CONTENIDO

1.

CONCEPTO Y DESARROLLO HISTRICO DE LA CROMATOGRAFA. ....................................................... 3

DESARROLLO HISTRICO. ...................................................................................................................................... 3

2.

CONCEPTO DE FASE ESTACIONARIA Y MVIL. ..................................................................................... 6

3.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS. .................................................................... 6

CROMATOGRAFA DE GASES. ................................................................................................................................. 8

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS. ........................................................................................................................... 11

4.

MTODOS CROMATOGRFICOS EN BASE AL FENMENO DE SEPARACIN. ...................................... 14

UNIDAD IV METODOS CROMATOGRFICOS

1. CONCEPTO Y DESARROLLO HISTRICO DE LA CROMATOGRAFA. Desarrollo histrico. La cromatografa es un poderoso mtodo de separacin que tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. La cromatografa en columna fue denominada as, a principios del siglo XX por el botnico ruso Mikhail Tswett. l emple la tcnica para separar varios pigmentos vegetales, tales como clorofilas y xantofilas, haciendo pasar disoluciones de estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecan como bandas coloreadas en la columna lo que justifica el nombre que eligi para el mtodo (del griego chroma que significa color y graphein que significa escribir). Las aplicaciones de la cromatografa han aumentado en gran manera en los ltimos cincuenta aos, debido, no slo al desarrollo de nuevos y diversos tipos de tcnicas cromatogrficas, sino tambin a las necesidades crecientes, por parte de los cientficos, de mejores mtodos para la caracterizacin de mezclas complejas. El tremendo impacto de esto en la ciencia se confirm al otorgarse el Premio Nobel de 1952 a A.J.P. Martin y R.L.M. Synge por sus descubrimientos en este campo. Ms impresionante es, quizs, la lista de doce Premios Nobel concedidos entre 1937 y 1972, los cuales se basaron en trabajos en los que la cromatografa tena un papel vital. Por este motivo, la cromatografa es un mtodo muy utilizado y que permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Ningn otro mtodo de separacin es tan potente y de aplicacin tan general como la cromatografa.
Concepto.

Es difcil definir rigurosamente el trmino cromatografa, ya que se ha aplicado ese nombre a varios sistemas o tcnicas. Sin embargo todos estos mtodos tienen en comn el uso de la fase estacionaria y una fase mvil, y las fases se basan en las diferencias de velocidad de migracin entre los distintos componentes de la mezcla. La cromatografa es una tcnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de las diferencias de velocidad a las que son transportados a travs de una fase fija o estacionaria por una fase mvil gaseosa o lquida.

Cromatograma y su interpretacin.

Un cromatograma es un grafico que representa la respuesta del detector en funcin del tiempo. Muestra lo que podr observarse cuando una mezcla y un componente desconocido se separan por cromatografa de gases. Los siguientes trminos son los utilizados en un cromatograma tpico y recomendados por la IUPAC: Line Base Pico Cromatogrfico Base del Pico rea del Pico Altura del Pico Ancho del Pico Ancho del Pico a la mitad de la Altura

Cromatograma

Altura del Pico. Medida que se efecta, para cada pico de inters, desde la lnea base hasta el mximo del pico. Los errores de malas mediciones se pueden atribuir a: Insuficiente Resolucin. Variaciones en la lnea base. Picos extremadamente pequeos.

Las desviaciones en la lnea base se pueden compensar por interpolacin de sta entre el principio y el final del pico. rea del Pico. Existen varias tcnicas para la determinacin del rea de un Pico Cromatogrfico Integracin Manual Mtodos Geomtricos Triangulacin. En esta tcnica se trazan lneas tangentes a cada lado del pico. La altura se mide desde la lnea base hasta la interseccin de las dos tangentes. El ancho se mide tomando la interseccin de las dos lneas tangentes con la lnea base. Luego se utiliza la frmula A=1/2*Altura del Pico* Base del Pico. Las limitaciones de esta tcnica estn en el trazado de las lneas tangentes, un pequeo error al trazar las tangentes puede afectar la medida de la altura. Altura por ancho a la mitad de la Altura. Mtodos Mecnicos Planimtricos Corte y Pesada: Esta tcnica requiere recortar el pico del cromatograma, luego pesarlo en una balanza analtica. El recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operador. Pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, la grasa de las manos del operador, homogeneidad del papel. Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el original.

