiciones en la ecuacin de velocidad. Sin embargo, el clculo de las constantes de velocidad implicadas en el mecanismo no puede llevarse a cabo con datos nicamente de estado estacionario. La posibilidad del uso de tcnicas rpidas permite obtener informacin sobre la fase de transicin del sistema y la elucidacin completa del mecanismo puede llevarse a cabo mediante la utilizacin conjunta de ambas tcnicas ". Bajo este enfoque abordamos el estudio cintico del mecanismo ms simple de inhibicin por sustrato: mecanismo de Michaelis-Menten con inhibicin por sustrato o bien mecanismo Uni-Uni con inhibicin por sustrato.

y, = concentracin de la especie Y, (s = 1,2) y" = concentracin inicial de la especie ligando Ys (s = 1,2) y,= dZ. dt (s = l,2)

y si las condiciones iniciales s o n ' : x[' = O, i ^ I (1) (2) (3)

yr
y

o, i ' 1

el sistema de ecuaciones que describe la dependencia de la concentracin de las especies enzimticas con el tiempo viene dado por la ecuacin matricial:
k,, k,,
22

TEORlA
O
^ 2

El mecanismo antes citado viene definido por el esquema k, [A] E . EA k^ E-hP

12

(4)

k,,

El determinante secular de la matriz K es: k, [AJ k,,-/.

k-3 k2, k22-^

0
k.,2

D() = EA, cuyo grafo dirigido se muestra en la figura I. Con la notacin: Xj = especie enzimtica i-sima, de modo que E HX, EA H X J EA^ = X , Xi = concentracin de la especie enzimtica X, x" = concentracin inicial de la especie Xj Aio= dt Y^ = especie ligando s-sima, de modo que A HY, P HY,
x =

k,2

(5)

k..

k-X

donde los valores de K^j vienen dados en el apndice. La ecuacin (4) puede resolverse en la forma descrita en la referencia (5) y as se obtiene:. x = Ao + Aihe^-' siendo (-1)'"' 1 ^
z^, K^

( i = l , 2 , 3)

(6)

( i = l , 2 , 3)

(7)

A, = (-1)' ^ ^ J i i M ^

(i = l , 2 , 3;p9^h)

(8)

En la ec. (7) (a|) es el trmino independiente en el desarrollo del polinomio D|i(X), es decir D|(0), y los valores de '\ (h = l,2) son las races de la ecuacin k^ + pX + Q = O donde FIGURA 1. Grafo dirigido. P = k - , + k^ + k - 3 + (k, + k , ) y ? (10) (9)

DIO CINTICO DE LA FASE DE TRANSICIN

23

Q = (k_, + k,)k_3 + k,k_3y? + k , k , y r y, a su vez,

^,^2 = Q

(11)

o(.

(12) (13)

X^ y Xj son siempre reales y negativas. Por otra parte, y^ depende de t segn

y^ = P + a t + S Y h C
n 1

Ki

(14) FIGURA 2. Representacin esquemtica de a vs. y','

donde k,k,k_3yW (k_,+k2)k-3+k,k_3y?+k,k,y (15)

DETERMINACIN DE LAS CONSTANTES (16) El mecanismo bajo estudio se ajusta, en las curvas de acumulacin de producto Y2 frente al tiempo, a la suma de dos exponenciales. La determinacin de las \ permitir determina!; todas las constantes implicadas en el sistema. Puesto que las A ^ son reales y negativas, el procedimiento a seguir sera': 1) Determinacin en el estado estacionario de a, p y x 2) Representacin, en la fase de transicin, de In (y2-P- a t) vs. t, lo que da, supuesto \k\ < \k2\ y a partir de cierto instante, tp, una recta de pendiente X, y ordenada en el origen In y,. 3) La determinacin de Xj puede hacerse de acuerdo con
A-, =

k|k;yyxy-Pa

Yi =

k,k,{k_3+^,)y?x?

(17)

k,k;(k-3+^2)y?xy
"2(^1 ~ ^ 2 )

(18)

Algunos ejemplos tpicos de la variacin de a con respecto a y, y de y^ con respecto a t se muestran en las figs. 2 y 3, respectivamente. El perodo de induccin tiene el valor I
T =

Yi

X,,Y,+a

(20)

^
+

P Q

(19)

k-3

expresin deducida teniendo en cuenta las ees. (12),

(c)
FIGURA3. Representacin esquemtica de los perfiles concentracin del producto-tiempo. Los casos representados en (a), (b) y (c) corresponden, respectivamente aun valor de t positivo, nulo o negativo. A su vez, T es positivo, nulo o negativo segn que k.sk-s-l-kjy?) sea, respectivamente, mayor, igual o menor que k.kjy.