 Integracin Automtica Electromecnica Electrnica 2. CONCEPTO DE FASE ESTACIONARIA Y MVIL. Una fase fija o estacionaria se refiere a que esta se encuentra posicionada en un lugar, ya sea una columna o en una superficie plana, mientras que la fase mvil se mueve sobre la fase estacionaria (ya que es inmiscible con esta) o a travs de ella arrastrando consigo la mezcla de analitos. Esta fase puede ser un gas, un lquido o un fluido supercrtico. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueve lentamente con el flujo de la fase mvil: por el contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente (fig.1).

Fig. 1. Se observa la fase mvil y la estacionaria.

3. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS. Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se basa en la forma en que la base estacionaria y mvil se ponen en contacto. Cromatografa en columna. Consiste en columnas huecas de longitud y dimetro variable en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase mvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicacin de presin.

Cromatografa plana. La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel y la fase mvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad. Esta a su vez se divide en :

Cromatografa en papel. En la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografa de particin). Cromatografa en capa fina. En la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografa de particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio. Una clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatogrficos se basa en el tipo de fase mvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases. Estos son: Cromatografa de gases. Gas liquido. Gas solido. Cromatografa de lquidos. Liquido-liquido. Liquido- slido. Intercambio inico. Exclusin molecular. Cromatografa de fluidos supercrticos. Cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presin y temperatura superiores a su punto crtico.

La siguiente tabla establece una relacin de las tres clases generales de cromatografa.

Tabla. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos en columna.

Es digno de mencionarse que solamente la cromatografa de lquidos puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografa de gases como de fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna, de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase mvil. Cromatografa de gases. La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica que se emplea para separar compuestos orgnicos voltiles, siendo el mtodo ms rpido y sencillo para la identificacin de los constituyentes de una mezcla. Implica el uso de una columna cromatogrfica especial en cuyo inicio se inyecta la muestra vaporizada que se transporta a lo largo de la columna impulsada por una fase mvil gaseosa inerte. Los componentes de

Representacin esquemtica de un cromatgrafo de gases

dicha muestra se separan debido a las diferencias en su perfil de particin entre la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria. Tipos de cromatografa de gases. Dependiendo del estado de la fase estacionaria, podemos distinguir:

Cromatografa gas-liquido. La fase estacionaria es un lquido no voltil inmovilizado sobre la superficie de un soporte slido inerte. La velocidad de migracin de un analito est determinada por su distribucin entre la fase liquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del analito y su solubilidad en la fase en la fase estacionaria son los factores que regulan su retencin. Cromatografa gas slido. Se basa en la adsorcin de sustancias gaseosas sobre superficies slidas. Los coeficientes de distribucin son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografa gas lquido. Debido a esto, la cromatografa gas slido es til para la separacin de especies que no se retienen en la anterior, tales como los componentes del aire, Sulfuro de hidrgeno, Disulfuro de carbono, xidos de Nitrgeno, Monxido de Carbono, Dixido de carbono y gases nobles.

Equipamiento Todos los elementos necesarios para realizar la cromatografa de gases estn integrados en un dispositivo llamado cromatgrafo de gases, que consta de: Suministrador de fase mvil gaseosa. El gas portador se mezclar con la muestra vaporizada impulsndola por el interior de la columna cromatogrfica. Los gases ms empleados son: nitrgeno, helio, argn y dixido de carbono. Puerto de inyeccin. Inyector. Dispositivo que permite la introduccin de la muestra vaporizada en la corriente de gas portador. El mtodo ms comn de inyeccin implica el uso de una microjeringilla que inyecta la muestra lquida o gaseosa a travs de un septo de goma de silicona en una cmara de vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna. Al inyectar con microjeringillas el sistema debe asegurar, que la muestra se vaporice en la cabeza de la columna sin distorsin del gas portador y que la muestra ocupe la mnima longitud posible de la columna. Esta cmara normalmente est a unos 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra para asegurar la vaporizacin total de la muestra. Columna cromatogrfica. Tanto el material de construccin de las columnas cromatogrficas como su longitud varan, pudiendo ser de acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln y abarcando una altura de 2-60 m. A la hora de seleccionar el tipo de columna se deben tener en cuenta varios parmetros como son el dimetro interno de la columna, el espesor de la fase estacionaria, el tipo de muestra, el tipo de fase estacionaria y la longitud de la columna. La

temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido.

Horno. Dispositivo de regulacin de la temperatura en cuyo interior se dispone la columna. La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido. Detector. Dispositivo situado a la salida de la columna que permite medir de una manera contina una propiedad fsica del gas portador, que se modifica ampliamente con la presencia de muy pequeas concentraciones de la sustancia a analizar. Su funcin bsica es producir respuestas muy rpidas a pequeas concentraciones de soluto.

Caractersticas ideales de un detector en cromatografa de gases son: 1. Sensibilidad adecuada. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 108 a 1015 g de analito/s. 2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios rdenes de magnitud. 3. Buena estabilidad y reproducibilidad. 4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 C. 5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal. 6. Alta fiabilidad y fcil manejo. 7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o ms clases de analitos. 8. No ser destructivo de la muestra. Los ms comunes en CG comercial son: Detectores de conductividad trmica (TCD). Es totalmente universal y muy sencillo, aunque no es muy sensible. Se emplea bsicamente en el anlisis de gases. Su baja sensibilidad impide usarlo con columnas capilares. Los gases que salen de la columna entran en un compartimiento en el que se encuentra un filamento caliente, cuya temperatura depende de la capacidad del gas que le rodea en disipar calor, esto es, su conductividad trmica. En el momento en que se eluye de la columna un compuesto con diferente conductividad trmica un compuesto con diferente conductividad trmica que el gas portador, la temperatura del filamento vara, y por tanto su resistencia elctrica, que es registrado en forma de aumento o disminucin de la corriente.

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Detectores de ionizacin de llama (FID). Es el ms usado, debido a que es

prcticamente universal para los compuestos orgnicos, donde es bastante sensible y tiene un comportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en una llama formada por H2 y aire cuya conductividad elctrica est

permanentemente registrada. En el momento es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se quema y durante la reaccin de combustin se generan electrones y otras especies cargadas que alteran la conductividad elctrica de la llama. Detector de nitrgeno-fsforo. Consiste bsicamente en un detector de ionizacin de llama que porta un alambre de platino recubierto de NaOH o silicato de rubidio, los ms modernos, que incrementa la volatilidad de compuestos que contienen nitrgeno, fsforo, halgenos, sulfuro, arsnico, estao y plomo, produciendo un incremento en la corriente de ionizacin y con ello un aumento de respuesta de los componentes de la muestra que contienen esos elementos.

Aplicaciones en la cromatografa de gases. La cromatografa de gases se puede aplicar a gases y a cualquier compuesto que pueda ser volatilizado o convertido en un derivado voltil. Se utiliza ampliamente en el anlisis de distintos tipos de muestras en laboratorios: Medioambientales: para el anlisis de de los numerosos contaminantes orgnicos del aire, el agua corriente y las aguas residuales. Clnicos, farmacuticos, bioqumicos y forenses: para analizar frmacos. Alimentarios: para analizar muchos sabores y especias. Petroqumicos: para el anlisis de los derivados del petrleo tales como gasolina, gasoil y aceites.