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(13) y (15) - (17). La ec. (20) permite el clculo de X-, de una forma analtica sin necesidad de representar In (yj - P - a t - Y , e*"') vs. t para O < t < tp. Con los valores de A, y ^ , podemos calcular todas las k (i = l, 2, 3, - I , -3), puesto que >., + X, segn la ec. (13) es lineal respecto de y". A partir de la pendiente y ordenada en el origen tenemos dos ecuaciones y aplicando regresin no lineal a k, Xj (ec. (12)) obtenemos tres ecuaciones adicionales. Otra posibilidad sera el ajuste por regresin no lineal a la ec. (19), con lo que se obtendran cinco ecuaciones. Adems se cumplen las siguientes relaciones:
lim T y? - = 0 " lim X =

(21)

1
k_,+k2

complejos sera conveniente utilizar la expresin de T para el clculo de k mediante regresin no lineal. Desde el punto de vista experimental la determinacin de A ^ (h = 1,2) o T tienen el condicionamiento de necesitar medidas en fase de transicin (normalmente en una escala de tiempo de milisegundos), lo cual exige la utilizacin de tcnicas rpidas'. Otro requisito experimental viene impuesto por la necesidad de medir pequeos niveles de productos de reaccin, lo que obliga a usar sustratos con caractersticas apropiadas (alto coeficiente de extincin, alta solubilidad, etc.), y elevadas concentraciones de enzima'. A partir de lo expuesto anteriormente, en el caso de mecanismos 1:2, desaparece el sentido fsico de KM y V^^ y la descripcin de la reaccin catalizada por la enzima sera conveniente hacerla, en los casos donde sea posible, por los valores de las kBIBLIOGRAFA

(22)

lim

xV

k,

(23)-

las cuales nos permiten otras aproximaciones al conocimiento de los valores de las k,.

RKSULTADOS Y DISCUSIN Los resultados experimentales de velocidad en estado estacionario frente a la concentracin de sustrato indican que un gran nmero de enzimas se desvan del comportamiento michaeliano. Los estudios en estado estacionario detectan estas desviaciones a partir de grficas a vs. y',' o 1/a vs. 1/y". Se han establecido criterios para poder dilucidar a qu grado con respecto al sustrato est correspondiendo la velocidad. Sin embargo, puesto que segn la ec. (15) los factores que multiplican a la concentracin de sustrato son expresiones algebraicas de las k^, la determinacin de sus valores nos permite conocer cul va a ser la influencia de cada trmino en la ecuacin y saber a qu etapa se debe en concreto el que ese trmino sea significativo o no. En el caso sencillo de un mecanismo 1:2 queda claro cmo a partir de la determinacin de las X^ (h = 1,2) puede obtenerse esta informacin. En mecanismos ms

1 HILL, M. C , WAIGHT, D. R. y BARDSLEY, G. W. Molecular Biochemistry 15, 173 (1977). 2 BARDSLEY, G. W., LEFF, P., KAVANAGH, J. y WAIGHT, D. R. Biochem. J. 187. 739 (1980). 3 LAIDLER, K. J. y BUNTING. P. S. The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Clarendon Press. Oxford (1973). 4 GLVEZ, J., VARN. R.. GARCA CNOVAS, F. y GARCA CARMONA. F. J. Theor. Biol. 94. 413 (1982). 5 GLVEZ, J. y VARN. R.. J. Theor. Biol. 98. 1 (1981). 6 GLVEZ. J.. VARN. R., GARCA CNOVAS. F. y GARCA CARMONA. F. An. Qum. 79. 5 (1983). 7 HIROMl, K.. Kinetics of Fasl Enzyme Reactions, John Wiley & Sons. New York (1979).

APNDICE Valores de las Kjj de la ec. (4);

K11 = K12

K = k,y
K22 = - ( K , , + K 2 j ) K21 = K'j I + K'21 K'2, = k _ ,

K ' i , =k2

K:, = k.y';
Kj3 - Kj2 Kj2 = k _ j