Cromatografa de lquidos. Dentro de los tipos de cromatografa que se han desarrollado, y englobada dentro de las cromatografas cuya fase mvil est constituida por un lquido, destaca la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC, High Perfomance Liquid Chromatography), tambin denominada de Alta presin. Esta tcnica de separacin y anlisis consiste en hacer pasar una muestra lquida o slida disuelta en un disolvente adecuado junto con una fase lquida mvil por una columna cromatogrfica. Esa columna se caracteriza por encontrarse muy empaquetada, por lo que es necesario ejercer elevadas presiones para que el proceso no se alargue excesivamente en el tiempo.

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La separacin de los componentes de la mezcla se efecta gracias a interacciones de stos con la fase mvil y estacionaria. Dependiendo del tipo de columna y de la interaccin de los solutos con la fase estacionaria podemos distinguir:

Cromatografa de adsorcin lquido-slido. Cromatografa de reparto lquido-lquido. Cromatografa de intercambio inico. Cromatografa de exclusin molecular.

Equipamiento. El disolvente elegido ha de ser compatible con la muestra a analizar y ofrecer unas buenas caractersticas de separacin, para ello pueden utilizarse eluciones isocrticas, un solo disolvente o una mezcla fija de ellos, o variar su composicin a lo largo del proceso en las llamadas eluciones con gradiente. En ambos casos se necesitan depsitos adecuados para albergar los disolventes. Generalmente, estos reservorios se encuentran asociados a una serie filtros y mecanismos de eliminacin de gases que excluyen posibles partculas y gases que pueden afectar al proceso cromatogrfico obstruyendo la columna y/o alterando los registros. Estos reservorios van a parar a una cmara de mezcla de disolventes y un sistema de bombeo capaz de generar elevadas presiones. Esta bomba se caracteriza por trabajar con amplios rangos de flujo, proporcionar una velocidad de flujo adecuada y reproducible, amortiguar los pulsos de presin y ser resistentes a la corrosin y qumicamente inertes. El sistema de bombeo ms utilizado es el de pistn recproco o vaivn, que consiste en una pequea cmara cilndrica que se llena del disolvente y se vaca por oscilacin de un pistn. La asociacin de una nueva bomba de pistn que opera desfasada con la primera evita en gran medida las pulsaciones. An as, muchos de los equipos llevan asociados atenuadores de pulsos. Los disolventes impulsados por la bomba han de ser introducidos a la columna cromatogrfica gracias a un sistema de inyeccin. Anticipando a sta, encontramos la llamada precoluma o guardacolumna, columna de menor longitud pero con las mismas caractersticas que la columna (mismo material empaquetado y misma fase estacionaria) que tiene como objetivo protegerla de la contaminacin y alargar su vida media. Las columnas suelen estar fabricadas en acero inoxidable. Poseen una longitud de 3-30 cm, un dimetro interno de 10 mm y partculas empaquetadas de 5-10m lo que les confieren un nmero de platos de 40.000-60.000 por metro. Estas columnas pueden

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adoptar tamaos menores, junto con su material empaquetado, en las llamadas microcolumnas, de mayor eficiencia. La fase estacionaria en HPLC presente en la columna se ha caracterizar por ser estable y resistente a altas presiones. Generalmente estos rellenos suelen ser inorgnicos como partculas de slice, almina (xido de aluminio, Al2O3) o vidrio. En el caso de cromatografa lquido-lquido la fase estacionaria es una pelcula lquida que reviste el material empaquetado. En la salida de la columna podemos encontrar un dispositivo de deteccin que nos identificar los solutos presentes en la fase mvil. Han de ser sensibles a pequeas variaciones, deben tener un mnimo ruido y deriva, rpida respuesta en un amplio rango lineal y ser insensibles a cambios de flujo y temperatura. Dependiendo de la naturaleza de la muestra el dispositivo de deteccin elegido variar. Los detectores empleados comnmente son aquellos que miden la absorcin de radiacin UV/visible o bien los detectores electroqumicos (amperomtrico, conductimtrico o potenciomtrico). Otros detectores usados pueden ser aquellos que registran el ndice de refraccin o fluorescencia pero encuentran mayores problemas ya que pueden ser menos precisos y el soluto analizado puede no presentar las caractersticas ms adecuadas para su deteccin.

Representacin esquemtica de un cromatgrafo de lquidos.

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Actualmente, el ms utilizado es el espectrmetro de masas que presenta unos lmites de deteccin buenos y nos proporciona informacin tanto cuantitativa como cualitativa que permite identificar fcilmente al analito. El principal problema que encuentra el acoplamiento de la espectrometra de masas a la cromatografa lquida es la incompatibilidad de la fase mvil lquida con las condiciones de alto vaco de espectrmetro, que no permite recibir los grandes volmenes de disolvente que acompaan al analito. El uso de columnas de menor dimetro y menor caudal, junto a los ltimos avances en espectrometra de masas, han permitido generalizar el uso de este tipo de detectores. 4. MTODOS CROMATOGRFICOS EN BASE AL FENMENO DE SEPARACIN. Estas son a partir del mecanismo de interaccin del soluto con la fase estacionaria. Cromatografa de adsorcin. Es aquella que presenta como fase estacionaria un adsorbente slido, ya sea slice o almina, donde el analito compite con la fase mvil por los sitios de la superficie y su retencin se debe a las fuerzas de adsorcin. La nica variable que altera el coeficiente de particin de los analitos es la composicin de la fase mvil. Este tipo de cromatografa se usa para separa compuestos orgnicos insolubles y relativamente no polares con pesos moleculares de menor de 5000 D. No ofrece ninguna ventaja especial sobre la cromatografa lquido-lquido a excepcin del anlisis de ismeros. Se usa para separar esteroides, diversos frmacos, aceites naturales, pigmentos vegetales, vitaminas hidrosolubles, etc. Cromatografa de intercambio inico. Consiste en hacer pasar una fase mvil liquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos inicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedaran retenidos por fuerzas electroestticas. Cromatografa de exclusin molecular. La separacin de los solutos en esta tcnica se basa en la capacidad del analito de penetrar en los poros de la matriz de la columna, de modo que si la molcula es de un tamao mayor al poro no experimentan retencin y viajan a la velocidad de la fase mvil, mientras que las que sean menores al lmite de inclusin de la columna entrarn en la matriz y su tiempo de retencin ser mayor. El material utilizado para esos empaques son partculas de slice o una red de polmeros que generen poros uniformes de tamaos que van desde 50-4.000 y 50-1.000.000 , respectivamente. Cromatografa de afinidad. Emplea interacciones especficas entre una clase de molculas de soluto y una segunda molcula unida covalentemente a la fase estacionaria.

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Cromatografa de reparto o particin. Esta tcnica se basa en el reparto de los solutos o analitos sobre fases mvil y estacionaria lquidas, inmiscibles entre s. La separacin selectiva de stos se debe al diferente grado de solubilidad en las diferentes fases. El equilibrio de reparticin entre ambas viene expresado en trminos de una constante llamada coeficiente de reparto (K), cuyo valor depende de, para una fase estacionaria fija, generalmente slice, y una fase mvil determinada, de la naturaleza del analito, lo que origina diferencias en la retencin. La temperatura ha de ser controlada durante el proceso ya que puede alterar la solubilidad del analito, y por tanto alterar el coeficiente de reparto. Cromatografa de exclusin (o de geles). El slido es un gel formado por polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su tamao.

Comparacin de HPLC y CG. Eficaz, muy selectivo y ampliamente aplicable Uso de muestras pequeas Mtodo no destructivo Adaptacin al anlisis cuantitativo

Ventajas de la tcnica HPLC. Separacin de muestras no voltiles y trmicamente inestables Aplicacin a iones inorgnicos.

Ventajas de la tcnica CG. Rpida Alta resolucin Acoplamiento fcil con espectrometra de masas

Bibliografa. Skoog,West, Holler, Crounch. Principios de Anlisis Instrumental. 5 edicin. Mc-GrawHill. 2001. Mxico. Pag. 741-742, 762, 789, 833.
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi//alim/TRABAJOS0809/trabajo4.pdf www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/.../r23185.DOC

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